利用对pH敏感的荧光蛋白——超 ecliptic pHluorin（SEP）标记膜蛋白的胞外结构域，可确定该蛋白的亚细胞定位、表达水平及转运过程。通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）对SEP标记的蛋白进行成像，能够定量分析蛋白在周边内质网和质膜中的表达水平。
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本文内容
摘要
摘要
要理解膜蛋白的运输、组装和表达，需要一种能够区分位于细胞内细胞器中的膜蛋白与定位于质膜上的膜蛋白的方法。传统的基于荧光的检测方法无法区分存在于不同细胞器中的膜蛋白。前沿技术通过将pH敏感型荧光团与全内反射荧光显微镜（TIRFM）相结合，超越了传统方法。TIRF照明仅激发玻璃-样品界面约150 nm范围内的样本，从而降低背景信号，提高信噪比，并增强分辨率。TIRFM的激发体积涵盖质膜及邻近细胞器，例如周边内质网（ER）。超激发pHluorin（SEP）是绿色荧光蛋白（GFP）的一种pH敏感型变体。将SEP基因编码至目标膜蛋白的胞外结构域，可使荧光团定位于内质网腔面以及细胞的胞外区域。当pH大于6时，SEP具有荧光；而在较低pH值下则处于非荧光的“关闭”状态。因此，标记了SEP的受体在位于内质网（ER）或插入质膜（PM）时会发出荧光，但在局限于运输囊泡或高尔基体等其他细胞器时则不发光。通过调节胞外pH，可控制质膜上受体的荧光状态。同一细胞在中性和酸性胞外pH条件下所获得的TIRF图像之间的荧光差异，对应于质膜上受体的相对数量。该方法可实现对胞内和质膜定位受体的同步测量。当胞外pH为中性时，还可检测单个囊泡的插入事件，这对应于低pH的运输囊泡与质膜融合并转变为荧光状态的过程。这一多功能技术可用于研究膜蛋白的定位、表达及运输过程。
引言
受体表达、分布和组装的变化与多种疾病相关，包括阿尔茨海默病、帕金森病、囊性纤维化以及药物成瘾1,2,3,4,5。例如，尼古丁及其他烟碱型配体可影响烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）的转运过程，从而导致其转运、表达和上调发生改变1,2,5,6,7,8,9,10。尼古丁可增加细胞内组装完成的nAChRs总数，促进其向细胞膜的转运，并改变亚基的组装方式，从而有利于形成某些亚型的高敏感性受体。在疾病模型中解析受体在转运、组装和表达方面的具体变化，可提供关键的机制性信息，这对于确定药物靶点至....
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方案
1. 细胞培养与转染
- 在生长培养基中培养小鼠神经母细胞瘤2a（N2a）细胞。
- 从200 ml高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、250 ml低血清培养基、50 ml胎牛血清（FBS）和5 ml青霉素/链霉素（100倍浓缩液）配制500 ml N2a生长培养基。
- 在37 °C、5% CO₂条件下，将细胞培养于T75培养瓶中2 培养箱
- 必要时以1:15比例传代细胞，或在细胞融合度达到约80-90%时进行。通常每周2-3次。
- 用多聚-D-赖氨酸包被35 mm玻璃底培养皿。
- 在超净工作台中，将 200 µl 浓度为 0.1 µg/ml 的多聚-D-赖氨酸加入无菌 35 mm 培养皿的玻璃底区域。
- 将培养皿置于37 °C培养箱中孵育1小时。
- 用 ddH₂O 轻轻冲洗培养皿2O 3-4 次。
- 让培养皿完全干燥超过1小时。
- 必要时，使用生物安全柜内的紫外灯对培养皿进行灭菌。
- 为全内反射荧光显微镜成像接种N2a细胞。
- 移除贴壁细胞的培养基。
- 在3....
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结果
将硒代半胱氨酸（SEP）掺入受体后，可在活细胞中直接检测该受体。结合全内反射荧光显微技术（TIRFM），可评估受体在质膜上的相对表达水平及其在全内反射激发区域内的亚细胞定位分布情况。此外，还可解析单个囊泡的运输事件。
质膜上SEP标记受体的相对表达水平
在激发光作用下，SEP的荧光强度受周围溶液pH值的调控。当SEP与定位于质膜的受体融合时，可通过改变胞外pH值来开启或关闭其荧光信号5,7,8,9,17。当胞外溶液p.......
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讨论
SEP 的 pH 敏感性使得位于质膜上的受体与内质网中的细胞内受体得以区分，并可用于解析携带受体的囊泡插入事件5,7,8,9,18,19,20。目前已有多种技术被广泛用于检测蛋白的表面表达水平，包括细胞表面生物素化和配体结合实验。在某些情况下，也可通过 Western 印迹法区分定位于内质网和质膜的蛋白。这种基于 SEP 的技术是对传统检测方法的补充，能够快速读取表面表达情况，并量化蛋白从内质网向质膜的定位转移。由于 SEP 可被遗传编码至目标蛋白中，因此避免了非特异性结合的问题，同时提高了检测灵敏度。SEP 在中性 pH 条件下可被 488 nm 激发，但在酸性条件（pH &.......
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本工作部分得到了美国国家药物滥用研究所 T32 DA 016176、美国国家药物滥用研究所 DA 038817 和美国国家药物滥用研究所 DA 040047 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂/材料 | |||
| 带滤膜盖的无菌细胞培养瓶，Greiner Bio One，75 cm²2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿，无菌 | 细胞 E&G | GBD00002-200 | |
| 聚-D-赖氨酸 | vwr | 215017510 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 （DMEM），高葡萄糖 | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| 胎牛血清，认证级，美国来源，标准型（无菌过滤） | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express 酶（1 倍浓度），无酚红 | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz L-15 培养基，无酚红 | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | 可选 |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | 轻柔混匀；切勿涡旋震荡 |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| 氯化钾 | Fisher Scientific | P217-10 | |
| 氯化镁 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| 氯化钙 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-葡萄糖 | Fisher Scientific | D16-1 | |
| 目标浸油 | Olympus | F型 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>仪器设备 | |||
| 显微镜 | Olympus | IX81 | |
| 相机 | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60倍，1.49 数值孔径油浸物镜 | 奥林巴斯 | APON 60XOTIRF | |
| 电动载物台 | 之前 | IXPROXY | |
| 电动执行器（步进电机） | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph（或其他成像软件） | Metamorph | ||
| 488 nm 激光器 | 市场技术 | ||
| 单模光纤 | Thorlabs | SM450 | |
| 镜子 | Thorlabs | BB1-E01 | |
| 二向色镜 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25x36 | |
| 带通滤光片，488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| 带通滤光片，525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
参考文献
- Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
- Henderson, B. J., Lester, H. A. Inside-o....
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重印与许可
