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利用pHluorin标记的受体监测亚细胞定位与转运

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DOI：

10.3791/55466

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2017年3月16日

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1Department of Chemistry, University of Kentucky, 2Department of Biomedical Sciences, Marshall University

通讯作者： Christopher I. Richards <chris.richards@uky.edu>

本文内容

摘要

利用对pH敏感的荧光蛋白——超 ecliptic pHluorin（SEP）标记膜蛋白的胞外结构域，可确定该蛋白的亚细胞定位、表达水平及转运过程。通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）对SEP标记的蛋白进行成像，能够定量分析蛋白在周边内质网和质膜中的表达水平。

摘要

要理解膜蛋白的运输、组装和表达，需要一种能够区分位于细胞内细胞器中的膜蛋白与定位于质膜上的膜蛋白的方法。传统的基于荧光的检测方法无法区分存在于不同细胞器中的膜蛋白。前沿技术通过将pH敏感型荧光团与全内反射荧光显微镜（TIRFM）相结合，超越了传统方法。TIRF照明仅激发玻璃-样品界面约150 nm范围内的样本，从而降低背景信号，提高信噪比，并增强分辨率。TIRFM的激发体积涵盖质膜及邻近细胞器，例如周边内质网（ER）。超激发pHluorin（SEP）是绿色荧光蛋白（GFP）的一种pH敏感型变体。将SEP基因编码至目标膜蛋白的胞外结构域，可使荧光团定位于内质网腔面以及细胞的胞外区域。当pH大于6时，SEP具有荧光；而在较低pH值下则处于非荧光的“关闭”状态。因此，标记了SEP的受体在位于内质网（ER）或插入质膜（PM）时会发出荧光，但在局限于运输囊泡或高尔基体等其他细胞器时则不发光。通过调节胞外pH，可控制质膜上受体的荧光状态。同一细胞在中性和酸性胞外pH条件下所获得的TIRF图像之间的荧光差异，对应于质膜上受体的相对数量。该方法可实现对胞内和质膜定位受体的同步测量。当胞外pH为中性时，还可检测单个囊泡的插入事件，这对应于低pH的运输囊泡与质膜融合并转变为荧光状态的过程。这一多功能技术可用于研究膜蛋白的定位、表达及运输过程。

引言

受体表达、分布和组装的变化与多种疾病相关，包括阿尔茨海默病、帕金森病、囊性纤维化以及药物成瘾1,2,3,4,5。例如，尼古丁及其他烟碱型配体可影响烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）的转运过程，从而导致其转运、表达和上调发生改变1,2,5,6,7,8,9,10。尼古丁可增加细胞内组装完成的nAChRs总数，促进其向细胞膜的转运，并改变亚基的组装方式，从而有利于形成某些亚型的高敏感性受体。在疾病模型中解析受体在转运、组装和表达方面的具体变化，可提供关键的机制性信息，这对于确定药物靶点至关重要。理想的方法应能快速区分细胞内受体与定位于细胞膜上的受体。当某种蛋白主要存在于细胞内时（如nAChRs），这一区分尤为困难。由于大多数nAChRs定位于内质网，传统检测方法缺乏足够的时空分辨率，无法精确定位分泌通路中受体的定位与转运变化。目前对nAChRs的受体转运与表达研究主要依赖放射性配体结合11、生物素标记实验12、蛋白质印迹（Western blotting）13或免疫沉淀技术12。这些方法依赖报告分子的结合特异性或细胞固定，无法同时区分定位于细胞膜与细胞内的受体。因此，离子通道组装与囊泡动态的研究在很大程度上仍依赖低通量的电生理技术14。

随着荧光显微技术的进步，可以获得更高的空间和时间分辨率。基因编码的报告分子（如绿色荧光蛋白（GFP）及其变体）能够消除非特异性结合问题，并提高检测灵敏度15。一种对pH敏感的GFP变体，称为超夹式pHluorin（SEP），可利用细胞内不同区室之间固有的pH差异来确定蛋白定位5,7,8,9,16,17,18。当pH高于6时，SEP发出荧光；而在较低pH条件下则处于关闭状态。因此，当位于内质网（ER）中或插入质膜（PM）时，其腔侧标记有SEP的受体会被检测到，但当其被限制在运输囊泡中时则无法检测。通过调控与质膜上受体接触的细胞外pH，可改变其荧光信号，从而影响这些受体的检测。若在同一细胞中依次于中性细胞外pH和低于6的pH条件下成像，则两幅图像之间的差异可归因于位于质膜上的受体。这种方法可同时测量细胞内（周边内质网）和质膜上的受体分布5,7,8,9。当细胞外pH为中性时，还可分辨单个囊泡的插入事件。一旦低pH的运输囊泡与质膜融合，囊泡的腔面暴露于中性细胞外溶液中，导致荧光突然增强，表现为荧光爆发信号7,18,19,20。SEP使得能够检测定位于质膜和周边内质网的受体，并提供了一种测量受体在这两个亚细胞区域之间转运的方法5,7,18。

为了在质膜上实现更高的分辨率，可通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）对带有基因编码SEP的受体进行成像。当大多数受体定位于细胞内区域时，该方法尤为适用，因为TIRFM可增强质膜的可见性。TIRFM还能够分辨携带SEP标记受体的单个囊泡在插入质膜（PM）过程中的运输动态。全内反射发生在具有不同折射率的材料界面处，例如细胞与玻璃盖玻片之间21,22。当以488 nm激发光照射时，SEP产生荧光，该激发光被定向以在玻璃与细胞溶液界面处实现全内反射。这会产生一种穿透样品约150 nm的隐逝波，仅激发该范围内的荧光基团。因此，仅检测到在此激发范围内、处于中性pH环境中的含SEP受体，这些受体对应于位于质膜或周边内质网上的受体。由于检测仅限于隐逝波的激发，来自细胞内区域的背景荧光被降低，信噪比得以提高21,22。此外，由于激发光不穿透细胞主体，光损伤被最小化，从而允许对活细胞进行长时间的成像观察。因此，结合基因编码SEP的TIRFM技术可提供所需的高分辨率和高灵敏度，用于测量膜受体在分泌途径中的亚细胞定位及运输动态。

方案

1. 细胞培养与转染

  1. 在生长培养基中培养小鼠神经母细胞瘤2a（N2a）细胞。
    1. 从200 ml高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、250 ml低血清培养基、50 ml胎牛血清（FBS）和5 ml青霉素/链霉素（100倍浓缩液）配制500 ml N2a生长培养基。
    2. 在37 °C、5% CO₂条件下，将细胞培养于T75培养瓶中2 培养箱
    3. 必要时以1:15比例传代细胞，或在细胞融合度达到约80-90%时进行。通常每周2-3次。
  2. 用多聚-D-赖氨酸包被35 mm玻璃底培养皿。
    1. 在超净工作台中，将 200 µl 浓度为 0.1 µg/ml 的多聚-D-赖氨酸加入无菌 35 mm 培养皿的玻璃底区域。
    2. 将培养皿置于37 °C培养箱中孵育1小时。
    3. 用 ddH₂O 轻轻冲洗培养皿2O 3-4 次。
    4. 让培养皿完全干燥超过1小时。
    5. 必要时，使用生物安全柜内的紫外灯对培养皿进行灭菌。
  3. 为全内反射荧光显微镜成像接种N2a细胞。
    1. 移除贴壁细胞的培养基。
    2. 在37 °C、5% CO₂条件下，用1 ml 1×胰蛋白酶（含EDTA）孵育5分钟，使细胞从培养瓶中脱落。2 培养箱
    3. 加入9 ml培养基以灭活胰蛋白酶。使用移液器混匀培养基、胰蛋白酶和脱离的细胞。
    4. 使用血细胞计数板对细胞进行显微计数，并计算所需体积，使每个聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿中加入 90,000 个细胞。该细胞密度对于实现高效转染及单细胞全内反射荧光（TIRF）成像至关重要。
    5. 向每个含有90,000个细胞的玻璃底培养皿中加入2 ml培养基。
    6. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养皿2 孵育器中孵育16-24小时。
  4. N2a 转染
    1. 获取一种质粒构建体，其中包含将SEP荧光蛋白插入目标蛋白胞外区的序列。可采用标准克隆技术，如PCR扩增5 可用于构建重组体。
      注意：SEP 应插入膜蛋白的胞外区，使其位于内质网或运输囊泡的腔内，并在定位于质膜时暴露于细胞外溶液。SEP 的大小与 GFP 相似，可采用类似的克隆策略。
    2. 将培养板中细胞的生长培养基更换为 1.5 ml 低血清培养基（例如，Opti-MEM），在加入转染试剂前约30分钟。
      注意：为研究药物对受体的诱导变化，可在转染时加入适当浓度的药物。
    3. 将每种目标质粒构建体各500 ng加入250 µl低血清培养基中（管1）。
    4. 向另一管含有250 µl低血清培养基的试管中加入2 µl转染试剂。将2号试管在室温下孵育5分钟。转染试剂与质粒DNA的比例应根据目标蛋白的表达情况进行优化。
    5. 将1号管和2号管混合，制成含有500 µl转染试剂与质粒混合物的溶液。室温孵育25分钟。
    6. 将500 µl转染混合物加入预先铺板的细胞中，每皿总体积为2 ml。
    7. 在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 孵育24小时。
    8. 24小时后，移除转染混合物，用生长培养基清洗细胞，然后向每皿中加入2 ml生长培养基。
      注意：如果在转染时已加入药物，则可在该步骤再次补充药物。
    9. 在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 孵育器中孵育24小时。
    10. 转染后48小时对细胞进行成像。

2. 全内反射荧光显微镜（TIRFM）活细胞成像

  1. 成像设置
    1. 使用倒置荧光显微镜系统配合扫描载物台进行成像，如图1所示。该系统需配备488 nm DPSS激光源、用于调节488 nm光束位置的步进电机，以及高数值孔径（1.49 NA）的60倍或100倍油浸物镜。
    2. 将激光束通过适当的激发滤光片（带通488/10 nm）。将偏振激光束对准连接至安装在步进电机上的光纤耦合器的单模光纤。在落射荧光模式下，激发光束应位于物镜后孔径的中心位置。
    3. 为实现全内反射荧光（TIRF），使用步进电机将聚焦的激光束沿物镜后孔径移动，直至达到临界角，此时光束不再透过样品，而是完全在玻璃-细胞界面发生全反射。
    4. 使用EMCCD相机（512 × 512像素）在成像软件（例如 Metamorph）控制下采集图像，发射光路中需安装适当的发射滤光片（525/50 nm）。
  2. 制备成像溶液
    1. 通过将150 mM NaCl、4 mM KCl、2 mM MgCl2、2 mM CaCl2、10 mM HEPES和10 mM葡萄糖溶于ddH2O中，配制200 ml细胞外液（ECS）。NaCl、KCl、MgCl2和CaCl2的储备液可预先配制，并在成像当天与新鲜配制的HEPES和葡萄糖混合使用。
    2. 将100 ml ECS溶液的pH调节至7.4，另100 ml ECS溶液的pH调节至5.4。用2 ml pH 7.4的ECS冲洗转染后的细胞。
    3. 成像前向转染细胞中加入2 ml pH 7.4的ECS。
  3. 活细胞TIRF成像
    1. 开启整个系统，包括488 nm激光器、相机、平移载物台和成像程序。聚焦落射荧光光束，并将光强调节至60倍物镜下约1 mW。
    2. 在物镜上滴加浸油，将含有转染细胞的培养皿置于平移载物台上。使用载物台夹具固定培养皿，确保其相对于载物台位置不变，以便对同一细胞进行多次成像。
    3. 在落射荧光模式下，调节显微镜焦距并定位具有荧光信号的转染细胞。细胞在多个焦平面内均保持清晰聚焦。选择单个、孤立的细胞用于后续TIRF成像。
    4. 在成像程序中，将曝光时间设为200毫秒，并通过调节EM增益优化荧光强度。
    5. 使用步进电机逐步平移激光束穿过物镜后孔径，使光束进入TIRF模式。当接近临界角时，光束将明显沿培养皿边缘移动，直至在样品平面上发生全内反射的点位汇聚。
    6. 通过调节焦距旋钮确认细胞处于TIRF模式。在TIRF模式下，仅有一个细胞焦平面可被清晰聚焦（即距玻璃界面约150 nm），从而获得等离子膜的高分辨率清晰图像。
  4. 成像SEP以确定亚细胞定位
    1. 在成像平面上定位健康、转染成功且孤立的单个细胞。
    2. 在pH 7.4条件下获取细胞的清晰图像。此时应可见标记在等离子膜和内质网上的SEP标记受体。
    3. 迅速阻断激光束，防止样品发生光漂白。
    4. 使用具备记录多个xy位置功能的显微镜成像软件，记忆每个细胞对应的载物台位置。
    5. 对每皿20–30个细胞重复步骤2.4.1–2.4.4，同时使用软件记录每个细胞的位置。
    6. 在完成所有pH 7.4条件下的细胞图像采集后，手动使用移液器移除pH 7.4的ECS溶液。操作时避免触碰培养皿，以防改变已记忆的载物台位置。
    7. 小心向培养皿中加入2 ml pH 5.4的ECS，静置10分钟。在此期间保存已获取的图像。
    8. 在与pH 7.4成像完全相同的条件下，将载物台移至各保存位置，对同一细胞在pH 5.4条件下成像。此时细胞图像应变得模糊，因为所有检测到的荧光均来自局限于内质网的SEP标记受体。保存pH 5.4条件下的细胞图像。
  5. 活细胞中单个囊泡插入事件的成像
    1. 将转染细胞的培养基替换为2 ml pH 7.4的ECS，或替换为Leibovitz's L-15培养基。Leibovitz's L-15培养基的pH不依赖CO2，必要时可支持长时间成像。
    2. 将含有转染细胞的培养皿置于显微镜载物台上。参照上述步骤2.3，固定并以TIRF模式对单个细胞进行聚焦。
    3. 若设备配备自动对焦功能，应启用该功能以防止成像过程中焦距漂移。
    4. 连续采集1,000帧图像，帧速率为200毫秒/帧。在此期间可观察到荧光爆发信号，对应于低pH囊泡与等离子膜融合，使SEP暴露于细胞外pH 7.4环境中。
    5. 定位另一个单个细胞并重复上述步骤。必要时重置自动对焦功能。

3. 图像分析与数据处理

  1. 分析 SEP 荧光以确定亚细胞定位
    1. 使用图像分析软件（如 Metamorph 或 ImageJ（http://imagej.nih.gov/ij/））打开细胞图像。利用滚动球设置对 pH 5.4 和 pH 7.4 的图像均进行背景扣除。
    2. 使用基于强度的阈值来量化单个细胞的荧光。在 pH 7.4 图像中手动选择细胞周围的感兴趣区域。
    3. 使用 ImageJ 中的插件或“分析”选项卡下的内置 "测量"功能，测量细胞面积、平均强度和积分密度。
    4. 对同一细胞在 pH 5.4 条件下的图像重复步骤 3.1.1–3.1.3，以相同方式仔细调整基于强度的阈值和感兴趣区域。
    5. 在获得 pH 7.4 和 pH 5.4 条件下细胞图像的积分密度后，通过从 pH 7.4 的值中减去 pH 5.4 的值得到质膜积分密度。该差值对应于 TIRF 激发区域内质膜上的受体相对数量。
    6. 作为运输的衡量指标，将位于质膜上的 SEP 标记受体的相对百分比计算为：质膜积分密度除以 pH 7.4 时的总积分密度，再乘以 100，表示相对于 TIRF 激发体积内其余可见受体的比例。
  2. 分析单个囊泡插入事件
    1. 使用图像分析软件打开一系列 1,000 张 tiff 图像。使用滚动球设置对所有帧进行背景扣除。
    2. 调整录像的颜色平衡，以增强对应于囊泡插入事件的强荧光区域。手动计数持续时间超过 3 帧（>600 毫秒）的荧光爆发事件。

结果

将硒代半胱氨酸（SEP）掺入受体后，可在活细胞中直接检测该受体。结合全内反射荧光显微技术（TIRFM），可评估受体在质膜上的相对表达水平及其在全内反射激发区域内的亚细胞定位分布情况。此外，还可解析单个囊泡的运输事件。

质膜上SEP标记受体的相对表达水平

在激发光作用下，SEP的荧光强度受周围溶液pH值的调控。当SEP与定位于质膜的受体融合时，可通过改变胞外pH值来开启或关闭其荧光信号5,7,8,9,17。当胞外溶液pH为生理条件下的7.4时，在全内反射荧光（TIRF）激发区域内，质膜和内质网上的受体均会产生荧光。随后，将胞外溶液置换为成分相同但pH为5.4的溶液，可使定位于质膜的SEP转变为非荧光状态，此时所有观测到的荧光信号均来自内质网。 图2展示了细胞在pH 7.4（A）和pH 5.4（B）条件下成像的示例。通过从pH 7.4时的荧光积分密度中减去pH 5.4时的荧光积分密度，可数学计算出在TIRF激发区域内质膜上的受体数量相对于周边内质网的数量，结果如图2C所示。该计算所得的质膜积分密度对应于位于质膜及TIRF激发体积内的SEP标记受体的相对数量。由于TIRF优先激发质膜及其邻近的周边内质网区域，因此这种亚细胞分布的比较仅限于定位于这些区域的受体，而非整个细胞内的所有区域。

SEP标记受体的亚细胞分布

通过比较位于质膜与内质网中的受体比例，可测量受体的转运情况。将pH 7.4条件下质膜的积分密度除以总积分密度，再乘以100，可得到位于质膜上的SEP标记受体的相对百分比5,7。作为对照，可向细胞中添加布雷菲德菌素A（brefeldin A），以破坏细胞内蛋白质的转运过程。当存在布雷菲德菌素A时，TIRF激发区域中几乎所有被检测到的受体都将局限于内质网，从而导致质膜百分比（% PM）降低。此外，可使用突变型（Δ508-I539T）囊性纤维化跨膜调节因子（Δ508-I539T-CFTR）作为阳性对照。在加入市售的VX-809后，细胞表面Δ508-I539T-CFTR的表达量可增加2至3倍。

单个囊泡插入事件

在运输囊泡的低pH环境中，SEP不产生荧光也不发生光漂白，但当其暴露于细胞膜上pH为7.4的胞外环境时，荧光得以恢复7,16,18。插入事件表现为细胞膜上出现持续至少3帧（600毫秒）的荧光爆发，对应于运输囊泡与细胞膜的完全融合，如图3所示。在插入发生前（图3B），无明显荧光爆发；随着运输囊泡到达（图3C），荧光强度开始增强，并在膜上扩散（图3D–图3G），直至融入细胞整体荧光背景中（图3H–图3I）。

光学激发装置示意图：488 nm 激光器、二向色镜、EMCCD、置于移动载物台上的样品示意图。
图 1：全内反射荧光显微镜（TIRF）示意图。 该 TIRF 装置采用 488 nm DPSS 激光器激发 SEP，通过光纤耦合至步进电机，移动激发光束在物镜后焦平面的位置，从而调节激发光束的临界角。细胞成像使用 60 倍、数值孔径 1.49 的油浸物镜。发射光信号由电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）检测。 请点击此处查看此图的放大版本。

细胞结构的荧光显微镜图像，10 μm 比例尺，示意图，细胞分析。
图 2：质膜上的表达与转运。 在 pH 7.4 条件下表达 α3-sep/β4-wt nAChRs 的 N2a 细胞（A）显示受体位于质膜和内质网中。在 pH 5.4 条件下（B），质膜上的受体不产生荧光，因此仅可见定位于内质网的受体。pH 7.4 与 pH 5.4 条件下积分密度的差值（C）对应于定位于质膜的受体。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞的荧光显微镜延时成像，0-1400 毫秒，突出显示动态变化。
图 3：单个囊泡插入事件。 显示的是表达 α3-sep/β4-wt nAChRs 且细胞外 pH 为 7.4 的 N2a 细胞（A）。在插入发生前（B），未见荧光爆发。携带 SEP 的运输囊泡到达（C），SEP 标记的受体在质膜上扩散（D–G），直至与先前插入的受体无法区分（H–I）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

SEP 的 pH 敏感性使得位于质膜上的受体与内质网中的细胞内受体得以区分，并可用于解析携带受体的囊泡插入事件5,7,8,9,18,19,20。目前已有多种技术被广泛用于检测蛋白的表面表达水平，包括细胞表面生物素化和配体结合实验。在某些情况下，也可通过 Western 印迹法区分定位于内质网和质膜的蛋白。这种基于 SEP 的技术是对传统检测方法的补充，能够快速读取表面表达情况，并量化蛋白从内质网向质膜的定位转移。由于 SEP 可被遗传编码至目标蛋白中，因此避免了非特异性结合的问题，同时提高了检测灵敏度。SEP 在中性 pH 条件下可被 488 nm 激发，但在酸性条件（pH <6）下不被激发。当细胞外 pH 为 7.4 时，可检测到位于内质网和质膜上的 nAChR 荧光信号，而低 pH 的分泌囊泡或高尔基体（pH < 6）中的受体则无信号23。在成像过程中，将 pH 7.4 的细胞外液替换为成分相同但 pH 为 5.4 的溶液。两幅图像中积分密度的差值即为细胞质膜的积分密度。将该数值除以在 pH 7.4 条件下全内反射荧光激发区域内总积分密度，再乘以 100，即可得到定位于质膜上的百分比5,7,8,9。尽管这些研究采用了全内反射荧光显微镜（TIRFM），但类似的实验也可使用落射荧光显微镜进行。对于像 nAChR 这类主要定位于内质网的膜受体，TIRFM 是理想选择，因其狭窄的激发体积可提高可见的质膜受体比例，相对于细胞内受体而言，从而增强检测方法对细胞器间受体分布变化的敏感性。对于在质膜上表达水平较高的蛋白，基于落射荧光的 SEP 研究已足以测量受体表达的变化。然而，单个囊泡插入事件的检测（同样在 pH 7.4 下进行）则需要使用 TIRFM。囊泡（低 pH）与质膜（较高 pH）融合时产生的荧光爆发信号在 TIRFM 中清晰可见，但在落射荧光显微镜下通常难以分辨。

结合 SEP 与 TIRF 成像条件

SEP 可以通过基因手段插入膜蛋白的胞外结构域。由于 SEP 的大小和位置，必须验证修饰后的蛋白在运输或功能上与野生型蛋白无显著差异。应使用标记了 SEP 的蛋白进行检测，以确认标签的引入未破坏蛋白活性。对于离子通道，理想的检测方法是电生理学和离子通透性测量；而对于其他受体，则可采用荧光配体结合实验和蛋白质印迹法来验证其运输情况。贴壁细胞最适合使用商业转染试剂进行转染，并利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）成像，因为它们能直接附着于玻璃底培养皿上。这种附着对于确保全内反射产生的隐逝波在玻璃-样品界面约 150 nm 范围内激发是必要的。为了获得高分辨率的 TIRF 图像，样品在成像过程中需要保持平整21。在对 N2a 细胞进行成像时，使用多聚-D-赖氨酸包被是有益的，因为它提供了一种附着基质，可最大限度减少细胞移动，从而维持平整的表面7。接种细胞的密度需要优化，以确保细胞在玻璃皿上彼此分离，从而实现 TIRF 成像。细胞聚集会阻碍全内反射，因为这会妨碍细胞在单一光学平面上平整贴附。由于 TIRF 仅聚焦于一个平面，因此维持正确的细胞形态对成像至关重要。这一点在 SEP 研究中进行溶液更换时尤为重要。为尽量减少形态变化，应在 pH 7.4 和 pH 5.4 条件下快速采集图像。此外，细胞外溶液（ECS，pH 5.4）最终会渗透进入细胞内膜，改变细胞器结构以及内部 SEP 标记受体的荧光信号。这一问题可通过在每种 pH 条件下几分钟内完成图像采集而轻松避免。同一成像实验中多个培养皿的数据可以合并，以增加分析的细胞数量。更换溶液时，应小心用移液器移除 pH 7.4 的 ECS 溶液，并将 pH 5.4 的 ECS 溶液逐滴加入培养皿中。移除或添加溶液过快可能会对细胞造成应激，或导致培养皿相对于已保存的载物台位置发生移动。也可使用灌流系统进行溶液更换，前提是溶液更换必须彻底且迅速。每种溶液中的精确盐浓度是必需的，以尽量减少细胞形变。可在显微镜载物台上使用培养箱以减少成像过程中温度的波动。

全内反射荧光成像

全内反射荧光（TIRF）成像通过聚焦于单一光学平面来减少背景荧光。这种方法选择性地激发玻璃-样品界面约150 nm范围内的荧光分子，从而提高信噪比21,22。在此区域内，分辨率显著提高，尤其是在细胞质膜处。当大多数受体位于细胞内时，该技术尤为必要。如果大量膜受体定位于质膜上，则可利用基于SEP的方法在落射荧光下确定其亚细胞定位。然而，当仅有少量总受体被转运至质膜时（如烟碱型乙酰胆碱受体nAChRs），必须使用TIRFM来量化质膜处荧光随pH依赖性的变化。此外，TIRFM能够分辨单个囊泡的运输事件以及分泌途径中受体的分布情况。基本的TIRF系统采用488 nm的DPSS激光器激发SEP，并通过光纤耦合至步进电机以调节激发光束的临界角。为实现全内反射，需将光束在物镜后焦面横向移动，直至达到临界角。细胞成像使用60倍或100倍、数值孔径（NA）为1.49的油浸物镜。为了达到TIRF所需的临界角，物镜的数值孔径必须高于样品的折射率（细胞的折射率>1.38）。虽然1.45 NA的物镜已能满足基本需求，但在调节激发角度时，1.49 NA的物镜更具实用性。发射光信号由电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）检测，其探测器阵列为8 mm，像素尺寸为512 × 512。使用60倍物镜时，可在同一视野中同时捕获多个分离的细胞。

基于荧光的蛋白表达研究的主要缺点之一是光漂白15。这种由激发引起的荧光分子分解会导致荧光强度随时间发生不可逆的下降。因此，成功的成像依赖于激发光束强度与EMCCD芯片增益之间的精细平衡。激发强度必须足够高以激发荧光分子从而实现检测，但又不能过高，以免导致分子迅速发生光漂白。可通过提高相机增益来放大检测信号，而非增加激发强度，但这同时也会增加背景强度。此外，在选择EM增益设置时必须谨慎，以避免图像饱和。在两次测量之间，应在激发光到达样品前将其阻断，以最大程度减少光漂白。在采集pH 7.4和pH 5.4条件下ECS的细胞图像进行比较时，此步骤尤为必要。两次成像之间发生的光漂白效应与因pH变化导致的荧光缺失无法区分，因此必须尽量减小该效应。应谨慎使用低激光功率，并仅在捕获所需图像所必需的时间内对细胞进行曝光。对于每个实验，可在pH 7条件下、在相同的成像参数下测量一组细胞作为对照。不设置时间间隔，并采用与实验成像相同的曝光时长，可提供用于评估光漂白程度的对照。如果光漂白程度超过原始强度的10%，则可通过采集荧光强度的时间轨迹，利用观测到的光漂白速率绘制校正曲线进行校正。对于单个囊泡插入事件，运输囊泡中SEP标记的受体在与质膜融合之前不会被激发，原因可能是pH使其处于“关闭”状态，或其位于TIRF激发区域之外。因此，SEP标记的受体在插入前不会发生光漂白，从而允许使用较高的激发功率以检测单个SEP分子。

总之，该技术可与多种贴壁细胞类型联用。只要维持蛋白功能和转运特性，SEP 几乎可插入任何膜蛋白中。全内反射荧光显微镜（TIRF）可提高细胞质膜处的分辨率。SEP 能够区分位于细胞质膜上的标记蛋白与周围内质网中的标记蛋白。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本工作部分得到了美国国家药物滥用研究所 T32 DA 016176、美国国家药物滥用研究所 DA 038817 和美国国家药物滥用研究所 DA 040047 的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂/材料
带滤膜盖的无菌细胞培养瓶，Greiner Bio One，75 cm²2VWR82050-856
35 mm 玻璃底培养皿，无菌细胞 E&GGBD00002-200
聚-D-赖氨酸vwr215017510
杜尔贝科改良伊格尔培养基‎ （DMEM），高葡萄糖Fisher Scientific11-965-084 
Opti-MEM I 低血清培养基Gibco / Fisher Scientific31-985-088
胎牛血清，认证级，美国来源，标准型（无菌过滤） Gibco / Fisher Scientific16-000-044
TrypLE Express 酶（1 倍浓度），无酚红Fisher Scientific12604-021
青霉素-链霉素溶液VWR45000-652
Leibovitz L-15 培养基，无酚红Gibco / Fisher Scientific21083027可选
LipofectamineFisher Scientific11668030轻柔混匀；切勿涡旋震荡
氯化钠Fisher ScientificBP358-1
氯化钾Fisher ScientificP217-10
氯化镁Fisher ScientificBP214-500
氯化钙Fisher ScientificC79-500
HEPESFisher ScientificBP310-500
D-葡萄糖Fisher ScientificD16-1
目标浸油 OlympusF型
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>仪器设备
显微镜OlympusIX81
相机AndoriXon Ultra 897
60倍，1.49 数值孔径油浸物镜奥林巴斯APON 60XOTIRF
电动载物台之前IXPROXY
电动执行器（步进电机）ThorlabsZST213
MetaMorph（或其他成像软件）Metamorph
488 nm 激光器市场技术
单模光纤ThorlabsSM450
镜子ThorlabsBB1-E01
二向色镜 488 nm LPSemrockDi02-R488-25x36
带通滤光片，488 nmSemrockLL01-488-12.5
带通滤光片，525/50SemrockFF03-525/50-25

参考文献

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