本文介绍了一种整体免疫组织化学方法，用于可视化Suncus murinus肝外胆道中神经丝蛋白的表达。该方案可用于分析S. murinus或其他物种所有内脏器官的神经支配情况。
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本文内容
摘要
摘要
本研究详细描述了整体免疫组织化学染色方法，使用神经丝蛋白抗体对麝鼩（Suncus murinus（S. murinus ））胆道系统的神经支配进行标记。首先，从 S. murinus 中解剖获取标本，并用4%多聚甲醛（PFA）固定。其次，进行酶处理并灭活内源性过氧化物酶。然后将标本与初级抗体——抗神经丝蛋白抗体——孵育3至6天。随后，标本与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。通过与3,3'-二氨基联苯胺（DAB）底物反应显色。该方法可用于分析所有内脏器官的神经支配情况。此外，本方案也可适用于其他神经元抗体的检测，但需首先对抗体条件进行优化。该方法最初由 Kuratani 和 Tanaka1,2,3 提出。
引言
家鼩鼱（Suncus murinus）属于食虫目（Insectivora）和鼩鼱科（Soricidae）。这种小型哺乳动物广泛分布于东南亚地区，栖息于人类居所或牲畜圈舍附近的住宅及草丛环境中4。与其他实验动物（如小鼠、大鼠和兔）相比，该物种在形态学特征上与人类更为相似5。此前，已采用针对S. murinus神经丝蛋白（neurofilament protein, NFP）的外周神经标记物进行整体免疫染色法，用于标记胰腺6、主十二指肠乳头7、幽门8、胆囊5以及肝外胆道系统9中的外周神经。
神经丝蛋白（NFP）是一种大分子复合物，属于成熟神经元细胞骨架的一部分。神经丝相关蛋白介导NFP与合子体之间的相互作用。NFP10可调控酶的功能以及连接蛋白的结构。NFP复合物由三种多肽组成：NF-L（70 kDa）、NF-M（150–160 kDa）和NF-H（200 kDa）。NFP存在于中枢神经系统和周围神经系统神经元的轴突中。抗人NFP抗体已被证实可用于标记中枢和周围神经系统的轴突。解剖学和电生理学研究表明，括约肌、胆囊以及近端胃肠道之间存在连接11,12,13,14。然而，这些神经连接的形态学特征尚未明确界定。
本研究展示了利用整体免疫组织化学染色法，通过NFP抗体标记S. murinus胆道系统的神经支配。
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方案
所有实验程序均经东京都立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。动物的饲养和操作均遵循 实验动物护理和使用的指南 以及 实验动物护理与使用指南 遵循加拿大动物护理委员会的规定。实验所用动物由日本东京都立大学前沿健康科学部功能形态学实验室自行繁育并饲养。
1. 动物护理与饲养
- 从封闭繁殖群体中获取7只S. murinus（雌性3只，雄性4只，体重70-90 g）。
- 断奶后（出生20天后）将S. murinus单独饲养于塑料笼中，笼内配备装有纸条的木制巢箱。将动物置于常规条件的动物房中：温度23-27 °C，无湿度控制，光照周期为12小时光照:12小时黑暗。自由供应商品化鳟鱼颗粒饲料和饮水。
2. 组织制备
- 配制4% (w/v) 多聚甲醛（PFA）溶液：将40 g PFA溶解于1,000 mL 0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中。在通风橱内使用涡旋混合器搅拌至溶液澄清。将4% PFA溶液在4 °C下过夜保存。
注意：操作PFA时需佩戴适当的个人防护装备（PPE）。 - 为进行灌注和固定动物，先用乙醚麻醉动物，随后按每公斤体重0.6 mL剂量给予戊巴比妥钠（somnopentyl）腹腔注射。
- 待动物完全麻醉后，用手术刀打开腹腔，沿腹中线做一条长约3 cm的切口。在切开下腔静脉以放血的同时，将导管逆行插入腹主动脉，位置位于该动脉分叉为左右髂总动脉的稍上方。
- 注射戊巴比妥钠（somnopentyl，每公斤体重1.0 mL）以确保完全安乐死，随后在通风橱内依次用0.01 M PBS（pH 7.4）和4% PFA进行灌注。
- 灌注完成后，向血管系统注入2–3 mL白色氯丁橡胶乳胶（用蒸馏水按3:2比例稀释白色氯丁橡胶乳胶）以标记血管。
- 整块取出包括肝脏、胆囊、胆总管、十二指肠和胰腺在内的腹部器官，并保留相关神经和血管结构。
- 向胆囊内注入约0.1 mL蓝色氯丁橡胶乳胶（在10 mL已稀释的白色氯丁橡胶乳胶中加入一滴蓝色墨水）以标记胆道系统。
- 用于整体免疫染色时，以4% PFA在4 °C下过夜后固定。
注意：PFA具有毒性，避免直接接触。PFA必须在通风橱中使用。
3. 全组织免疫组织化学
注意：在整个实验过程中，包括洗涤、抗体孵育和显色步骤，样品必须始终置于摇床上，在室温下轻轻摇动 或在 4°C.
- 第1天：酶处理及潜在内源性过氧化物酶的灭活
- 将制备好的样本置于适当大小的玻璃小瓶中，用去离子水（DW）在室温下清洗4次，每次1小时。在振荡器上轻轻摇动样本以去除多聚甲醛（PFA）。更换溶液时避免损伤样本。
- 配制1% (w/v) 过碘酸：将1 g过碘酸溶解于100 mL去离子水中。
- 将样本在1%过碘酸中于室温孵育20分钟，以防止任何内源性过氧化物酶反应。
- 配制0.004% (w/v) 木瓜蛋白酶溶液：将0.004 g木瓜蛋白酶溶解于100 mL 0.025 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.6）中。
- 用去离子水在室温下清洗样本10分钟。
- 将样本置于新配制的0.004%木瓜蛋白酶溶液中，在37 °C恒温水浴中轻轻摇动孵育2小时。
- 用去离子水在室温下清洗样本50–60分钟。
- 将样本在4% PFA中于4 °C过夜保存。
- 第2天：酶处理
- 将保存的样本在室温下用去离子水清洗4次，每次1小时。
- 将样本置于新配制的0.004%木瓜蛋白酶溶液中，在37 °C恒温水浴中轻轻摇动孵育2小时。
- 用去离子水在室温下清洗样本50–60分钟。将样本在4% PFA中于4 °C过夜保存。
- 第3天：冷冻处理
- 如前所述，将保存的样本在室温下用去离子水清洗4次，每次1小时。
- 配制2.5% (w/v)、5% (w/v) 和10% (w/v) 蔗糖溶液：分别将2.5 g、5 g和10 g蔗糖溶解于100 mL 0.01 M PBS（pH 7.4）中。
- 将样本依次浸入2.5% (w/v)、5% (w/v) 和10% (w/v) 蔗糖溶液中，每种溶液各30分钟。
- 将样本在-20 °C冷冻30–60分钟，然后在室温下完全解冻；重复该循环3次。
- 配制2% Triton X-100 (v/v) 溶液：将2 mL Triton X-100加入100 mL 0.01 M PBS（pH 7.4）中。
- 将样本在2% Triton X-100中于4 °C过夜保存。
- 第4天：一抗孵育
- 配制一抗稀释液：将0.2 g牛血清白蛋白（BSA）、0.3 mL Triton X-100和0.1 g叠氮化钠溶解于100 mL 0.01 M PBS（pH 7.4）中。
注意：叠氮化钠具有急性毒性，应避免吸入和接触。操作时需穿戴适当的个人防护装备（PPE）。 - 将一抗（NFP）按1:600比例稀释于上述稀释缓冲液中（步骤3.4.1）。将样本在4 °C下与NFP抗体孵育3–6天，并在振荡器上保持轻微摇动。较大的样本需要更长的孵育时间。
- 配制一抗稀释液：将0.2 g牛血清白蛋白（BSA）、0.3 mL Triton X-100和0.1 g叠氮化钠溶解于100 mL 0.01 M PBS（pH 7.4）中。
- 二抗孵育
- 在室温下用PBS清洗样本4次，每次1小时，以去除未结合的一抗。
- 配制二抗稀释液：将0.2 g BSA和0.3 mL Triton X-100溶解于100 mL 0.01 M PBS（pH 7.4）中。
- 将二抗（辣根过氧化物酶标记、亲和纯化的羊抗小鼠IgG-HRP）按1:600比例稀释于稀释缓冲液中（步骤3.5.2）。将样本在4 °C下与二抗孵育3天，并在振荡器上保持轻微摇动。
- 显色
- 在通风橱中，将0.002 g 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）加入100 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.6）中，配制DAB显色液，并避光保存。
- 在室温下用PBS清洗样本4次，每次1小时。
- 向新配制的DAB显色液中加入10 µL 30% H2O2，将样本在4 °C下避光孵育过夜或3天，同时在振荡器上轻轻摇动。
- 当达到最佳染色强度时，将样本转移至含0.04%叠氮化钠的PBS中终止反应。
注：在此步骤之前避免使用叠氮化钠，因其会抑制辣根过氧化物酶活性。
- 染色组织成像
- 小心将样本转移至含有PBS的玻璃培养皿（高5 cm，直径10 cm）中。使用安装在体视显微镜上的相机拍摄整体装片图像。
注：整体装片染色组织应在透明玻璃培养皿中完全浸没于PBS时进行成像。
- 小心将样本转移至含有PBS的玻璃培养皿（高5 cm，直径10 cm）中。使用安装在体视显微镜上的相机拍摄整体装片图像。
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结果
图1–4 展示了S. murinus肝外胆道系统中神经丝蛋白阳性神经纤维的典型结果。抗神经丝蛋白抗体可稳定地标记整个肝外胆道系统（图1）、胆囊（图2）、上段胆管（图3）以及十二指肠乳头区域（图4）的神经支配，具有高度特异性且背景信号极低。
对于标本的所有组织，无论其形状和大小如何，均可同时对被盖神经进行染色。除肝外胆道的神经支配外，食管和胃的迷走神经走行及其分布密度也清晰可见（图1）。
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讨论
本研究描述了利用神经丝蛋白抗体对肝外胆道系统神经支配进行可视化观察的实验步骤。本方案改编自Kuratani和Tanaka所描述的方案1,2,3。
进行本实验时，需为每项实验规划时间表，因为整体组织染色过程将持续2至3周。除冻融步骤外，盛放组织的容器必须始终在旋转摇床（nutator）上持续旋转。特别是在与一抗和二抗孵育期间，应将样本置于冷藏室中，并在旋转摇床上持续转动，以确保样本与反应溶液充分且均匀接触。多种溶液——包括1% (w/v) 过碘酸、0.004% (w/v) 木瓜蛋白酶以及一抗/二抗稀释缓冲液——必须在每次实验前新鲜配制。在整个实验流程中，为避免更换溶液时触碰或损伤样本，应直接倾倒溶液，不得使用镊子移除溶液15。
使用PFA固定后，样品应使用去离子水或PBS充分洗涤。此外，木瓜蛋白酶...
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披露
作者声明无利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 正高碘酸 | Wako | 162-00732 | |
| 木瓜蛋白酶 | Wako | 164-00172 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Wako | 010-15131 | |
| 叠氮化钠 | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| 神经丝蛋白（NFP）抗体 | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| 辣根过氧化物酶标记的亲和纯化羊抗小鼠IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB） | Wako | 349-00903 | |
| 咪唑 | Sigma | I-0125 |
参考文献
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重印与许可
