应用基因编码的荧光一氧化氮（NO•）探针geNOps对单细胞中NO•信号进行实时成像

摘要

本手稿介绍了利用新型基因编码的一氧化氮（NO•）探针（geNOps）结合荧光显微镜实时监测单细胞内NO•动态变化的实验方案。通过将geNOps与化学钙离子（Ca²⁺）传感器结合，实现了对单个内皮细胞水平上由Ca²⁺触发的NO•生成过程的可视化观测。

摘要

一氧化氮（NO•）是一种小分子自由基，在哺乳动物、细菌和植物中介导多种重要的细胞功能。尽管目前已存在大量检测NO•的方法 体内 和 体外在单细胞水平上对一氧化氮自由基（NO•）进行实时监测具有很大挑战性。NO•的生理或病理效应取决于该自由基的实际浓度及其停留时间。因此，能够实现单细胞水平NO•检测的方法备受期待。近期，我们通过引入基于单一荧光蛋白的基因编码一氧化氮探针（genetically encoded nitric oxide probes, geNOps），扩展了可用于NO•检测的指示分子种类。geNOps可直接响应细胞内NO•的动态变化，从而满足上述需求。本文展示了利用geNOps检测两种不同化学性NO•释放分子所诱导的细胞内NO•信号的方法。我们的结果还证实，与无机NO•供体亚硝基铁氰化钠（sodium nitroprusside, SNP）相比，新配制的3-(2-羟基-1-甲基-2-亚硝基肼基)-N-甲基-1-丙胺（NOC-7）在引发细胞内NO•水平变化方面具有更强的能力。此外，通过绿色geNOp（G-geNOp）与化学性Ca²⁺探针的双色活细胞成像，可实现对NO•与Ca²⁺信号的同步监测。²⁺ 使用指示剂fura-2观察Ca²⁺的严格调控²⁺依赖性的一氧化氮（NO•）在单个内皮细胞中的形成。这些代表性实验表明，geNOps 是适用于在多种实验条件下研究单细胞 NO• 信号实时生成与降解的有力工具。

引言

我们最近开发了一类新型的基因编码荧光一氧化氮自由基（NO•）探针，称为geNOps¹。这些传感器由一个结构简单的、来源于细菌的NO•结合结构域²与一种不同的荧光蛋白（FP）变体³（青色、绿色或橙色FP）共价连接而成。当NO•与geNOps中的非血红素铁(II)中心⁴结合时，会立即导致荧光强度下降¹。重要的是，当细胞内NO•水平降低时，geNOps的荧光能够迅速且完全恢复¹。因此，geNOps可用于实时成像亚细胞或细胞水平的NO•动态变化。尽管目前geNOps的NO•感应机制尚不明确，但它们已被证实是极为优异的NO•报告工具，有望开启具有高空间和时间分辨率的多色定量NO•生物成像的新时代^1,5。其他现有的荧光NO•探针基于小分子化学化合物，需被导入细胞内，并且会被NO•不可逆地修饰⁶。此外，对NO•敏感的小分子荧光探针还存在潜在的细胞毒性以及相对较低的特异性等缺点，使其难以以可靠、分析性和结论性的方式使用^7,8,9。尽管基因编码荧光探针的有效应用需要高效的基因转导技术，但基于荧光蛋白的基因编码传感器已成为不可或缺的工具，极大地推动了我们对细胞内部功能的理解^10,11。在单荧光蛋白型geNOps开发之前，已有研究构建了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的NO•传感器，称为NOA-1¹²。Sato et al. 设计了这一复杂的探针，其包含两个对NO•敏感的可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）亚基，每个亚基均连接了可报告环磷酸鸟苷（cGMP）水平的FRET型传感器¹²。由于该探针响应的是cGMP变化，因此仅能间接反映细胞内NO•的波动¹²。尽管NOA-1可在纳摩尔浓度范围内响应NO•的升高，但该工具至今尚未被广泛使用，可能与其作为体积较大的双组分传感器在可获得性和实用性方面的局限性有关。

一氧化氮自由基（NO•）具有多种功能，影响着基本的生物学过程，这些功能已被充分表征^13,14。大量研究表明，细胞及其亚结构区域内NO•的浓度决定了细胞在健康和疾病状态下的命运^14,15,16。在哺乳动物中，NO•主要由广泛研究的硝酸合酶（NOS）家族在多种细胞类型中通过酶促反应生成¹⁷。迄今为止，已发现三种NOS同工型^18,19,20：即依赖Ca²⁺/钙调蛋白的内皮型NOS（eNOS或NOS-3）¹⁸和神经元型NOS（nNOS或NOS-1）¹⁹，以及不依赖Ca²⁺/钙调蛋白、组成型表达且可被诱导的诱导型NOS（iNOS或NOS-2）²⁰。此外，也有研究提出线粒体中存在线粒体NOS（mtNOS）²¹。然而，mtNOS被认为是nNOS的一种剪接变体，因此未被单独归类为一种同工型²¹。除哺乳动物细胞中的同工型外，还存在一种所谓的细菌NOS（bNOS），主要存在于革兰氏阳性菌中²²。NO•的酶促生成受到严格调控，依赖于多种辅因子的可用性，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、四氢生物蝶呤（BH4）、分子氧和L-精氨酸¹⁷。其中，阳离子氨基酸L-精氨酸是NO•生成过程中转化为L-瓜氨酸的底物¹⁷。除了高度调控的酶促生成途径外，已有研究推测，在缺氧条件下，NO•还可通过线粒体非酶促地从亚硝酸盐库中还原生成²³。一旦细胞内生成NO•，它即可自由穿过生物膜^14,15。然而，该自由基极短的半衰期主要受环境条件影响，多种代谢途径和化学反应可有效降低NO•水平²⁴。最终，NO•的生成、扩散和降解依赖于多种环境参数，这些参数共同决定了这一高度生物活性分子的有效浓度²⁴。

geNOps 技术能够直接检测（亚）细胞内一氧化氮自由基（NO•）的波动¹，因此适用于重新研究并新发现介导细胞内 NO• 信号积累与分解的机制。本文提供了利用 geNOps 可视化外源性诱导和内源性产生的一氧化氮自由基（NO•）分布的简单实验方案及代表性结果，可在单细胞水平上进行观察。此外，geNOps 技术还可适用于其他细胞模型系统，用于研究在多种细胞刺激和应激条件下 NO• 生成、扩散和降解的复杂模式。

方案

1. 化学缓冲液和溶液的配制

1. 配制含有 135 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂ 的储存缓冲液₂，1 mM MgCl₂，10 mM HEPES，2.6 mM NaHCO₃₃，0.44 mM KH₂PO₄，0.34 mM Na₂HPO₄，10 mM D-葡萄糖，2 mM L-谷氨酰胺，1× MEM 维生素，1× MEM 氨基酸，1% 青霉素-链霉素，以及 1% 两性霉素 B。将所有组分溶于蒸馏水中，室温下使用磁力搅拌器搅拌 20 分钟。用 1 M NaOH 调节 pH 至 7.44。逐滴加入 NaOH 时，持续搅拌并用 pH 计测量 pH 值。
2. 制备生理浓度的 Ca²⁺含140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂的缓冲液₂，1 mM MgCl₂，10 mM D-葡萄糖和10 mM HEPES。按照步骤1.1所述，用NaOH调节pH至7.4。
3. 制备 Ca²⁺不含缓冲液，其成分与步骤1.2中所列相同，但使用1 mM EGTA代替2 mM EGTA。
4. 将Fura-2AM溶于DMSO中，配制成1 mM的储存液。将储存液分装至密封良好的小瓶中，于-20 °C避光保存，可保存一个月。若已冷冻，使用前需在室温下避光平衡至少1小时。将Fura-2AM储存液加入1 ml储存缓冲液（步骤1.1）中稀释，终浓度为3.3 µM。
5. 配制1 ml 100 mM组胺储备液于蒸馏水（pH 7.0）中。将100 mM组胺储备液加入100 ml Ca²⁺-含生理缓冲液，使组胺终浓度为 100 µM。
6. 将Nω-硝基-L-精氨酸（L-NNA）溶于100 ml含钙生理缓冲液中，配制成终浓度为300 µM的溶液。将溶液置于37 °C水浴中孵育至少1小时，直至L-NNA完全溶解。
7. 将10 mg NOC-7溶于蒸馏水（pH 7.0）中，配制成10 mM的储备液。将储备液分装至密封良好的小份样品管中，立即于-70 °C保存。使用生理缓冲液稀释NOC-7储备液，获得终浓度为10 µM的NOC-7溶液。
   注意：NOC-7 是一种可自发释放一氧化氮（NO）且半衰期较短的小分子化合物。每次实验前均应新鲜配制含 NOC-7 的工作缓冲液。
8. 在生理钙缓冲液中配制1 mM的亚硝基铁氰化钠（SNP）溶液，并制备10 µM的稀释液。
   注意：由于NO供体溶液降解迅速，务必每次配制少量（约10 ml）。
9. 配制一种磷酸盐缓冲液（PBS），包含 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、9.2 mM Na₂HPO₄，以及 1.5 mM KH₂PO₄用 NaOH/HCl 将 pH 值调节至 7.44。

2. 细胞制备

注意：为了在使用geNOps测量单细胞中一氧化氮（NO•）时获得一致的实验结果，细胞在成像实验前需预先用含铁（II）/维生素C的缓冲液孵育，以恢复NO•探针NO•结合域中的Fe²⁺。对于EA.hy926和HEK293细胞，用铁（II）增强溶液孵育20分钟即可完全激活NO•传感器。

1. 将5.5 × 10⁵个EA.hy926细胞或HEK293细胞接种于6孔板中直径为30 mm的显微镜盖玻片上，用于次日实验；若用于后天实验，则接种3.5 × 10⁵个细胞。在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中培养细胞。
   注意：有关哺乳动物细胞的腺病毒转导及病毒构建的详细信息已在Zhang et al.²⁵中描述。此步骤不适用于稳定表达G-geNOp的HEK293细胞。
2. 取不含抗生素的胎牛血清（FCS）和DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基），加入携带编码G-geNOp基因的腺相关病毒5型（AAV5）载体（EA.hy926细胞的感染复数MOI为500时，几乎可实现100%的阳性细胞；HEK293细胞的MOI为1时即已有效）。
   注意：使用腺相关病毒载体属于生物安全风险等级2级。通常操作该载体需在生物安全二级条件下进行。如有需要，也可在含FCS的培养基中进行病毒感染。或者，可使用脂质体载体对细胞进行瞬时转染¹。
3. 移除培养基，用预热（37 °C）的PBS洗涤细胞。每孔加入1 ml DMEM/AAV5混合培养基，孵育1小时。此步骤不适用于稳定表达G-geNOp的HEK293细胞。
4. 每孔加入1 ml含20% FCS的DMEM培养基，使FCS终浓度为10%。不要移除含有AAV5的培养基。轻轻摇动培养板，使各孔内培养基混合均匀。在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中继续孵育细胞48小时。此步骤不适用于稳定表达G-geNOp的HEK293细胞。
5. 48小时后，用预热的PBS洗涤细胞。随后每孔加入2 ml预热的保存缓冲液（见第1.1节），在室温（RT）下避光孵育至少1小时。
6. 将保存缓冲液替换为每孔1 ml的亚铁离子（iron(II)）增强液，于室温（RT）下避光孵育恰好20分钟。
   注意：切勿超过或缩短最佳孵育时间，否则可能影响NO•探针的响应性能。
7. 用保存缓冲液洗涤细胞一次，每孔加入2 ml保存缓冲液，在室温下继续孵育至少2小时，使细胞充分平衡。
8. 将保存缓冲液替换为含3.3 µM Fura-2AM的1 ml保存缓冲液，在室温下避光孵育45分钟。
9. 用保存缓冲液洗涤细胞两次，再次孵育至少30分钟，以使细胞达到平衡状态。

3. 单个细胞中一氧化氮（NO•）和钙离子（Ca²⁺）信号的活细胞成像

1. 将步骤 2.1 中制备的、涂有 EAhy.926 或 HEK293 细胞的 30 mm 盖玻片固定于金属灌流室中，并置于显微镜载物台上。将进液管连接至缓冲液储液瓶，出液管连接至真空泵。确保灌流稳定，避免盖玻片表面干燥。
2. 使用半自动灌流系统，以生理钙缓冲液（来自步骤 1.2）启动重力驱动的灌流。
   注：该系统包括缓冲液储液瓶、相应管路、电子控制的电磁阀和真空泵（见图 1B）。流速可在 1 至 3 ml/min 范围内调节，具体取决于灌流储液瓶的高度。为实现稳定的局部药物施加，所有使用的储液瓶流速应大致相等，应在成像实验前进行测试。需注意，内皮细胞会对灌流引起的剪切应力增加产生反应。
3. 开启成像系统，并让所有设备预热 30 分钟。
4. 使用相应软件设定成像参数。Fura-2 成像选择 340 nm 和 380 nm 激发波长，G-geNOp 激发选择 480 nm。为减少荧光漂白，将相机 binning 增加至 4，并降低激发光强度和曝光时间。另见步骤 3.6–3.8。
   注：成像设置和参数取决于所用设备、Fura-2 负载效率以及 G-geNOp 表达水平。
5. 通过移动显微镜的 xyz 载物台，选择包含多个荧光细胞的视野并使其聚焦。然后使用相应软件工具定义感兴趣区域（ROIs）。在每个成像视野中手动绘制覆盖多个完整单个荧光细胞的区域。此外，定义一个大小相近的背景区域。
   注：一旦图像被采集并存储，也可在成像结束后使用相应的图像分析软件（见材料清单）重新定义 ROIs 以进行进一步分析。
6. 在配备电动载物台和单色光源的倒置高级荧光显微镜上开始采集数据。分别对 Fura-2AM 以 340 nm 和 380 nm 交替激发，对 G-geNOp 以 480 nm 激发。设定相应的曝光时间，使所有通道在时间序列中均可检测到清晰的荧光信号。另见步骤 3.4。
   注：此设定取决于激发光强度和相机 binning。例如，可使用激发光强度 15%，相机 binning 为 4，340 nm 曝光时间为 150 ms，380 nm 为 50 ms，480 nm 为 300 ms。另见步骤 3.4。
7. 使用配备适当滤光片组（包括 500 nm 激发滤光片、495 nm 二向色镜和 510–520 nm 发射滤光片）的电荷耦合器件（CCD）相机，分别在 510 nm（Fura-2/AM）和 520 nm（G-geNOp）收集发射光。每 3 秒记录一帧完整图像。
8. 在生理 Ca²⁺ 缓冲液（1.2）中记录最初几分钟（必要时可达 3 分钟），以获得各荧光信号随时间变化的基础值。
9. 当观察到稳定的基线荧光后，切换至含 100 µM 组胺或 ATP（1 µM 或 100 µM）的生理 Ca²⁺ 缓冲液，刺激细胞 3 分钟。
   注：对激动剂有反应的 EA.hy926 细胞会表现出 Fura-2 比值（340 nm 激发荧光除以 380 nm 激发荧光）急剧升高，同时 G-geNOp 荧光信号明显下降。
10. 切换回不含组胺或 ATP 以及 L-NNA 的生理 Ca²⁺ 缓冲液，灌流 5 分钟以清除细胞中的化合物。此步骤可根据需要延长，直至荧光变化完全恢复。
11. 通过灌流系统在生理 Ca²⁺ 缓冲液中施加 10 µM NOC-7，持续 2 分钟。NO 供体对 G-geNOp 荧光有显著影响，通常在 10 µM NOC-7 作用下荧光降低 >20%。在 EA.hy926 细胞中，NOC-7 引起的 G-geNOp 荧光淬灭效应约为激动剂诱导效应的 3 倍。
12. 用生理 Ca²⁺ 缓冲液冲洗 NO• 释放化合物约 10 分钟，待基础荧光恢复后停止记录。

4. 数据分析

1. 将随时间变化的单个细胞平均荧光强度数据导出至数据分析软件。
2. 减去相应的背景值，并计算每个单细胞在不同时间点的fura-2信号在340 nm与380 nm处的比值。
3. 减去G-geNOp通道的背景值，使用任意计算软件获得NO探针随时间变化的实际荧光强度（F）。
4. 将基线荧光值记为F₀（F₀指未进行刺激时NO探针随时间变化的荧光强度）。另见步骤4.5和图1C。
5. 使用以下方程计算随时间变化的荧光漂白效应函数：F₀ = F_inital•exp(-K•Time) + F_plateau。其中，F_inital：成像开始时的最大荧光信号；K：随时间变化的荧光漂白速率常数；F_plateau：随时间漂白达到的荧光最小值；另见步骤4.3–4.4和图1C。
   注意：在拟合过程中，可使用细胞刺激前和刺激后所有随时间变化的荧光值。更多细节参见Bentley et al.²⁷。
6. 为对G-geNOp信号随时间的变化进行归一化处理，计算1-F/F₀（见步骤4.3–4.5）。参见图1C和图1D。

结果

单细胞一氧化氮•在瞬时施加一氧化氮供体后的响应图谱可视化

我们使用了一种稳定表达 G-geNOp 的 HEK 细胞克隆（图 1A），以在单细胞水平上可视化两种不同的 NO 释放小分子化合物 NOC-7 和 SNP 所诱导的 NO• 信号。在成像过程中，通过基于重力的灌流系统依次向细胞施加和去除 NO• 供体，以确保持续的液体流动（图 1B）。所有表达 G-geNOp 且表达强度不同的细胞在加入 NOC-7 和 SNP 后均表现出荧光信号的明显下降（图 1C），表明添加 NO• 供体后细胞内 NO• 快速积累。归一化的荧光信号（1-F/F₀）显示，两种 NO• 供体均引起细胞内 NO• 水平的均一升高，并在洗脱 NO• 释放化合物后完全恢复（图 1D）。然而，10 µM SNP 诱导的细胞内 NO• 信号仅为 10 µM NOC-7 所达到信号的 50%（9.63 ± 1.05%，n = 3/38），而后者为 18.10 ± 1.20%（n = 3/38，p < 0.0001）。为了使两种 NO• 供体达到相等的细胞内 NO• 水平，需要使用 1 mM 的 SNP 浓度（图 1C、图 1D）。

接下来，我们测试了新配制与已过期的NOC-7在提高HEK细胞内NO•水平方面的能力。为此，我们配制了四种实验缓冲液，均含有5 µM NOC-7。NO•供体或在测量前立即新鲜加入，或在室温下分别于储液器中保存1小时、2小时和3小时后再进行测量。通过灌流系统将不同缓冲液依次施加至表达G-geNOp的细胞并洗去（图2B）。该方法揭示了水溶液中NOC-7的稳定性，其提升细胞内NO•水平的能力随时间延长而逐渐下降，结果符合预期（图2A、2C）。有趣的是，与新鲜NOC-7所引发的细胞内NO•反应相比，在去除已过期缓冲液后，NO•信号恢复得显著更快（图2C），这可能提示完整的NO•释放分子会黏附于细胞组分上。

单个内皮细胞中 Ca²⁺ 与 NO• 信号的同步可视化

为了研究内皮细胞中由 Ca²⁺ 触发的一氧化氮自由基（NO•）生成，我们使用了常用的人源永生化内皮细胞替代模型——EA.hy926 细胞系，并对其进行 G-geNOp 的瞬时转染，随后负载 Fura-2/am（见方案 2.8）。转染后约有 10% 的 EA.hy926 细胞呈 G-geNOp 阳性（n = 6，图 3A），该比例足以在单个内皮细胞水平上记录 Ca²⁺ 诱导的 NO• 生成。然而，通过使用腺相关病毒载体，我们实现了接近 100% 的 G-geNOp 阳性 EA.hy926 细胞（n = 6；见方案 2.2）。在进行多通道检测前，细胞在室温下用含有 L-NNA（一种强效不可逆的 NOS 抑制剂）的保存缓冲液孵育 20 分钟²⁶。对照组细胞则置于不含 L-NNA 的相同保存缓冲液中（见方案 1.1）（图 3B）。对对照组细胞施加组胺（一种强效的肌醇 1,4,5-三磷酸（IP₃）生成型激动剂）后，胞质内 Ca²⁺ 水平迅速升高，随后细胞内 NO• 水平逐渐上升，直至撤除激动剂（图 3C、图 3D）。经 NOS 抑制剂预处理的细胞表现出类似的胞质 Ca²⁺ 信号，但在组胺刺激下，细胞内 NO• 水平几乎未发生变化（图 3E）。表达 G-geNOp 的 EA.hy926 细胞还分别用 1 µM 和 100 µM 的 IP₃ 生成型激动剂 ATP 处理，以验证 geNOp 是否适用于监测激动剂在低生理浓度和超生理浓度下引发的 NO• 信号（图 3F）。在该内皮细胞系中，1 µM ATP 诱导出明显的胞质 NO• 信号，其幅度约为 100 µM ATP 所诱导信号的一半（图 3F）。

图 1：不同一氧化氮释放分子诱导的细胞内 NO 动态变化。（A）稳定表达胞质 G-geNOp 的 HEK 细胞的宽场荧光图像。比例尺 = 20 µm。（B）基于重力驱动的半自动灌流系统示意图，用于精确施加和清除 NOC-7 与 SNP。（C）代表性（共 3 次独立实验）单细胞荧光强度随时间变化曲线（未归一化，单位为任意单位），反映稳定表达胞质 G-geNOp 的 HEK 细胞对 10 µM NOC-7、10 µM SNP 和 1 mM SNP 的响应。粗黑线代表 26 条单细胞曲线（浅灰色曲线）的平均值。黑色虚线表示用于归一化的初始荧光强度 F₀。（D）对（C）图中提取的数据进行归一化并取反（1-F/F₀，浅灰色曲线）后的单细胞响应曲线及平均曲线（粗黑线），显示细胞对 10 µM NOC-7、10 µM SNP 和 1 mM SNP 的时间依赖性响应。请点击此处查看该图的高清版本。

图2：使用稳定表达G-geNOp的HEK细胞对NOC-7进行稳定性测试。（A）稳定表达G-GeNOps的HEK细胞在加入新鲜和陈旧NOC-7缓冲液后，NO•浓度随时间变化的代表性响应曲线。所有含NOC-7的缓冲液均使用同一母液（50 mM）配制，终浓度为5 µM。各缓冲液自配制完成至成像之间的放置时间分别为1小时、2小时和3小时，如图所示。（B）基于重力驱动的半自动灌流系统示意图，用于在成像过程中连续添加和移除含NOC-7的溶液。（C）细胞NO•信号对新配制与陈旧NOC-7缓冲液响应的时间相关性。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：单个EA.hy926细胞中NO•与Ca²⁺信号的同时多通道成像。（A）表达G-geNOp的EA.hy926细胞的代表性宽场荧光图像（左图），该细胞负载fura-2/am（中图和右图）。比例尺 = 20 µm。（B）在六孔板中，EA.hy926细胞在测量前用500 µM Nω-硝基-L-精氨酸（L-NNA）处理20分钟的示意图。（C）对100 µM组胺刺激后，fura-2（激发：340 nm/380 nm；发射：510 nm）和G-geNOp信号（激发：480 nm；发射：520 nm）同时记录的代表性时间过程。如图所示，组胺在3分钟后通过灌流系统被移除。（D）曲线表示单个负载fura-2/am并瞬时表达G-geNOp的内皮细胞中，胞质Ca²⁺（fura-2比值信号，F₃₄₀/F₃₈₀为灰色实线）和NO•（归一化并反转的曲线，1-F/F₀为绿色实线）信号随时间变化的同步记录。细胞在含Ca²⁺（2 mM CaCl₂）的缓冲液中用100 µM组胺刺激3分钟（n = 8/3）。（E）在测量前经500 µM Nω-硝基-L-精氨酸（L-NNA）预处理的EA.hy926细胞中，Ca²⁺（灰色实线）和NO•（绿色实线）信号随时间同步记录的代表性结果（n = 12/3）。细胞在2 mM Ca²⁺存在下用100 µM组胺处理。（F）平均曲线表示对1 µM ATP刺激后，再以100 µM ATP进行第二次细胞刺激时胞质NO•信号的变化。柱状图表示4次独立实验中对1 µM ATP（白柱）和100 µM ATP（绿柱）刺激的最大G-geNOp信号的平均值±标准差；p < 0.001（与1 µM ATP相比）。P值采用非配对t检验计算。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

自从发现一氧化氮自由基（NO•）是生物学中一种重要的信号分子以来²⁸，人们一直希望以可行且可靠的方式，对单个细胞、组织和整体动物中的该自由基进行高分辨率的实时特异性检测。本文报道了近期开发的基因编码荧光NO•探针（geNOps）的应用，该探针可利用宽场荧光显微镜实现对活细胞中NO•信号的精确成像¹。

为避免复杂且具有侵入性的转染操作，采用稳定表达绿色荧光蛋白标记的G-geNOp的HEK细胞克隆，用于定量检测外源性生成的单细胞NO•动态。由于HEK细胞通常不内源性产生NO•²⁹这种细胞类型适用于构建基于geNOp的传感器细胞系，该细胞系在与一氧化氮（NO•）产生的原代细胞共培养条件下，甚至在活体动物中，都可能具有广泛的应用价值³⁰然而，在本研究中，我们利用表达 G-geNOp 的 HEK 细胞模型，展示了多种不同浓度和稳定性的一氧化氮（NO•）释放化合物引发细胞内 NO• 信号的能力。我们的数据表明，NO• 供体的浓度、性质及施用方式最终决定了细胞内 NO• 信号谱的模式。此类信息对于 原位 不同NO•供体的药代动力学表征，这些供体与多种疾病相关。值得注意的是，geNOps已被证明在长时间内对多次重复施加的NO•供体脉冲具有稳定的响应性¹因此，本文中使用NO•释放化合物的实验，可对相应细胞内NO•信号的不同幅度和动力学特征得出半定量结论（图1 和 2).

尽管稳定表达的HEK细胞克隆可能来源于单个细胞，但仍观察到G-geNOps表达水平存在广泛异质性（图1）。这是稳定细胞克隆的常见特征，因为目的基因（整合于基因组中）的转录受到多种因素调控，例如不同的环境应激³¹会影响细胞生长速率³²，以及细胞周期状态³³。基于单一荧光蛋白的geNOps为非比率型探针，因此NO•诱导的荧光强度下降程度随geNOp表达水平升高而增加¹。因此，对geNOps信号进行归一化处理对于定量细胞内NO•信号至关重要，尤其是在进行比较分析时。正如我们最近的研究所示，在广泛的荧光强度范围内，geNOps的基础荧光强度与其NO•诱导的荧光淬灭强度之间存在严格的线性相关关系¹。这是geNOps实现细胞内NO•信号绝对定量的重要特性。如图1所示，G-geNOps信号在响应NOC-7和SNP时经归一化处理后，显示出同一批次不同HEK细胞中NO•信号的一致性，表明这些HEK细胞在摄取和降解NO•供体释放的NO•自由基能力方面并无差异。相比之下，在HeLa细胞中使用geNOps时，发现不同细胞对NOC-7的响应表现出明显的细胞NO•信号异质性。这些差异提示了细胞类型特异性的NO•代谢和分解速率，可能在细胞生理与病理过程中具有多重意义，而geNOps技术有助于揭示这些差异。

然而，在正确使用这些传感器并解释数据时，必须仔细考虑geNOps的两个重要特性：i) geNOps需要足够的亚铁离子（iron(II)）才能对NO•¹产生完全响应；ii) 根据所使用的荧光蛋白（FP）变体不同，geNOps可能对pH敏感¹。本文描述了一种已被证实适用于表达于HEK、HeLa或EA.hy926细胞中的geNOps进行无毒亚铁补充的方案（参见方案2.6）。尽管已有研究表明，用亚铁/维生素C处理细胞不会影响细胞形态、细胞活力及代谢活性¹，但对于其他细胞类型和组织，优化这一关键步骤可能是必要的。然而，在某些实验条件下，需要加载亚铁离子可能会限制geNOps的应用。值得注意的是，已有研究显示抗坏血酸（ascorbate）可还原NO•³⁵，而抗坏血酸-亚铁复合物能够清除NO•^36,37。此外，过量的亚铁和抗坏血酸可能诱发炎症反应³⁹并导致eNOS解偶联⁴¹。在使用geNOps技术时，必须考虑这些潜在影响。已有研究表明，在某些实验条件下，细胞内pH会发生显著变化³⁴，这可能会影响geNOps的荧光信号¹。值得注意的是，青色和绿色的geNOps变体对pH相对敏感，在酸化时荧光会下降¹。因此，当使用对pH敏感的geNOps时，细胞或亚细胞pH的急性变化可能模拟出假的NO•信号。正如我们先前研究所建议的，推荐并行使用对NO•不敏感的geNOps突变体（geNOps^mut）作为阴性对照，以区分真实的细胞NO•信号与pH变化所引起的信号¹。此外，可使用SypHer等pH探针来检测细胞内的pH变化³⁴。

此外，我们可视化了内源性酶促一氧化氮（NO•）在生理性 Ca²⁺ 刺激下的生成过程。²⁺在内皮细胞替代模型EA.hy926中具有动员作用的激动剂。EA.hy926细胞系是一种常用于研究的模型系统，可稳定表达eNOS³⁸. 利用在 EA.hy926 细胞中瞬时表达的 geNOps，证实了 IP₃介导的 Ca²⁺ 信号在此类细胞中引发强烈的NO•生成，而该过程几乎被L-NNA完全阻断。为了在时间上关联Ca²⁺ 与NO•信号同时，表达G-geNOp的细胞加载了紫外激发的化学Ca²⁺-指示剂 fura-2/am。Ca的光谱分离²⁺ 利用市售滤光片组即可轻松实现从G-geNOp信号中分离结合态与游离态fura-2的荧光⁴⁰. 同时成像两种探针揭示了Ca²⁺-触发的酶促NO•生成相较于胞质Ca²⁺的反应要缓慢得多²⁺ 此类牛肺动脉内皮细胞中单细胞NO•信号在细胞经IP处理后的动力学变化相似。₃- 有研究报道使用NOA-1（一种间接的高灵敏度NO•传感器）检测由激肽原酶生成的激动剂缓激肽以及剪切应力诱导产生的一氧化氮¹²因此，这些数据强调了Ca²⁺-eNOS 来源的 NO• 生成需要一定的起始时间才能达到完全的酶活性。尽管细胞内 NO• 的生成、扩散和降解动力学可从其他数据中提取， 例如 基于张力的NO•诱导血管舒张测量²⁶荧光NO•探针的最大优势在于能够实时将细胞内NO•的动态变化直接转化为可视信号。因此，利用geNOps成像细胞内NO•信号可实现高时空分辨率，并为重新研究（亚）细胞水平的NO•稳态提供了独特的机会。例如，成像eNOS的穿梭过程⁴² 结合geNOps技术，可在单个内皮细胞中将NO•的生成与NO•生成酶或其他相关蛋白（如钙调蛋白和小窝蛋白）的亚细胞定位及转位进行关联分析⁴³.

本文描述了在常规宽场荧光显微镜上，利用表达G-geNOp的HEK细胞和EA.hy926细胞在单细胞水平实时可视化外源性和内源性产生的一氧化氮（NO•）信号的可行应用。我们的数据表明，geNOp适用于在多种实验条件下，利用各种具有研究价值的细胞类型特异性追踪（亚）细胞内NO•的动态变化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄	3957.20	氯化钠
KCl	Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄	6781.1	氯化钾
CaCl2·2H2O	Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄	T885.1	二水合氯化钙
MgCl₂2·6H2O	Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄	2189.2	六水合氯化镁
HEPES	Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄	9105.3	4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
NaHCO₃3	Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄	8551.1	碳酸氢钠
KH2PO4	默克，德国达姆施塔特	104873	磷酸二氢钾
Na2HPO4·2H2O	Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄	4984.1	磷酸氢二钠二水合物
D(+)-葡萄糖一水合物	Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄	6780.1	>99.5%；用于细胞培养，无内毒素
EGTA	Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄	3054.2	乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N⁠,⁠N⁠,⁠N⁠′⁠,⁠N⁠′⁠四乙酸；钙螯合剂
NaOH	Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄	6771.1	氢氧化钠
HCl	Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄	4625.1	盐酸，发烟，37%（约10 N）
DMSO	Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄	4720.1	二甲基亚砜  高极性非质子有机溶剂
L-谷氨酸盐酸盐	Sigma Aldrich，奥地利维也纳	G2128	(S)-2-氨基戊二酸
DMEM，低糖	Sigma Aldrich，奥地利维也纳	D5523	杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 中等-低糖培养基；含1,000 mg/L葡萄糖和L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，粉末状，适用于细胞培养
MEM维生素溶液（100倍浓缩）	Gibco/Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	11120037	标准最低必需培养基（MEM）中维生素含量的100倍
MEM 氨基酸溶液（50 倍浓缩）	Gibco/Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	11130036	标准最低必需培养基（MEM）中所含必需氨基酸（L-谷氨酰胺除外）的50倍浓度
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Gibco/Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	15140122.00	抗生素以防止细胞培养的细菌污染
两性霉素B	Gibco/Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	15290026.00	Gibco 两性霉素 B 含有 250 µ两性霉素B（Fungizone）克数及205 µ克脱氧胆酸钠；防止酵母和多细胞真菌对细胞培养物的污染
FCS	Gibco/Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	10270106	胎牛血清，经鉴定合格，符合欧盟标准，南美来源
PBS，pH 7.4	Gibco/Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	10010031.00	磷酸盐缓冲液
Fura-2 (AM)	美国德克萨斯州奥斯汀市，Teflabs	102	荧光胞质钙离子指示剂
盐酸组胺	Sigma Aldrich，奥地利维也纳	H7250	2-(4-咪唑基)乙胺二盐酸盐；IP3生成型激动剂
Nω-N-硝基-L-精氨酸	Sigma Aldrich，奥地利维也纳	N5501	N5-(硝基亚氨基)-L-2,5-二氨基戊酸；L-NNA；  一氧化氮合酶抑制剂
NOC-7	Calbiochem/Merck，德国达姆施塔特	487952	3-(2-羟基-1-甲基-2-亚硝基肼基)-N-甲基-1-丙胺；一氧化氮（NO）供体，释放NO的半衰期短
二水合硝普钠	Santa Cruz Biotechnology，美国德克萨斯州	sc-203395A	亚硝基铁氰化钠(III)二水合物；一氧化氮释放化合物
30 mm 盖玻片	Karl Hecht，Sondheim v. d. Rhön，德国	41001130	玻璃盖玻片，HECHT "助理"，1号，圆形，直径30毫米，（VE：100个）
铁(II)增强液	下一代荧光成像（NGFI），奥地利格拉茨	未提供	含铁(II)的生理缓冲液，用于无毒性的细胞铁(II)负载  http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/
G-geNOp 质粒	下一代荧光成像（NGFI），奥地利格拉茨	未提供	编码绿色荧光蛋白的质粒DNA 一氧化氮敏感探针（G-geNOp）；  http://www.ngfi.eu/product/g-genop/
G-geNOp AAV5	下一代荧光成像（NGFI），奥地利格拉茨	未提供	编码绿色一氧化氮敏感探针的腺病毒（G-geNOp）；  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/
G-geNOp 传感器细胞系	下一代荧光成像（NGFI），奥地利格拉茨	无可用数据	稳定表达绿色一氧化氮敏感探针（G-geNOp）的人胚胎肾细胞系（HEK293）；  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/
HEK293A细胞系	Invitrogen/Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	R70507	人胚胎肾细胞系（HEK293）的亚克隆
EA.hy926细胞系	美国典型培养物保藏中心 (ATCC)，韦塞尔，德国	CRL-2922	人脐静脉细胞系与一株硫鸟嘌呤抗性A549细胞克隆的体细胞杂交克隆
TILL iMIC	Till Photonics，Graefling，德国	未提供	数码显微镜
多色V单色器	Till Photonics，Graefling，德国	未提供	超快切换
AVT Stingray F145B	Allied Vision Technologies，德国施塔特罗达	未提供	配备索尼 ICX285 EXview HAD 传感器的多功能 CCD 相机，IEEE 1394b
alpha Plan Fluar 40	Zeiss, Gö德国哥廷根	未提供	40倍物镜
二向色滤光片	Chroma Technology Corp，美国佛蒙特州罗金厄姆	无可用数据	GFP 发射光滤光片 514/3 nm (515dcxr)
ValveBank8 控制器	美国加利福尼亚州伯克利市，AutoMate Scientific, Inc.	01-08	可编程灌注系统控制单元
BVC 对照	Vacuubrand，德国韦尔泰姆	727200	化学隔膜泵 ME 1C；灌注系统用真空泵
ImageJ 软件	NIH Image		受NIH Image启发的Java图像处理程序。http://imagej.net/Welcome