使用荧光探针定量培养神经元中内体和溶酶体的运动性

摘要

研究膜运输对于理解神经元功能至关重要。本文介绍一种用于量化神经元中囊泡运动性的方法。该方法简便易行，可适用于神经系统中膜运输的量化分析。

摘要

在大脑中，膜运输系统在调控神经元功能方面发挥着重要作用，例如神经元形态、突触可塑性、存活以及胶质细胞间的通讯。迄今为止，已有大量研究表明，这些系统的缺陷会导致多种神经元疾病。因此，理解囊泡动态的潜在机制可能为治疗多种神经元功能障碍提供重要线索。本文介绍一种利用ImageJ平台的软件插件来定量分析囊泡运动能力的方法，例如运动距离和移动速率。为了获得用于定量分析的图像，我们使用EGFP标记的囊泡标志蛋白对神经元的内体-溶酶体结构进行标记，并通过延时显微镜观察囊泡的运动。该方法非常实用，可简化对神经元和胶质细胞的神经突（如轴突和树突）以及胞体中囊泡运动的测量。此外，该方法还可应用于其他细胞系，如成纤维细胞和内皮细胞。这一方法有望显著推动我们对膜运输过程的理解。

引言

内体-溶酶体运输的精确调控对于维持神经元功能至关重要。值得注意的是，这些囊泡的动态运动是调控神经元形态、发育和存活的关键因素。该系统的缺陷会导致严重的神经元疾病^1,2。囊泡运输与神经元疾病之间关联的分子机制被认为十分复杂，多个研究团队已致力于探索这种相关性。例如，已有研究报道，晚期内体运动功能障碍与尼曼-匹克C病显著相关³，这是一种由溶酶体缺陷引起的遗传性神经退行性疾病。另一个例子是溶酶体Ca²⁺通道trpml1的突变，该突变会损害溶酶体的运动性，导致溶酶体贮积病^4,5,6。我们课题组曾报道，PtdIns(3,5)P₂代谢周转的失调会抑制神经元中内体和溶酶体的运动性，从而增加对应激反应的易损性^7,8。PtdIns(3,5)P₂的代谢调控主要发生在晚期内体和溶酶体上，在多种细胞功能中发挥重要作用，包括囊泡运输以及融合-分裂过程^9,10。由于PtdIns(3,5)P₂周转受损会引起严重的神经退行性病变^11,12，因此内体-溶酶体运动性的异常调控可能是理解神经退行性疾病发病机制的关键因素。因此，对囊泡运动性潜在分子机制的研究可能为深入理解多种神经元疾病提供有价值的线索。

本文介绍了一种利用免费软件“Manual Tracking”来定量分析神经元中囊泡运动的有效方法。该方法旨在建立一种快速的定量分析流程，以研究囊泡的运动特性。该定量方法通过在延时成像视频的每一帧中点击一个参考点，按照标准操作流程进行。Manual Tracking 软件的使用使该方法变得极为简便且具有广泛的适用性，与其他应用相比更具优势。此外，该方法也可应用于其他类型的细胞，例如胶质细胞。尽管该方法较为基础，但仍可适用于多种分析，包括细胞运动性和形态变化的研究。例如，在一系列图像中定义参考点后，可通过数据分析和图像处理软件从连续图像中提取各参考点的位置信息及其对应的时间点。综上所述，该方法简便而强大，有助于提高基于膜 trafficking 研究（如内体-溶酶体功能研究）的工作效率。

方案

所有动物实验均经筑波大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 解剖

1. 为准备胚胎第13-14天的ICR或C57BL/6胎鼠，通过颈椎脱臼法处死怀孕小鼠。取出子宫并放入含有Hank's平衡盐溶液（HBSS）的培养皿中，充分冲洗以去除血液。
2. 使用镊子将子宫转移至另一含有70%乙醇的培养皿中进行消毒。
3. 将子宫转移至另一含有HBSS的培养皿中，使用无菌解剖镊和手术剪从子宫中取出胎鼠。
4. 使用手术剪将胎鼠断头，并将其放入含有HBSS的新培养皿中。
5. 去除皮肤和颅骨，使用无菌解剖镊取出脑组织，并放入含有HBSS的培养皿中。
   注意：从本步骤开始，最好在洁净台中进行操作。
6. 在体视显微镜下使用无菌解剖镊去除脑膜，用镊子切除基底节、海马和小脑。使用弯头镊将大脑皮层转移至含有HBSS的新培养皿中。
7. 使用一次性移液器或25 mL移液管收集所有皮层组织，放入15 mL离心管中，然后用移液器吸除HBSS。
8. 向含有皮层组织的离心管中加入3 mL大脑皮层酶消化液，将离心管置于水浴中，37 °C孵育5分钟。
   注意：配制含有0.25%胰蛋白酶和1 mM EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）作为大脑皮层培养用酶溶液，并用0.22 µm滤器过滤除菌。
9. 向含有皮层组织的离心管中再加入3 mL大脑皮层酶消化液，继续在37 °C水浴中孵育5分钟。
10. 用5 mL移液器吸除大脑皮层酶消化液，加入5 mL含10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。
11. 使用带有无菌P1000枪头的5 mL移液器轻轻吹打，使皮层组织解离；再使用带有P200枪头的5 mL移液器再次吹打。
12. 将40 µm尼龙细胞筛置于50 mL离心管上，过滤细胞悬液以去除碎片。
13. 在室温下以420 × g离心5分钟，然后吸除DMEM培养基。
14. 加入5 mL大脑皮层培养液，轻轻重悬细胞沉淀。
    注意：配制大脑皮层培养液，成分为神经元基础培养基（neuron basal medium），添加1× B-27补充剂、2 mM L-谷氨酰胺和100 U/mL青霉素-链霉素。
15. 使用血细胞计数板计数细胞，并用大脑皮层培养液调整至所需细胞浓度。
16. 将3.0 × 10⁶个皮层神经元接种于2.0 mL培养液体积中，接种至预先包被的35 mm玻璃底培养皿中。
    注意：接种前，使用0.1 mg/mL多聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL）或0.01%多聚-L-鸟氨酸（PLO）包被35 mm玻璃底培养皿，在37 °C孵育3小时至过夜，然后用PBS洗涤至少3次。

2. 囊泡运动成像

1. 准备用于标记每种类型囊泡的质粒。例如，使用 EGFP-Rab5 标记早期内体，EGFP-Rab7 标记晚期内体，LAMP-EGFP 标记溶酶体，EGFP-LC3 标记自噬体^8,13.
   注意：这些质粒可应要求从 tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp 获取，通常需要 3 至 5 天 体外 （DIV）神经元可使用转染试剂对这些质粒进行转染。
2. 将4.0 µg质粒用移液器与200 µL无血清培养基混合。在另一管中，将8 µL转染试剂（参见 材料表在200 µL无血清培养基中重悬，室温孵育5分钟。
3. 用移液器将2.2步骤中的质粒溶液与转染试剂溶液混合，室温孵育20分钟。
4. 向每个包被的玻底培养皿中加入无血清培养基和400 µL步骤2.3中的质粒溶液。将神经元在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂ 孵育30分钟。将培养基更换为2 mL大脑皮层神经元培养基，在37 °C、5% CO₂条件下继续孵育神经元₂ 培养箱中孵育1-2天。
5. 转染后1-2天，筛选转染细胞用于图像采集。
   注意：培养时间少于7天的未成熟神经元（7 DIV以下）囊泡运动较为活跃。应选择荧光探针表达水平适中的神经元，因为高表达的神经元难以获得清晰的图像。此外，应选择具有典型形态的神经元（如锥体神经元），其具有较长的轴突和复杂的树突结构，便于轴突与树突的识别（参见 图1A).
6. 使用延时成像系统进行图像采集：
   使用配备CCD相机的荧光显微镜进行成像，物镜选择40倍Plan Apo 0.95NA或100倍Plan Apo VC NA1.4。通过培养系统将温度控制在37 °C。使用图像采集软件控制，在100秒时间内以每5秒一帧的速度采集神经元图像。或者，也可采用更短的时间间隔和更长的成像时程，例如每2秒一帧，持续300秒。
   注意：可用于拍摄连续图像的应用程序有多种，其中许多均适用于本方法。因此，不特别推荐任何特定应用程序，研究人员应使用手头可用的任意应用程序。

3. 图像分析

1. 在 ImageJ 软件中手动打开所有连续图像进行追踪¹⁴.
   注意：迄今为止，手动追踪已广泛应用于追踪实验中^{15,16,17,18,19}手动追踪技术由Fabrice Cordelières博士开发。详细的书面操作指南可在线获取。²⁰为提高成像数据的质量，建议采集足够数量的图像用于分析，推荐使用超过20幅图像。
2. 要合并序列图像，请选择 <图像> → <堆叠> → <图像堆叠>. 点击 <好的>.
3. 选择 <插件> → <手动追踪>; 将弹出一个追踪窗口。
4. 点击复选框 <显示参数？> 并在参数部分定义追踪参数。
   注意：可设置多个参数，包括时间间隔、x/y 校准、z 校准、中心定位搜索方框大小、点大小、线宽和字体大小。在此简化的实验中，已定义时间间隔和 x/y 校准。在其他实验条件下，可能还需定义其他参数。此处使用的参数如下：时间间隔和 x/y 校准 <时间间隔> 是 5 s，且 <x/y 校准> 对于40倍平场复消色差0.95数值孔径物镜为0.26642 µm，对于100倍平场复消色差VC NA1.4物镜为0.10657 µm。
5. 在定义参数后，单击 <添加轨迹> 开始一条新轨迹。
6. 在确定目标囊泡后（例如， 由蓝色和红色箭头指示的囊泡 图1A （右侧面板），在连续图像中点击信号的中心以记录xy坐标。记录的xy坐标、距离和速度结果将显示在新窗口中。
   注意：对于溶酶体而言，会出现较大的明亮荧光信号（例如， 图1A （右侧面板，橙色箭头）在神经元中常被观察到。由于这些信号偶尔会表现出聚集的囊泡或病理性的串珠样膨大，因此在量化运动性时应避免使用这些信号。
7. 重复步骤3.6，从所有连续图像中采集囊泡的xy坐标；每次选定参考点后，图像将自动切换至下一幅。
8. 将这些数据导出到一个新表格中（例如， 电子表格）。使用适当的软件创建合适的图表（参见 材料表).
   注意：为分析数据，请选择 <距离> 柱，对该列所有数值求和，并以柱状图形式展示运动距离，如 图1B此外，重复此步骤，计算总运动距离的平均值，并以柱状图形式展示，如 图1C用于创建柱状图和波形数据的软件如图所示 材料表

结果

该实验旨在测量囊泡动力学 体外 培养。该检测用于确定与神经元形态及存活相关的囊泡运动性。 图 1A 和 B 展示神经元中溶酶体运动的代表性数据。皮层神经元转染了溶酶体标记物 LAMP-EGFP，并使用标准荧光显微镜进行观察。已有文献报道，特定的内体-溶酶体囊泡即使在静息状态的神经元中也具有高度移动性。⁸确实，这些结果展示了同一条树突中静止和运动的囊泡图1A 和 B）。通常情况下，静息状态的囊泡在神经元树突中表现出类似布朗运动的振动性运动。相比之下，运动中的囊泡则呈现不规则的移动行为。我们推测，每种囊泡可能具有不同的组分特征，这种特征决定了其功能，即使在溶酶体囊泡中也是如此。⁸因此，利用该方法对囊泡进行分类可能提供有用的信息。使用该系统，可轻松量化这些囊泡的平均运动性。

讨论

本方案介绍了囊泡运动性的定量分析步骤。在原代神经元中，早期内神经元（4-6 天体外培养）的内体和溶酶体通常表现出较高的运动性。由于神经元需要将某些组分运输至生长前沿以延长神经突，因此在此阶段膜运输应处于动态进行状态。因此，使用较年轻的神经元观察神经元树突中的动态运动性尤为重要。此外，即使在较年轻的神经元中，较大的囊泡通常也不易表现出高运动性。囊泡大小的调控可能与融合-分裂过程的发生频率相关。有可能某些本身运动不活跃的特定囊泡更容易接受其他囊泡，从而终止其运动。因此，囊泡的选择是本分析中的一个重要步骤。

目前有多种免费的插件软件可用于物体追踪²¹。例如，TrackMate 插件能够追踪物体²²，并可通过数值软件进行修改，提供一系列数学信息。然而，对于本实验方案中相对简单的图像分析而言，该插件的使用略显复杂。Mtrack2 是另一款插件，基于 MultiTracker 插件开发²³。Mtrack2 同样具有实用性，因其能够识别目标，并确定后续帧...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal 培养基	Thermo Fisher	21103-049
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Wako	044-29765
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985070	无血清培养基
汉克平衡盐溶液（HBSS）	Thermo Fisher	14170112
青霉素-链霉素	Thermo Fisher	15140122
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher	25030081
B-27 添加剂	Thermo Fisher	17504044
2.5% 胰蛋白酶	Thermo Fisher	15090046
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL）	Sigma	P7280
聚-L-鸟氨酸（PLO）	Sigma	P4957
尼龙细胞筛	Corning	431750
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027	转染试剂
聚乙烯亚胺 "Max"（PEI）	polysciences	24765	转染试剂。可作为 Lipofectamine 2000 的替代品，使用 0.1 mg/mL 聚乙烯亚胺溶于无菌水中。但其转染效率较低且毒性较高。
BIOREVO BZ-9000	Keyence	NA
培养系统 INUG2-K13	Tokay Hit	NA
GraphPad Prism 6.0 版	GraphPad Software	NA
Excel 15 版	Microsoft	NA
ImageJ 1.47 版	NA	NA