评估小鼠一般运动、肌肉力量与协调性的行为学测试组合

摘要

在临床前试验中，行为学测试用于评估疾病或治疗对动物健康状况的表型效应。为了全面评估运动功能，我们分别选择了用于检测一般运动能力、肌肉力量和协调性的测试方法：开放场测试、网格测试和转棒测试。

摘要

行为学测试在临床前试验中用于评估特定疾病或治疗对动物健康和福祉所产生的表型效应和结果。可采用多种行为学测试方法。我们选择了一种用于评估一般运动能力的开放旷场测试（open field test, OFT）；一种用于评估肌肉力量的网格悬挂测试（mesh test, MT）；以及一种用于评估协调性的转棒测试（rotarod test, RR）。测试可按周或按月进行。作为评估一般运动能力的方法，OFT通过客观监测小鼠在开放旷场装置中活动时的运动参数来实现。该装置通常是一个2英尺×2英尺的箱体，通过激光感应或视频记录系统记录动物的运动轨迹。将小鼠置于旷场中央，使其在测试期间自由活动。MT则通过测量小鼠从倒置的网格上跌落所需的时间（即跌落潜伏期）来评估其肌肉力量。将小鼠放置于网格表面，随后将网格倒置于透明箱体上方，记录其跌落前的持续时间。每只小鼠进行三次试验，取当日三次中最佳成绩作为评分。小鼠倒置状态的最长时间上限为60秒。每次网格测试之间给予小鼠5分钟的休息时间。最后，采用加速程序的RR测试用于评估运动协调性和耐力。在单次试验中，转棒转速在5分钟内从4 rpm匀速增加至40 rpm，小鼠在转棒上行走直至跌落。当小鼠跌落并接触磁性压力传感器时，试验自动终止。每只小鼠进行三次试验，取当日三次中最佳成绩作为评分。这些综合行为学数据可用于全面评估实验动物的活动能力、协调性、力量及运动表现。只有在三项行为学测试指标中至少有两项显示出改善时，才可判定该动物的整体运动功能有所提升。

引言

行为学测试的目的是测量表型特征，无论是在研究影响中枢神经系统的新小鼠疾病模型，还是在新治疗方法的试验中均如此。可选择的行为学测试种类繁多。通常采用多种行为学测试组合的理由是全面评估临床前治疗效果。本文所采用的行为学测试组合包括开放场地测试（OFT）、网格测试（MT）和转棒测试（RR）。

开放场实验（OFT）被用作评估一般运动活性的指标^{1,2,3,4,5,6,7}。该评估允许小鼠在开放环境中自由活动，测量指标为行为实验过程中小鼠的运动情况。利用OFT进行的定量分析包括直立行为、移动距离、运动时间（例如，行走和奔跑）以及随时间变化的活动模式（例如，跳跃和运动减缓/过度活跃行为），因此OFT是一种对啮齿类动物行为进行有效且全面的分析方法。

悬尾试验（MT）用于评估小鼠的肌力^{1,2,8,9,10,11}。通过让小鼠用四肢悬挂在金属丝网格上，可无创地测量其在对抗重力作用时维持肢体张力的能力。该评估方法是将小鼠置于倒置的网格上，记录其坠落前的潜伏时间。该试验通过测量小鼠在坠落前能够抓住倒置网格的时间长短，来评估其肌肉力量。

转棒实验（RR）通过加速程序评估小鼠的运动协调能力^{1,2,7,8,9,12,13}。转棒装置由一根在空中旋转的圆柱形滚轴组成，起始转速为 4 rpm。小鼠可学习此项运动协调技能，并在转速缓慢、逐步增加至 40 rpm 的过程中接受挑战。传统上，恒定速度程序用于评估肌肉力量，而转棒实验中的加速程序则用于评估协调性、耐力和肌肉力量^1,2,7,14。

这三种行为学实验的优点在于，它们在整个啮齿类动物行为测试领域被广泛接受^2,7,8,9，当不仅将它们视为各个独立实验结果的简单加总，而是综合起来使用时，可用于在研究不同实验处理结果时对表型行为进行整体评估。旷场实验（OFT）是目前仅有的可用于评估总体运动活性的实验方法之一²。旋转棒实验（RR）也是评估协调能力的少数方法之一²，除此之外的方法包括步态分析软件，但后者不在本文讨论范围内。评估小鼠肌肉力量的方法有数种，但握力测试（MT）或悬丝实验在文献中被广泛采用，并被公认为测试肌肉力量的可靠方法^2,8,9,10,11。许多其他用于测量总体运动和协调能力的技术极为耗时，且可能无法产生可靠的数据（例如，手动计时小鼠运动或手动染色足垫进行步态分析）。旷场实验和旋转棒实验的自动化系统提高了所获得数据的可靠性和有效性，同时节省了时间和精力。

例如，鉴于Sandhoff病小鼠模型存在神经退行性病变，在进行这一系列测试时，开放场测试（OFT）应作为首个测试，用于评估该小鼠模型通常从3月龄开始出现的运动异常。运动协调能力的缺陷也应从12周龄起开始显现。肌肉力量的缺陷大约在14周龄时开始出现，但在16周龄时会变得更为显著。

这些检测方法在研究导致显著运动功能障碍的疾病时非常有用，包括神经退行性疾病⁹，例如Sandhoff病^1,8,13、帕金森病⁷、亨廷顿病、多发性硬化症。这些检测还可用于研究衰老过程，以及进行老年学的比较评估或健康状况测量。许多此类疾病状态下均可观察到步态异常以及运动和平衡能力的改变。然而，这些检测方法的应用价值并不仅限于以常见神经肌肉症状为特征的疾病。

请注意，目前尚未发现与动机或所述行为测试方法的新颖性相关的任何混杂因素。对于某些疾病状态和病理情况，研究人员必须在小鼠出现任何表型症状之前获取初步的行为学数据；此后应定期（每周）确认所有运动功能障碍是否均已记录。许多疾病的表型症状出现迅速，若不进行每周测试，这些症状将无法被及时发现和记录。

方案

本文所述所有实验方案均依照女王大学动物护理委员会的规定进行，并已获得该委员会的批准。行为学测试的频率可以为每周一次、每月一次，或两者结合使用。即， 每周一次（在预期差异最大时），其余时间每月一次。

注意：小鼠行为学研究在很大程度上依赖于性别、年龄和品系，因此必须采集适当的时间点，并在各实验组间保持一致。环境因素（例如， 气味、噪音、温度、湿度、光照 等等。) 对小鼠的行为和焦虑水平有显著影响。应尽可能减少这些环境因素。

1. 开放旷场实验

注意：在进行行为学测试之前，应让动物在测试房间内适应环境 10 - 15 分钟。进行行为学测试时，须遵守适当的个人防护装备要求以及所有当地机构的相关操作规范。

注意：测试前无需培训。

1. 确保计算机和OFT程序已开启、正常运行，并正确连接到摄像头或敞箱装置。点击smartware程序、敞箱图标和"OK"。在摄像头选项中选择"digital analog converter"作为信号源。点击"detection"，确保整个敞箱区域均被可视化，且尺寸设置为30 cm × 30 cm。
   注意：设备布局可能因空间限制而有所不同，但应确保计算机与敞箱装置位于光线充足的同一房间内并彼此靠近，以保证视频采集质量。
2. 点击"calibration"、"snapshot"，然后点击"OK"，以确认小鼠在敞箱范围内可被系统正确检测。点击"time"预设测试时间；本实验中设定为5分钟。
3. 点击"subjects"图标输入受试动物信息。点击"scheduler"，选中所有待测动物，然后点击双绿色箭头和"phase one, session one"；此操作将按顺序导入所有受试动物，以便开始数据采集。
4. 将一只小鼠放置于敞箱中央，然后点击"start"图标，启动程序开始记录。每次仅测试一只小鼠。
5. 当5分钟测试时间结束后，程序将自动进入下一个受试动物。此时，取出已完成测试的小鼠，并将下一只受试动物放入敞箱中，然后点击"start"。
6. 清洁设备。对剩余的受试动物重复步骤1.3至1.4。
7. 在所有受试动物完成测试后，若需分析数据，请点击屏幕右上角的"analyze"图标。再次点击"analyze"，然后选择"summary report"。也可选择将数据导出至U盘。

2. 网格测试

注意：MT上的网面面积和网孔大小可能影响实验结果。在MT测试中，若小鼠在前两个采集时间点的最初10秒内掉落，则应立即将其放回网面上进行第二次尝试。本实验所用网面为金属丝网，网孔直径约为1.5 mm。

注意：建议在每天的同一时间进行这些测试，因为生理和生化参数在一天中会有所波动。体重可能影响本测试中的表现，因此必须予以考虑。

1. 将小鼠置于网格中央，将网格翻转，使其倒置在透明容器上方至少20 cm处。翻转后立即启动计时器。
2. 记录小鼠跌落前的潜伏时间。若小鼠在60秒内未跌落，则记为60秒，并停止后续试验。让小鼠休息至少5分钟。此为第一次试验结束。
3. 擦拭设备，并在5分钟的试验间歇期间，如有需要，可对第二只小鼠进行测试。如有必要，重复步骤2.1–2.2进行第二次和第三次试验（只要小鼠未获得60秒评分，应进行三次试验）。

3. 旋转棒实验

注意：旋转棒（RT）上的杆的表面和直径可能影响实验结果。在旋转棒实验中，如果小鼠在前两个采集时间点的最初10秒内掉落，应立即将其放回杆上进行第二次尝试。

注意：建议在每天的同一时间进行这些测试，因为生理和生化参数在一天中会有所波动。体重可能影响本测试中的表现，因此必须予以考虑。

1. 打开IITC转棒仪和计算机，确保它们已正确连接以进行数据记录。
2. 确保程序运行的是加速模式。将转棒实验的设定时长设为xxx（有效范围为000至999）；在此情况下，按300*。设定使用的通道数为xxx（有效范围为001至005）；在此情况下，按005*。设定起始转速为xxx rpm（输入3005表示5 rpm；有效范围为001至045）；在此情况下，按004*。
3. 设定最高转速为xxx rpm（输入4,030表示30 rpm；有效范围为001至045）；在此情况下，按040*。设定加速时间为xxx秒（输入5,030表示在30秒内达到最高转速；有效范围为000至999）；在此情况下，按300*。将设备模式设为小鼠模式（输入6001表示小鼠正向旋转，6002表示小鼠反向旋转）；在此情况下，按6001*。
4. 开始实验前，确保所有磁化通道保持平衡。将每只小鼠放入转棒仪的一个通道中。
5. 按下“开始”以启动程序。当小鼠掉落时，应立即将其从通道中移除，以确保它们不会"绊倒"其他通道的小鼠。
6. 让小鼠休息10分钟作为组间间隔。至此完成第一次试验。在组间间隔期间，清洁设备并开始下一组小鼠的试验。
7. 根据需要重复步骤4至6。若某只小鼠在完整的5分钟试验期间始终停留在转棒上，则该小鼠无需再进行后续试验。

结果

可根据分析所需的时间点，每周或每月对实验动物进行一次行为学测试范式。有关行为学测试时间安排的示例，请参见图1。以下代表性数据来自 Osmon et al. (2016)，小鼠从12周龄开始每月接受一次系列行为学测试，直至约40周龄达到人道终点。行为学测试的时间安排在某些实验中可能至关重要，尤其是当未处理组与处理组动物的存活时间存在显著差异且需要进行比较时。

尽管这些测试并非仅用于神经退行性疾病，我们仍使用了Sandhoff小鼠（见图2）。该小鼠模型若未经治疗，在12至16周龄时会逐渐出现震颤和运动失调，并通常需在16周龄时实施安乐死¹。图2D中的数据展示了转棒实验用于评估经治疗小鼠与正常杂合子小鼠行为表现的差异。两组在40周时的分离表明，治疗组小鼠的协调能力开始较正常对照组下降。在其他用...

讨论

所有实验均需对表面进行清洁和消毒，以尽量减少对小鼠的感染和干扰因素。 此外，在使用开放旷场实验（OFT）、右转实验（RR）和新物体识别实验（MT）时，须确保小鼠在各次试验之间以及不同行为测试之间有充足的休息时间。

在开放旷场实验（OFT）中，必须将每只小鼠放置在旷场中央，并在将小鼠释放至中心位置的同时启动程序。启动程序时，应确保没有手部动作被传感器检测到。

对于悬尾实验（MT），在小鼠悬挂的网面区域与容器侧壁之间设置屏障非常重要。有研究指出，当小鼠能够触及容器侧壁时，它们会逐渐松开前爪，随后松开后爪，从而跳下。在网面中心与容器壁之间粘贴屏障可显著减少这种行为，从而更准确地测量肌肉力量。

单独来看，这些测试分别能很好地评估一般运动能力（开放旷场实验）、肌肉力量（网格实验）和协调性（转棒实验）^2,7,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IITC生命科学转棒仪，配备Series 8计算软件	IITC生命科学	755
方形开放旷场 45 × 45 × 40 cm（灰色）。其他地面颜色可选：白色、黑色。	哈佛仪器（PanLab）	760190
开放场预设模块	Harvard Aparatus (PanLab)	760688
Smart V3.0 软件平台	Harvard Aparatus (PanLab)	760681
视频转换器（模拟/数字）	Harvard Aparatus (PanLab)	760262
摄像机屋顶固定系统	哈佛仪器（PanLab）	760277
模拟索尼摄像机 & lenseNTSC	哈佛仪器（PanLab）	760505