对眼循环中标记的血细胞进行活细胞成像，可提供有关糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性中炎症与缺血的信息。本文描述了一种标记血细胞并在视网膜循环中对这些标记细胞进行成像的实验方案。
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方法文章
荧光染料标记红细胞和白细胞以研究小鼠视网膜循环中的血流动力学
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
视网膜和脉络膜的血流动力学可能为青光眼、糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性（AMD）及其他眼部炎症性疾病等多种眼病的病理生理机制及继发性改变提供重要线索，同时也可用于监测眼部治疗反应。通过适当地标记血细胞，并结合活细胞成像技术对标记细胞进行观察，可实现对视网膜和脉络膜循环中血流动力学的研究。本文描述了使用1.5%吲哚菁绿（ICG）和1%荧光素钠分别标记小鼠红细胞和白细胞的标准化操作流程。采用扫描激光检眼镜（SLO）对C57BL/6J小鼠（野生型）视网膜循环中的标记细胞进行可视化观察。两种方法均能在小鼠视网膜循环中清晰显示荧光标记的细胞。这些标记方法可在多种眼科疾病模型中具有更广泛的应用前景。
引言
研究视网膜和脉络膜循环中血细胞的流动动力学，对于理解可能威胁视力的眼部疾病及其他眼部炎症性疾病的发病机制至关重要。然而，传统的血管造影技术依赖荧光染料与血浆蛋白结合，无法提供有关红细胞或白细胞动力学的任何信息1。红细胞在视网膜中的流动动力学对于研究视网膜代谢高效的血液循环具有重要意义，而白细胞的流动动力学则有助于理解在各种炎症条件下细胞的迁移、识别、黏附和破坏过程2。目前已有多种荧光分子被用于不同类型细胞的鉴定与表征3。通过使用适当的荧光染料对血细胞进行染色，并结合合适的成像技术，可实现对血细胞血流动力学的测量4。
年龄相关性黄斑变性（AMD）和糖尿病视网膜病变（DR）等眼内疾病中的炎症反应涉及淋巴细胞在病变区域的积聚5,6追踪组织中的免疫细胞有助于理解疾病发病机制中涉及的复杂事件。放射性同位素如 51铬和 125在早期研究中被用作细胞示踪剂。这些染料具有毒性，会影响细胞活力。尽管放射性标记物 3H 和 14C 的发射能量较低，因此对细胞的毒性较小，但在系统中难以检测其信号
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方案
本研究中使用的动物实验方案已获得新加坡SingHealth机构动物护理和使用委员会的批准，并遵循眼科和视觉研究中动物使用方面的视觉与眼科研究协会（ARVO）声明指南。
1. 使用荧光染料标记红细胞和白细胞
- 试剂的制备
- 将3 mg ICG溶解于1800 µL无菌蒸馏水中，配制ICG（1.5 mg/mL）溶液。加入200 µL 10倍磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 将4 mL 1×PBS加入6 mL无菌蒸馏水中，配制40% 1×PBS。将100 mg牛血清白蛋白（BSA）加入10 mL 1×PBS中，配制1% BSA的PBS溶液。充分混匀，直至BSA完全溶解。
- 利用密度梯度离心法分离红细胞和白细胞
- 使用盐酸氯胺酮（50 mg/kg）和盐酸赛拉嗪（0.5 mg/kg）联合麻醉小鼠（野生型C57BL/6）（根据ARVO指南中的附表1进行）。通过足底回缩反射确认麻醉效果即，脚趾挤压。
- 缓慢将连接1 mL注射器的29号针头从肋角处插入，方向朝向心脏。为确认针头位于心脏内，可轻轻回抽活塞，观察是否有血液进入注射器。直接从心脏采血0.8–1 mL。
- 立即将血液转移至含有乙二胺四乙酸（EDTA）（每毫升血液1.8 mg）的采血管中，轻轻混匀，防止血液凝固。 <....
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结果
在C57BL/6J小鼠（野生型）的视网膜循环中观察到用1.5% ICG标记的红细胞。在视网膜循环中，1%和5% hematocrit的1.5% ICG标记红细胞均可被区分。然而，使用1% hematocrit的1.5% ICG标记红细胞时，单个标记细胞的可视化更为清晰（图1）。在5% hematocrit条件下，由于视网膜血管中标记细胞数量较多，无法识别单个细胞。在两种条件下，视盘周围区域均观察到一定程度的红细胞淤滞，但在5% hematocrit的标记红细胞中更为明显（图2）。
按照上述方案，白细胞成功地用1%荧光素钠标记，并通过荧光显微镜观察到呈绿色荧光标记的细胞（图3）。在标记样本中还观察到少量细胞团块（4–5个细胞聚集在一起）。将细胞注入小鼠血液循环后，可在视网膜循环.......
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讨论
研究视网膜和脉络膜循环中的血流动力学对于理解多种眼病的病理生理机制至关重要。视网膜循环中的血流动力学可通过傅里叶域光学相干断层扫描（FD-OCT）、激光散斑血流成像（LSFG）和视网膜氧饱和度测定法进行研究。尽管这些方法采用不同的技术手段来评估视网膜循环中的总血流量40,41,42,43,44,45，但它们均存在无法研究各类血细胞流动动力学的局限性。通过分别研究视网膜和脉络膜循环中红细胞与白细胞的流动动力学，可深入了解视网膜和脉络膜组织的营养与氧气供应情况，以及在眼部炎症性疾病中免疫细胞的迁移过程及其在疾病发病机制中的作用。结合成像技术的标记方法有助于追踪循环中标记的细胞，并研究这些标记细胞的流动动力学。已有多种荧光染料成功用于标记白细胞和红细胞.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。无财务或利益冲突。
致谢
本研究项目由新加坡国家医学研究理事会（NMRC）的新研究员资助计划资助。研究团队希望感谢阿格拉瓦尔博士在2012年11月至2014年10月期间，在国家医学研究理事会（NMRC）海外研究培训奖学金支持下，于伦敦大学学院（UCL）眼科研究所（IoO）接受的研究培训。在大卫·希马教授的指导下，阿格拉瓦尔博士在希马博士的实验室中掌握了细胞标记和活体成像的概念与技术。因此，研究团队希望感谢在培训期间大卫·希马教授、肯尼斯·梅斯纳教授、彼得·伦德博士和岩田大寿博士所提供的指导与监督。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 心绿多甲川染料（吲哚菁绿） | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| 荧光素 100 mg/mL | 诺华 | U1705A/H-1330292 | |
| 10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）超纯级 | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| 含K2E（K2EDTA）的微量离心管 - EDTA浓度：每毫升血液1.8 mg | BD, USA | REF 365974 | |
| Histopaque 1077 溶液 | Sigma Aldrich | 10771 | |
| 5810 R型离心机 | 艾本德 | 05-413-401 | |
| 2 mL 微量离心管 | Axygen | MCT-200-C-S | |
| 涡旋混合器 | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| 摇床培养箱 | Lab Tech | ||
| 赛法氯胺酮注射液（盐酸氯胺酮 100 mg/mL） | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20（盐酸赛拉嗪 20 mg/mL） | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% 美多丽 15 mL（托吡卡胺 1%） | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
| 2.5% 美芬 5 mL（盐酸去氧肾上腺素 2.5%） | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
| Terumo 结核菌素注射器（带针头，1 cc/mL） | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
| 维地西克凝胶 10 G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
| 酒精棉片 | Assure 医用耗材 | 7M-004-L-01 | |
| 共聚焦激光扫描血管造影系统（海德堡视网膜血管造影仪2型） | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| 海德堡 Spectralis 观察模块软件，v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| 荧光显微镜 | ZEISS | 型号：axio imager z1 |
参考文献
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent lab....
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重印与许可
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