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方法文章

荧光染料标记红细胞和白细胞以研究小鼠视网膜循环中的血流动力学

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DOI：

10.3791/55495

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2017年7月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Healthcare Group Eye Institute, Tan Tock Seng Hospital, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore National Eye Center, 3School of Material Science and Engineering, Nanyang Technological University, 4Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University Health Systems, National University of Singapore, 5Ophthalmology Academic Clinical Research Program, DUKE-NUS Graduate Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

对眼循环中标记的血细胞进行活细胞成像，可提供有关糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性中炎症与缺血的信息。本文描述了一种标记血细胞并在视网膜循环中对这些标记细胞进行成像的实验方案。

摘要

视网膜和脉络膜的血流动力学可能为青光眼、糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性（AMD）及其他眼部炎症性疾病等多种眼病的病理生理机制及继发性改变提供重要线索，同时也可用于监测眼部治疗反应。通过适当地标记血细胞，并结合活细胞成像技术对标记细胞进行观察，可实现对视网膜和脉络膜循环中血流动力学的研究。本文描述了使用1.5%吲哚菁绿（ICG）和1%荧光素钠分别标记小鼠红细胞和白细胞的标准化操作流程。采用扫描激光检眼镜（SLO）对C57BL/6J小鼠（野生型）视网膜循环中的标记细胞进行可视化观察。两种方法均能在小鼠视网膜循环中清晰显示荧光标记的细胞。这些标记方法可在多种眼科疾病模型中具有更广泛的应用前景。

引言

研究视网膜和脉络膜循环中血细胞的流动动力学，对于理解可能威胁视力的眼部疾病及其他眼部炎症性疾病的发病机制至关重要。然而，传统的血管造影技术依赖荧光染料与血浆蛋白结合，无法提供有关红细胞或白细胞动力学的任何信息1。红细胞在视网膜中的流动动力学对于研究视网膜代谢高效的血液循环具有重要意义，而白细胞的流动动力学则有助于理解在各种炎症条件下细胞的迁移、识别、黏附和破坏过程2。目前已有多种荧光分子被用于不同类型细胞的鉴定与表征3。通过使用适当的荧光染料对血细胞进行染色，并结合合适的成像技术，可实现对血细胞血流动力学的测量4。

年龄相关性黄斑变性（AMD）和糖尿病视网膜病变（DR）等眼内疾病中的炎症反应涉及淋巴细胞在病变区域的积聚5,6追踪组织中的免疫细胞有助于理解疾病发病机制中涉及的复杂事件。放射性同位素如 51铬和 125在早期研究中被用作细胞示踪剂。这些染料具有毒性，会影响细胞活力。尽管放射性标记物 3H 和 14C 的发射能量较低，因此对细胞的毒性较小，但在系统中难以检测其信号7,8引入了多种荧光染料，以克服与放射性标记相关的潜在问题，并追踪淋巴细胞迁移 体外 使用荧光显微镜和流式细胞术9,10Hoechst 33342 和硫代橙是DNA结合型荧光染料，用于追踪淋巴细胞 体内 Hoechst 33342 可结合 DNA 中富含 AT 的区域，具有膜通透性，荧光信号可维持 2 - 4 天，且抗淬灭9,10Hoechst 33342 和噻唑橙的缺点是会抑制淋巴细胞增殖11 以及较短的半衰期9.

钙黄绿素-AM（Calcein-AM）、荧光素二乙酸酯（fluorescein diacetate，FDA）、2′,7′-双(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素乙酰氧基甲酯（BCECF-AM）、5-(和-6)-羧基荧光素二乙酸酯（CFDA）以及5-(和-6)-羧基荧光素二乙酸酯乙酰氧基甲酯（CFDA-AM）是用于淋巴细胞迁移研究的胞质荧光染料。然而，FDA、CFDA和CFDA-AM在细胞中的滞留能力较低9BCECF-AM 降低增殖反应，并影响趋化性和超氧化物的产生9,12. 钙黄绿素-AM 是一种荧光染料，适用于短期标记 体内 淋巴细胞迁移研究。它能发出强烈的荧光信号，不干扰大多数细胞功能，并可维持荧光信号长达3天12,13荧光素异硫氰酸酯（FITC）和羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE）是共价结合的荧光染料，用于淋巴细胞迁移研究。FITC 对细胞活力无影响，且与B淋巴细胞的亲和力强于T淋巴细胞14,15CFDA-SE标记的淋巴细胞可被追踪 体内 超过8周，最多8次细胞分裂9,16C18 DiI（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate）、DiO（3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate）、PKH2、PKH3 和 PKH26 是一类可插入细胞膜的荧光疏水性羰花青染料，用于标记白细胞和红细胞。C18 DiI 和 DiO 在整合入细胞膜后荧光信号更强，且相对无毒。12,17PKH2、PKH3 和 PKH26 标记的细胞对荧光信号具有良好的保留性，且毒性较低18,19,20,21,22然而，PKH2 会下调 CD62L 的表达，并降低淋巴细胞的存活率23.

上述大多数研究主要用于追踪淋巴细胞在淋巴系统中的迁移与增殖，以及观察非眼部循环中标记的红细胞。极少有研究将标记技术应用于眼部循环中血细胞的观察。扫描激光检眼镜（SLO）的应用在研究视网膜和脉络膜循环中标记细胞方面具有显著优势 体内 通过眼底血管造影24有多种荧光染料可用于SLO研究视网膜循环中的白细胞，例如ICG、吖啶橙、FITC、荧光素钠和CFDA。25,26,27,28,29,30,31,32,33,34吖啶橙的光毒性与致癌性26,27，FITC对细胞活性的干扰，以及分辨视网膜和脉络膜血管所需使用的血管内对比剂，限制了它们在以下领域的应用 体内 动物实验29荧光素钠和吲哚菁绿（ICG）无毒，已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准，可用于人体检测32,35大多数血流动力学研究均涉及白细胞或红细胞的标记及其在视网膜和脉络膜血管中的可视化36,37,38,39在此，我们描述了一种标准化的实验方案：使用吲哚菁绿（ICG）标记红细胞，荧光素钠标记白细胞，并利用扫描激光检眼镜（SLO）对小鼠视网膜循环中可视化的标记细胞进行追踪。

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方案

本研究中使用的动物实验方案已获得新加坡SingHealth机构动物护理和使用委员会的批准，并遵循眼科和视觉研究中动物使用方面的视觉与眼科研究协会（ARVO）声明指南。

1. 使用荧光染料标记红细胞和白细胞

  1. 试剂的制备
    1. 将3 mg ICG溶解于1800 µL无菌蒸馏水中，配制ICG（1.5 mg/mL）溶液。加入200 µL 10倍磷酸盐缓冲液（PBS）。
    2. 将4 mL 1×PBS加入6 mL无菌蒸馏水中，配制40% 1×PBS。将100 mg牛血清白蛋白（BSA）加入10 mL 1×PBS中，配制1% BSA的PBS溶液。充分混匀，直至BSA完全溶解。
  2. 利用密度梯度离心法分离红细胞和白细胞
    1. 使用盐酸氯胺酮（50 mg/kg）和盐酸赛拉嗪（0.5 mg/kg）联合麻醉小鼠（野生型C57BL/6）（根据ARVO指南中的附表1进行）。通过足底回缩反射确认麻醉效果即，脚趾挤压。
    2. 缓慢将连接1 mL注射器的29号针头从肋角处插入，方向朝向心脏。为确认针头位于心脏内，可轻轻回抽活塞，观察是否有血液进入注射器。直接从心脏采血0.8–1 mL。
    3. 立即将血液转移至含有乙二胺四乙酸（EDTA）（每毫升血液1.8 mg）的采血管中，轻轻混匀，防止血液凝固。
    4. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（80 mg/kg）处死小鼠。
    5. 将全血叠加于2 mL微量离心管中的多聚蔗糖与泛影酸钠溶液（1:1比例，密度1.077 g/mL）上层，离心（450 × g，30分钟），使白细胞和红细胞与血浆分离。
    6. 使用移液器移除并弃去上清液（血浆）。使用移液器小心地将白膜层（白细胞）和红细胞（红细胞层）分别转移至新的离心管中。
  3. ICG（1.5%）标记红细胞
    1. 用1×PBS洗涤红细胞以去除任何污染物。将红细胞重悬于1×PBS（1:1）中，制备成50%压积红细胞悬液。取0.5 mL 50%压积红细胞悬液（约含250 µL压积红细胞）分装至微量离心管中。离心红细胞（750 × g，5分钟），弃去上清液。
    2. 向沉淀的红细胞中加入200 µL 40% 1x PBS，充分混匀，室温孵育5 min。向红细胞悬液中加入100 µL ICG（1.5 mg/mL），通过轻柔颠倒试管混匀，室温孵育5 min。加入300 µL 1x PBS，于37 °C摇床孵育器中孵育60 min。
    3. 离心载药红细胞（750 × g，3 分钟），弃上清，加入 1 mL 1× PBS 重悬。
    4. 用1× PBS洗涤细胞约3–5次，直至上清液澄清（步骤1.3.3）。最后一次洗涤后，倾去上清液，向已标记的预膨胀红细胞中加入1% BSA PBS（1:1），使血细胞比容达到50%（1.25 × 108 细胞/mL）的ICG标记红细胞。
  4. 白细胞荧光素钠（1%）标记
    1. 在使用密度梯度离心法分离血样中的白膜层（来自步骤1.2.6）后，加入10 mL 1×PBS重悬细胞，于450 × g离心10 min，洗涤一次以去除杂质。将沉淀重悬于900 µL 1×PBS中。
    2. 向900 µL白细胞悬液中加入100 µL 10%荧光素钠，室温孵育2 min。用10 mL 1×PBS以450 × g离心10 min，洗涤标记细胞3次。将细胞重悬于100 µL 1×PBS中。

2. 荧光标记细胞的活体成像

  1. 活细胞成像技术用于吲哚菁绿标记的红细胞
    1. 为注射准备细胞 通过 尾静脉或眶后注射途径：将标记ICG的红细胞（50% hematocrit）用1×PBS分别稀释10倍和50倍，制备成5%和1% hematocrit的细胞悬液。
    2. 将小鼠置于红外灯（250 W 强度）下 5 分钟，使尾静脉扩张。通过腹腔注射给予盐酸氯胺酮（50 mg/kg）和盐酸赛拉嗪（0.5 mg/kg）麻醉小鼠（此处依据 ARVO 指南中的方案 1）。
    3. 用一滴0.5%托吡卡胺和2.5%盐酸去氧肾上腺素滴眼液散大双眼的瞳孔。
    4. 将隐形眼镜置于一只眼睛上用于成像。使用眼科凝胶作为成像介质，并防止角膜干燥。将共聚焦激光扫描检眼镜（SLO）相机配备+25屈光度镜头，以补偿小鼠眼睛的折射。
    5. 将小鼠放置在SLO成像平台上，确保其角膜正对SLO仪器的光学镜头。
    6. 打开成像模块。使用配套的成像模块软件，点击 "新患者" 按钮，并添加动物标识信息，例如小鼠耳标编号、出生日期、荧光染料百分比以及标记的细胞类型。
      1. 将动物的视神经置于成像屏幕中心位置，通过调节成像模块实现。使用配套的成像模块软件，点击 "获取" 点击按钮，使用30°或15°视角设置拍摄红外（IR）眼底图像。确保视网膜中心、瞳孔与激光光路对齐，以获得最佳质量的图像。
        注意：通过操纵操纵杆调整光路，以获得最清晰的图像和最佳的照明曝光。
    7. 拍摄吲哚菁绿（ICG）眼底视频。
      1. 打开ICG滤光片（790 nm），将摄像头设置为高速模式，视角选择30°或15°，并将所有读数的ICG强度统一设为85以实现标准化。在控制面板上，点击 "获取" 单击按钮以 8.8/15 帧/秒的速度采集 1 分钟视频（基线对照）。
    8. 将100 µL ICG标记的红细胞加入连接30号针头的胰岛素注射器中。
      1. 用于注射 通过 尾静脉注射途径：将针头斜面向上插入尾静脉。通过观察血液回流至注射器来确认静脉通路是否建立，随后将标记的细胞注入循环系统。
      2. 通过眶后途径注射时，将针头插入眼睛附近的眶后腔。通过观察针筒内是否有血液回流来确认针头是否进入眶后腔，随后将标记的细胞注入循环系统。
    9. 注射后，重新调整小鼠位置，使用ICG滤光片（参见步骤2.1.7.1）采集红外眼底图像（参见步骤2.1.6.1）和视频。细胞注射后可立即在视网膜循环中观察到标记的细胞。
    10. 获取视频帧后，使用SLO观察模块软件导出视频时选择.tiff格式，以提取视频序列的.tiff图像。将文件保存至指定文件夹。
    11. 取下隐形眼镜，将其置于另一只眼睛上，并按照步骤 2.1.4 - 2.1.7 所述完成成像。
    12. 成像后，将麻醉的动物置于红外灯（250 W）下以维持体温，直至其从麻醉中恢复。当动物完全清醒后，将小鼠放回饲养笼中。
  2. 活细胞成像观察1%荧光素钠标记的白细胞
    1. 按照第2.1节所述准备小鼠并设置仪器。
    2. 将小鼠置于指定位置，并按照步骤 2.1.4 - 2.1.6 所述方法采集红外眼底图像。
      1. 使用荧光素滤光片（488 nm），在高速摄像模式下，以30°或15°视角、荧光素强度设为85进行小鼠荧光素血管造影，所有读数均以此参数标准化。以8.8/15帧/秒录制视频（基线对照）（见步骤2.1.7.1）。
        注意：此处以不同的时间间隔采集了多个视频轨道（1 分钟视频）。
    3. 通过尾静脉或按第2.1.8节所述的眶后注射，向小鼠体内注入100 µL标记的白细胞。
    4. 注射后立即固定小鼠位置，拍摄小鼠的红外眼底图像（参见步骤 2.1.5 和 2.1.6）以及荧光素眼底血管造影图像（参见章节 2.2.2）。
    5. 通过调节成像模块上的聚焦旋钮来改变扫描激光的焦平面，观察视网膜或脉络膜血管中的标记细胞。
    6. 使用SLO观察模块软件（见步骤2.1.10）获取视频帧和图像，并将其保存至指定文件夹。
    7. 操作结束后，按照步骤 2.1.12 进行动物护理。
  3. 使用 MtrackJ 软件进行图像分析
    1. 在 ImageJ 中通过点击打开图像序列 "文件"选择 "导入" 并选择 "图像序列"，选择所需的图像文件夹，然后单击 "打开"名为的弹出窗口 "序列选项" 将出现在屏幕上。单击 "好的"图像序列将打开。
    2. 通过点击设置图像视频的帧间隔 "图像" 并选择 "性质" 用于速度测量。此处为 8.8 帧/秒。
    3. 通过选择打开 MTrackJ 插件 "插件"选择 "追踪" 然后选择 "MtrackJ"应出现一个菜单。
    4. 要调整跟踪设置，请选择 "追踪" （在菜单下）并勾选复选框 "添加点后移至下一时间帧索引".
    5. 追踪第一个细胞。
      1. 定位一个细胞，并在后续帧中追踪同一个细胞。在菜单中点击 "添加" 添加新轨道。
      2. 将光标悬停在图像（加号）上，然后点击相应的细胞。
        注意：MTrackJ 将自动跳转到下一时间帧，并添加一个小圆圈，标记轨迹中第一个点的位置。
      3. 在图像序列的各帧中移动时，持续点击细胞的当前位置。
        注意：轨迹中标记先前位置的圆圈有时会干扰对当前位置的观察。若发生此情况，请继续执行步骤 2.3.5.3.1。
        1. 通过点击更改轨迹的显示选项 "显示中" 在菜单中并选择该选项 "仅在当前时间显示轨迹点"取消选择此选项可查看所有轨迹。
      4. 继续点击，直到看到第一个细胞的轨迹为止。然后通过点击保存该轨迹 "保存".
    6. 追踪第二个细胞。
      1. 在菜单中，单击 "添加" 开始一条新轨迹。重复步骤 2.3.5.1 - 2.3.5.4 以追踪新的细胞。单击 "保存" 以保存第二条轨迹。
      2. 对所有可追踪的细胞重复上述步骤。完成细胞追踪后，点击 "测量" 和 "好的" 在菜单选项卡中获取结果。
        注意：结果窗口将自动打开，可保存并在电子表格中打开以进行进一步分析。

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结果

在C57BL/6J小鼠（野生型）的视网膜循环中观察到用1.5% ICG标记的红细胞。在视网膜循环中，1%和5% hematocrit的1.5% ICG标记红细胞均可被区分。然而，使用1% hematocrit的1.5% ICG标记红细胞时，单个标记细胞的可视化更为清晰（图1）。在5% hematocrit条件下，由于视网膜血管中标记细胞数量较多，无法识别单个细胞。在两种条件下，视盘周围区域均观察到一定程度的红细胞淤滞，但在5% hematocrit的标记红细胞中更为明显（图2）。

按照上述方案，白细胞成功地用1%荧光素钠标记，并通过荧光显微镜观察到呈绿色荧光标记的细胞（图3）。在标记样本中还观察到少量细胞团块（4–5个细胞聚集在一起）。将细胞注入小鼠血液循环后，可在视网膜循环...

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讨论

研究视网膜和脉络膜循环中的血流动力学对于理解多种眼病的病理生理机制至关重要。视网膜循环中的血流动力学可通过傅里叶域光学相干断层扫描（FD-OCT）、激光散斑血流成像（LSFG）和视网膜氧饱和度测定法进行研究。尽管这些方法采用不同的技术手段来评估视网膜循环中的总血流量40,41,42,43,44,45，但它们均存在无法研究各类血细胞流动动力学的局限性。通过分别研究视网膜和脉络膜循环中红细胞与白细胞的流动动力学，可深入了解视网膜和脉络膜组织的营养与氧气供应情况，以及在眼部炎症性疾病中免疫细胞的迁移过程及其在疾病发病机制中的作用。结合成像技术的标记方法有助于追踪循环中标记的细胞，并研究这些标记细胞的流动动力学。已有多种荧光染料成功用于标记白细胞和红细胞...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。无财务或利益冲突。

致谢

本研究项目由新加坡国家医学研究理事会（NMRC）的新研究员资助计划资助。研究团队希望感谢阿格拉瓦尔博士在2012年11月至2014年10月期间，在国家医学研究理事会（NMRC）海外研究培训奖学金支持下，于伦敦大学学院（UCL）眼科研究所（IoO）接受的研究培训。在大卫·希马教授的指导下，阿格拉瓦尔博士在希马博士的实验室中掌握了细胞标记和活体成像的概念与技术。因此，研究团队希望感谢在培训期间大卫·希马教授、肯尼斯·梅斯纳教授、彼得·伦德博士和岩田大寿博士所提供的指导与监督。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
心绿多甲川染料（吲哚菁绿）Sigma Aldrich12633-50MG
荧光素 100 mg/mL诺华U1705A/H-1330292
10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）超纯级1st BASEBUF-2040-10X1L
牛血清白蛋白Sigma AldrichA7906-100G
含K2E（K2EDTA）的微量离心管 - EDTA浓度：每毫升血液1.8 mgBD, USAREF 365974
Histopaque 1077 溶液Sigma Aldrich10771
5810 R型离心机艾本德05-413-401
2 mL 微量离心管AxygenMCT-200-C-S
涡旋混合器Insta BioAnalytik pte. ltdFINE VORTEX
摇床培养箱Lab Tech
赛法氯胺酮注射液（盐酸氯胺酮 100 mg/mL）CevaKETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20（盐酸赛拉嗪 20 mg/mL）Troy Laboratories PTY. LimitedLI0605
1% 美多丽 15 mL（托吡卡胺 1%）Alcon Laboratories, Inc. USANDC 0998-0355-15
2.5% 美芬 5 mL（盐酸去氧肾上腺素 2.5%）Alcon Laboratories, Inc. USANDC 0998-0342-05
Terumo 结核菌素注射器（带针头，1 cc/mL）Terumo (Philippenes) Corporation, PhilippinesSS-01T2613
维地西克凝胶 10 GDr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
酒精棉片Assure 医用耗材7M-004-L-01
共聚焦激光扫描血管造影系统（海德堡视网膜血管造影仪2型）Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
海德堡 Spectralis 观察模块软件，v4.0Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
荧光显微镜ZEISS型号：axio imager z1

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荧光染料标记红细胞和白细胞以研究小鼠视网膜循环中的血流动力学
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