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方法文章

一种基于G-四链体DNA亲和力的方法用于纯化具有酶活性的G4解旋酶1

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DOI：

10.3791/55496

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2017年3月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, Wake Forest School of Medicine, 2YX Genomics, 3Department of Biology, Ball State University, 4Department of Hematology and Oncology, Roper St. Francis Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

G4解旋酶1与G-四链体（G4）结构的结合亲和力是目前报道中G4结合蛋白中最强的，并且在HeLa细胞中构成了G4-DNA解旋活性的主体。本文描述了一种新方案，该方案利用G4-解旋酶1的高亲和力及其ATP依赖性的解旋活性，特异性纯化具有催化活性的重组G4R1蛋白。

摘要

一种称为G-四链体（G4、G4结构）的高级核酸结构可在DNA和RNA的富含鸟嘌呤区域形成，并具有高度的热稳定性。人类基因组中存在>375,000个假定的G4形成序列，这些序列在启动子区域、非翻译区（UTRs）以及端粒重复序列中富集。由于这些结构可能影响复制和转录等细胞过程，细胞已进化出相应的酶来调控它们。其中一种酶是G4解旋酶1（G4R1），该酶由我们的实验室与Nagamine 等共同通过生物化学方法表征，发现其可极紧密地结合G4-DNA和G4-RNA（Kd 处于低皮摩尔浓度范围）。G4R1是HeLa细胞裂解液中大部分G4解旋活性的来源，并已被证实参与端粒代谢、淋巴系统发育、基因转录、造血以及免疫监视等过程。高效表达和纯化具有催化活性的G4R1，对于希望进一步深入了解G4结构与G4解旋酶之间动力学相互作用的研究实验室而言具有重要意义。本文中，我们描述了一种重组G4R1（rG4R1）的详细纯化方法。该方法结合了传统的亲和层析纯化技术，利用在人类密码子优化的细菌中表达的C端组氨酸标签酶，并进一步利用rG4R1结合并解旋G4-DNA的能力，通过ATP依赖性的洗脱步骤获得高活性的纯化酶。本方案还包括一个质量控制步骤，通过检测纯化后的酶解旋G4-DNA的能力来评估rG4R1的酶活性。同时提供了一种用于定量纯化rG4R1的方法。文中还讨论了该方案的若干替代性优化策略。

引言

G4 结构是在 DNA 和 RNA 的富含鸟嘌呤区域中形成的高稳定性核酸二级结构。G4 结构通过 Hoogsteen 氢键相互作用以及中心空腔内与单价阳离子（i.e. K+ 和 Na+）的配位键合而得以稳定，这些阳离子对 G4 结构显著的热稳定性具有重要贡献1,2。早期的生物信息学研究表明，人类基因组包含 >375,000 个“潜在的 G4 形成基序”3,4。最近的研究估计表明，G4 基序的数量可能高出 2 至 5 倍5，而另一项研究预测人类基因组中存在 716,310 个不同的潜在 G4 形成序列6。G4 形成序列在进化上是保守的，并非在基因组中随机分布。G4 基序在基因编码区富集，且超过 40% 的基因启动子含有 G4 基序7。有趣的是，基因中 G4 基序的富集程度已被证明可提示该基因的功能。例如，原癌基因和参与发育的基因中的 G4 结构富集程度显著高于肿瘤抑制基因8,9。

由于G4结构具有高热稳定性，在基因组中广泛存在，并且可能显著影响主要的细胞过程，因此细胞进化出专门的酶来调控这些结构也就不足为奇了。其中一种酶是G4解旋酶1（G4 Resolvase1，G4R1；也称为RHAU和DHX36），我们先前已将其鉴定为人类（HeLa）细胞中大部分四链G4-DNA解旋活性的来源10。此后研究发现，G4R1能够紧密结合并催化性地解开四链和单链的G4-DNA及G4-RNA，其报道的解离常数（KD）是目前G4结合蛋白中最紧密的11,12,13。此外，G4R1的G4解旋活性已被证实参与多种生化和细胞过程，包括端粒/端粒酶生物学11,14,15,16、转录与剪接17,18,19,20、发育21、造血21以及免疫调控22,23。鉴于G4序列在基因组中广泛且特异性分布，且G4R1被发现参与多种多样的细胞功能，高效表达并纯化高活性的重组G4R1（rG4R1）对于阐明该蛋白的生化机制与功能行为具有极其重要的意义。

本文展示了一种新颖的表达与纯化方案（图1），该方案利用rG4R1依赖ATP的G4解旋活性，高效分离具有活性的酶。该方案可适用于纯化其他依赖ATP的核酸酶，前提是酶促反应的产物不再作为结合底物，G4R1即属于此类情况。

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方案

1. 用于rG4R1纯化的G4-DNA结构的制备（生物素标记G-四链体DNA G-四链体的形成）

  1. 订购以下DNA寡核苷酸，命名为Z33-Bio，合成规模为1 µmole：5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-生物素 3’。确保生物素基团位于寡核苷酸的3’端。
  2. 配制10x G4缓冲液：450 mM Tris-HCl（pH 8）、25 mM EDTA和2,500 mM NaCl。
  3. 将Z33寡核苷酸溶于250 µL水中（使寡核苷酸浓度约为2.5 mM）。加入25 µL 10x G4缓冲液并混匀。将寡核苷酸在50 °C孵育约48小时。
  4. 短暂离心收集管壁冷凝液（约1,000 × g，10秒）。加入约50 µL高分子量亲水性多糖（30% Ficoll溶于H2O）并混匀。灌制一块10%丙烯酰胺/1x TBE/10%甘油凝胶（凝胶尺寸：16 cm × 16 cm × 1 mm）。待凝胶聚合完成后，用1x TBE冲洗加样孔，并将形成的Z33-Bio寡核苷酸均匀加样至凝胶大部分区域（可通过Schlieren条带观察样品上样情况）。
    1. 在凝胶一端的泳道中，加入少量经98 °C加热10分钟的寡核苷酸（作为无结构对照）；另在一个泳道中加入少量凝胶上样染料，用于监测电泳进程。
  5. 使用1x TBE作为电泳缓冲液，在120 V电压下电泳，直至染料前沿迁移超过凝胶长度的1/3。
  6. 将薄层层析板粗糙面向上置于透明文件袋中（或用塑料膜覆盖）。取下一块玻璃板，将凝胶转移至文件袋表面。关闭室内光源，用长波长紫外光（365 nm）进行阴影显影。使用新的剃须刀片切下G-四链体-Z33-Bio条带，该条带在凝胶中迁移位置较高（迁移速率较慢），相对于变性对照条带更靠上。
  7. 将含有形成的G4-DNA的凝胶切片放入50 mL离心管中，加入刚好浸没凝胶切片的浸提缓冲液（浸提缓冲液由1/3体积的10x TBE、1/3体积的饱和乙酸钠和1/3体积的H2O组成）。将离心管置于37 °C培养箱（非湿化）中过夜孵育。
  8. 将溶液转移至15 mL离心管中，加入1/10体积的糖原（糖原储存液为20 mg/mL，溶于10 mM Tris-HCl pH 8、2.5 mM EDTA pH 8和0.05%叠氮化钠）以及约1.2倍体积的异丙醇。
    注意：叠氮化钠具有急性毒性，请谨慎操作！
    1. 混匀后将离心管置于-20 °C至少2小时。在4 °C预冷的台式离心机中以2,700 × g离心12分钟。小心倾去上清液，保留G4-DNA沉淀。用70%乙醇+50 mM NaCl洗涤沉淀3次（洗涤液中的盐对维持G-四链体稳定性至关重要）。用无绒纸巾吸除多余液体。
  9. 将洗涤后的沉淀置于冰箱中至少2小时，使其充分水合，便于后续重悬。用50 µL TNE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8、50 mM NaCl和0.05 mM EDTA pH 8）重悬沉淀。
  10. 取5 µL形成的DNA G-四链体加入495 µL H2O中，使用可输入寡核苷酸组成以确定消光系数的分光光度计进行定量（Z33 DNA寡核苷酸的碱基组成为A = 8、C = 3、G = 15、T = 7，其消光系数为341,946 L/mol/cm）。输入稀释倍数为25（而非100），因为形成的G-四链体由4条DNA链组成。
  11. 按每管3 OD（OD260单位）分装相应体积，并于-20 °C保存；例如，若加入495 µL H2O中的5 µL样品测得OD260为3，则应分装为每管5 µL。

2. 用于rG4R1酶活性测定的G4-DNA结构的制备（TAMRA标记的G4-DNA的形成）

  1. 订购以下DNA寡核苷酸，命名为Z33-TAM，规模为1 µmole：5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’。确保TAMRA基团位于寡核苷酸的5’端。
  2. 按照第1节所述步骤进行G-四链体的形成，但无需进行紫外（UV）阴影检测，因为四甲基罗丹明（TAMRA）标记的G-四链体可直接用肉眼观察。同样，务必在凝胶中包含一个已变性的对照样本。
  3. 在使用分光光度计测定TAMRA标记的DNA G-四链体后（如步骤1所示），用TNE缓冲液将形成的G-四链体稀释至0.2 pmol/µL。最后加入甘油至终浓度为10%，并于-20 °C保存。

3. 将pTriEx4-DHX36质粒（编码人源G4R1）转化至BL21(DE3) PlysS感受态细胞，并培养/诱导大量细菌培养物

  1. 获取 TriEx4-DHX36 质粒。
  2. 将细菌分装成每份 20 µL，于 -80 °C 保存。将 SOC 培养基（2% 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，10 mM NaCl，2.5 mM KCl，10 mM MgCl2，10 mM MgSO4 和 20 mM 葡萄糖）分装成每份 80 µL，于 -80 °C 保存。
  3. 制备含羧苄青霉素（CARB）和氯霉素（CAM）的 LB-琼脂筛选平板。CARB 和 CAM 的储存液浓度分别为 50 mg/mL（溶于 H2O）和 35 mg/mL（溶于 70% EtOH），均为 1,000 倍浓缩液；因此，LB 琼脂筛选平板中的终浓度分别为 50 µg/mL 和 35 µg/mL。
  4. 取一份细菌置于冰上，另取一份 SOC 培养基于室温放置。向细菌中加入 1 µg pTriEx4-DHX36 质粒，用移液枪轻轻吹打混匀。冰上孵育 5 分钟后，42 °C 热激 30 秒。再放回冰上 2 分钟，随后加入 SOC 培养基。
  5. 将转化后的细菌涂布于预热的筛选平板上（通常涂布少量体积，如 5–10 µL，以确保菌落密度较低，便于后续挑取单菌落接种至大体积培养物），37 °C 过夜培养。
  6. 根据制造商说明书配制优质肉汤（Terrific Broth）24。每只大三角瓶配制 500 mL（确保添加甘油），并采用短时间液体循环进行高压灭菌。
  7. 向肉汤中加入 CARB/CAM（终浓度分别为 50 µg/mL / 35 µg/mL），然后用 1000 µL 移液枪挑取含有单菌落的琼脂块，转移至肉汤中接种。剧烈振荡培养液以充分通气，随后于 37 °C 静置过夜培养。
  8. 次日，将培养物置于 37 °C 摇床中，以约 225 rpm 振荡培养，直至 OD600 达到约 0.4–0.6，通常需要 4–6 小时，具体时间取决于初始细胞密度。
    注意： 此过程需通过分光光度法定期监测细胞密度，且必须避免培养物 OD 超过 0.5。作为分光光度法测定的空白对照，取 1 mL 细菌培养液离心，以上清澄清肉汤作为空白参比溶液。
  9. 当达到合适 OD600 后，立即将培养物置于冰上，迅速冷却至 10 °C。使用经 70% EtOH 擦拭清洁的温度计监测温度。在冰上快速旋转三角瓶以加速冷却，从而在诱导重组蛋白表达前最大限度抑制细菌继续生长。
  10. 加入 IPTG 至终浓度 1 mM（约 120 mg/500 mL 培养液），随后于 14 °C、80 rpm 振荡培养约 17–18 小时。经验证，14 °C 为蛋白诱导的最佳温度；为精确实现该温度，建议使用放置于普通低温室内的冷水浴摇床，并用手持温度计手动监测水浴温度。
    注意： 也可使用风冷式摇床/培养箱，但需预先测试设定的数字温度值是否能实际达到目标液体温度（可通过在摇床中放置含温度计的水样三角瓶，以 80 rpm 振荡数小时，根据实测温度调整设定值，直至达到 14 °C）。
  11. 将培养物再次置于冰上快速冷却，操作同步骤 3.9。取少量培养液测定 OD600；理想情况下，诱导期间细胞密度应翻倍，达到约 0.8–1.2 OD600。
  12. 将细菌培养液转移至 500 mL 离心管中，通过添加细菌培养液手动平衡各管重量。平衡后，于 4 °C、3,840 × g 离心 20 分钟。倒去上清液，将菌体沉淀于 -80 °C 冻存，待后续进行蛋白纯化时使用。

4. 人源 rG4R1 的纯化

  1. 解冻并裂解细菌沉淀。
    1. 在室温下用 3 mL TN 缓冲液解冻细菌沉淀（TN 缓冲液由 100 mM Tris pH 7.5 和 50 mM NaCl 组成）。用手握住离心管并轻轻旋转，以促进解冻和重悬细菌沉淀。待沉淀完全解冻并基本均匀悬浮后，用 TN 缓冲液将体积补至 5 mL（可使用 5 mL 移液器上下吹打，进一步实现充分悬浮）。
      注意： 通常在制备当天解冻/准备2瓶或4瓶，具体数量取决于操作者对纯化步骤的熟练程度。
    2. 将20 mg溶菌酶溶解于250 µL H2O（每培养物）加入重悬的细菌中。加入溶菌酶后，在手摇旋转瓶中孵育约5-10分钟，使细菌充分消化。
      注意： 随着消化的进行，悬液颜色会开始略微变浅，且悬液相对不粘稠。如果培养物过度生长（即 远大于1.2 OD600），此时细菌染色体DNA可能导致不必要的黏稠度。
    3. 加入250 µL蛋白酶抑制剂混合物（PIC）和10 µL亮抑酶肽（leupeptin）。充分混匀。
    4. 置于冰上，加入10 mL冷TN缓冲液和22 µL BME。转移至50 mL离心管中。
    5. 将细菌置于冰上，使用数字超声仪以30%的振幅进行超声处理。以2秒开启、2秒关闭的脉冲模式持续1分钟。重复超声处理3次，每次超声后将样品在冰上冷却至少2分钟。
      注意： 对多个培养物进行超声处理时，应依次对每个样品进行超声，然后重复超声步骤。超声过程中，注意保持超声探头充分浸入细菌裂解液中，但不得接触管壁，以免产生过多热量。
    6. 加入等体积（15 mL）的冷4x SSC + 20 µL BME + 50 µL PIC + 1份亮抑蛋白酶肽（leupeptin），混匀。
    7. 在已预冷至 4 °C 的台式离心机中，于 2,300 x g 离心 20 分钟。将上清液转移至新的预冷 50 mL 离心管中（每份大体积培养物对应 1 管）。
  2. 制备G4-磁珠。
    1. 取1 mL链霉亲和素磁珠（SPB）悬浮液（每1 L培养物），转移至1.5 mL微量离心管中。使用磁铁沉淀SPB，并用2×SSC + 5 mM EDTA（pH 8.0）洗涤2次。将洗涤后的SPB重悬于200 µL与洗涤液相同的溶液中。
    2. 将一份3 OD的G4-DNA（第1节制备的Z33-Bio G4）加入SPB悬浮液中，通过反复吹打混匀数次。将试管置于旋转仪上，在室温下旋转孵育至少30分钟（最长可达60分钟）。
    3. 旋转孵育结束后，加入1 mL 0.4%乳清蛋白以封闭与G4结合的SPB，并置于冰上保存备用。使用1×Tris-甘氨酸缓冲液将4%乳清蛋白储备液稀释至0.4%。
      注意： 4%（w/v）乳白蛋白储备液的制备：先溶于2 M甘氨酸（pH 7.5）中，再加入1×蛋白酶抑制剂混合物（PIC）和0.05%叠氮化钠。
  3. 将带有组氨酸标签的rG4R1与钴珠（CB）结合（接步骤4.1）。
    1. 向每个含有澄清细菌裂解液的50 mL离心管中加入1 mL CB悬液（相当于0.5 mL珠体积）。在室温下于旋转仪上孵育20分钟。
      注意： 每1升澄清裂解液使用0.5 mL珠体积； 例如， 如果两个500 mL 制备细菌培养物后，仅向50 mL中加入CB 此时取一支试管，加入其中一种培养物的澄清裂解液，因为第二种培养物的裂解液将依次与相同的0.5 mL 步骤4.3.3中CB的用量。
    2. 在4 °C下，以110 × g离心5分钟，沉淀有核红细胞。小心吸除上清液，保留数毫升液体以免扰动细胞沉淀。用10–15 mL预冷的4× SSC + BME（每毫升4× SSC中加入0.5 µL BME）洗涤。
      注意： 洗涤时，直接将10–15 mL溶液倾倒至钴珠沉淀上，而非使用移液器，因为移液操作会导致珠子黏附在移液器内壁，造成蛋白损失。
    3. 再次通过离心沉淀脐带血，然后倒入下一份澄清裂解液（30 mL，代表第2份）nd 将大量诱导的细菌培养物加入到已离心收集的CB中。在旋转仪上于室温继续孵育20分钟，随后用10–15 mL的4x SSC + BME洗涤两次。在4 °C下以110 × g离心5分钟，收集沉淀。
    4. 第二次洗涤后，吸去液体，保留约 2 mL 含珠液体于管底。使用 1 mL “宽口”吸头将结合蛋白的 CB 转移至预冷的 2 mL 管中。
      注意： 使用新的剃须刀片在转移前切割枪头末端，因为使用这种“宽孔”移液枪头可减少与蛋白质结合的钴珠损失。
    5. 在4 °C下，将2 mL管中的珠子在微量离心机中高速短暂离心（约18,000 × g，5–10秒即可实现快速沉淀）。用移液器小心吸除并弃去上清液，注意避免丢失与蛋白结合的CB珠。
  4. 从CB中洗脱rG4R1。
    1. 在4°C条件下，将CB加入0.5 mL组氨酸洗脱缓冲液（HEB）中，在旋转仪上孵育5分钟。再次加入HEB时，直接将0.5 mL缓冲液用移液器加至珠粒表面（以避免CB损失），并通过倒置离心管重悬珠粒。HEB为0.7 M L-组氨酸（pH 6，用乙酸调节pH）。
    2. 在4 °C下，以18,000 × g离心1分钟。将上清液转移至预冷的15 mL离心管中。小心吸移，轻轻去除并转移含蛋白的上清液，留下少量液体覆盖在CB上方。
    3. 重复步骤 4.4.1 和 4.4.2，共进行 3 次 HEB 洗脱。
    4. 用 0.2 M EDTA（pH 6.0）洗脱一次；随着 EDTA 与钴形成螯合物，钴结合珠（CB）的颜色将由粉红色变为白色。
    5. 将第四次也是最后一次洗脱液转移至15 mL离心管后，使用1 mL移液枪末端安装的加样枪头吸取层析柱（CB）中残留的洗脱缓冲液；将枪头插入管底，可收集含有蛋白的残留洗脱缓冲液。
  5. 将rG4R1结合至G4结合的SPB上，并以ATP依赖的方式洗脱重组酶。
    1. 配制5倍反应缓冲液（5x Res Buffer）：250 mM Tris-乙酸盐（pH 7.8），250 mM NaCl，2.5 mM MgCl₂2，以及50%甘油。配制3x Res Buffer：取0.915 mL H2O，2 mL 5x Res Buffer、0.33 mL 0.4% 乳清蛋白（用1x Tris-甘氨酸缓冲液将4%乳清蛋白稀释而成）、0.010 mL BME、0.015 mL 1 M MgCl₂2，0.050 mL PIC 和 0.010 mL 亮抑酶肽。置于冰上保存。
      注意： 4%（w/v）乳白蛋白储备液的制备：先溶于2 M甘氨酸（pH 7.5）中，再加入1×蛋白酶抑制剂混合物（PIC）和0.05%叠氮化钠。
    2. 将G4-SPB用磁铁吸附至管壁一侧，弃去上清液（G4-SPB，按步骤4.2制备）。加入1 mL 3x Res Buffer，用移液器吹打混匀。
    3. 将1 mL悬浮于3倍体积Res缓冲液中的G4-SPB用移液器转移至含有约2 mL含蛋白的HEB/EDTA（步骤4.4的洗脱液）的15 mL离心管中。在37 °C水浴中孵育15分钟，期间偶尔轻轻振荡，以防止磁珠沉降。
    4. 在冰上，使用磁铁将结合蛋白的 G4-SPB 沉淀至管壁一侧。洗涤时，加入 1 mL 4x SSC + 0.4% 乳白蛋白（+ 0.5 µL/mL BME），用移液器吹打重悬磁珠。在冰上用磁铁沉淀磁珠。重复此洗涤步骤，共洗涤 2 次。
      注意： 洗涤过程中需要耐心，以确保每次洗涤间隔磁珠已全部沉淀。由于Res缓冲液中含有甘油，溶液黏度增加，这一点尤为重要。
    5. 用1 mL 3x Res Buffer洗涤G4-SPB 1次。
    6. 制备洗脱缓冲液（EB）：0.5 mL 3x Res Buffer、0.1 mL 0.1 M ATP 和 0.4 mL H₂O2O.
    7. 将1 mL EB溶液加入分布在设定为37 °C的PCR仪加热块上的PCR管中，预热至37 °C。
    8. 将G4-SPB珠粒连同磁铁置于冰上，用100 µL预热的EB缓冲液重悬珠粒。立即将珠粒转移至预热的PCR管中，于37 °C孵育30秒。
    9. 立即加入 12 µL 5 M NaCl，用力上下吹打 20 - 30 次。高盐浓度与洗脱缓冲液（EB）中的 ATP 共同作用，可将 rG4R1 从 G4 磁珠上洗脱下来。
      注意： 在移液过程中，应尽量减少气泡的产生，因为气泡可能导致蛋白质变性。
    10. 立即使用磁铁沉淀G4-SPB，并将含有蛋白的洗脱液转移至预冷的PCR管中（标注日期）。
    11. 重复步骤 4.5.8–4.5.10 中所述的洗脱和转移操作；该过程的最终产物为约 200 µL 含有纯化 rG4R1 的 EB 缓冲液。预留两份 7 µL 等分试样（置于标注相应日期的 PCR 管中），用于质量控制的酶活性检测，以验证是否成功纯化出高活性的 rG4R1。
    12. 将纯化的 rG4R1 储存于 -80 °C，直至进行活性测定。

5. 纯化rG4R1的酶活性质量控制检测

  1. 每次检测rG4R1制备物时，准备300 µL解旋酶检测缓冲液（RAB），其中每30 µL含有0.2 pmol的TAMRA标记Z33 G4-DNA（按步骤2制备）；RAB的配制如下：0.1 mL的3x Res Buffer、0.01 mL的0.2 pmol/µL G4-Z33-TAM、0.03 mL的0.1 M ATP和0.16 mL的H2O。在6个PCR管组成的排管中，向第一个管加入40 µL RAB，其余各管加入30 µL RAB（此时将各管 置于冰上）。
  2. 取出一个7 µL的rG4R1分装样品（来自步骤4.5.11），置于冰上。用设定为5 µL的P20移液器轻轻吹打数次以混匀rG4R1样品，然后将5 µL转移至6个PCR管排管中的第一个管（含40 µL RAB）。随后将移液器调至10 µL，依次将10 µL样品逐级转移至其余含有RAB的PCR管中。
  3. 立即将该排PCR管在37 °C下于热循环仪中孵育30分钟，随后保持在4 °C。当管子处于4 °C时打开各管，向每管加入2 µL的0.5 M EDTA（pH 8）以终止酶促反应。
  4. 灌制一块10%丙烯酰胺/1x TBE/10%甘油凝胶。取出梳子后，用1x TBE冲洗加样孔。向每个反应管中加入5 µL高分子量亲水性多糖（30% Ficoll溶于H2O），然后从每管中取15 µL上样（可通过Schlieren线观察上样过程）。
    1. 作为G4-DNA迁移率的对照，向20 µL RAB中加入4 µL高分子量亲水性多糖，并上样15 µL；作为解旋后的单体Z33的对照，将20 µL RAB在98 °C加热10分钟，加入4 µL高分子量亲水性多糖，然后上样15 µL。
  5. 使用1x TBE作为电泳缓冲液，在120 V电压下电泳2小时。使用具有荧光成像功能的多模式成像系统，配合TAMRA特异性滤光片（以532 nm绿光激光激发，采用580 nm带通30滤光片（580 BP 30））对凝胶进行成像。
    注意： 高活性的rG4R1制备物会在凝胶上前3个加样孔中实现TAMRA标记Z33的完全解旋，如图2所示。

6. 高活性 rG4R1 制剂的合并、分装与保存

注意：此步骤需要两人操作。纯化的 rG4R1 蛋白将用于下游的多种酶学检测，具体检测的数量和酶学需求将决定分装前需要制备的样品批次。一次典型的大规模制备通常合并 8 份高活性的制备样品（即总共使用 16 份经诱导的 500 mL 细菌培养物），但该数量并非固定，需根据实验室具体情况而定。

  1. 计算需要分装的高活性纯化rG4R1的总体积。通常在后续实验中使用7 µL的分装量。将设置为4 °C的PCR仪金属块中装入条状PCR管（用于分装，金属块的固体性质有助于快速封闭PCR条管）。
  2. 从-80 °C取出含有高活性rG4R1的PCR管，在手中快速融化；当管内仅剩少量冰晶时，立即将管子置于冰上。将所有快速解冻的样品合并至预冷的15 mL离心管中，充分混匀，并注意尽量减少气泡产生。
  3. 使用自动多通道移液器，将所需分装体积的样品加入PCR仪中预冷的条状PCR管中。一旦完成1–2排条管的分装，由第二人立即盖紧管盖，并将其转移至漂浮于液氮中的96孔板中（必须进行速冻以保持酶活性）。
    注意：每次使用自动移液器吸取rG4R1时，移液头内体积不要超过约200 µL，以减少酶在非4 °C环境下的暴露时间。
  4. 当PCR仪中预冷的条状PCR管完成分装并充分冷冻后，迅速将更多预冷的条状PCR管从冰上转移至PCR仪中，继续分装。重复此过程，直至剩余的所有酶液均完成分装、在液氮中速冻，并转移至干冰上。最后，将分装样品转移至-80 °C进行长期保存。

7. 纯化重组G4R1蛋白浓度的定量

  1. 倒入标准的5%浓缩胶/12%分离胶丙烯酰胺/SDS凝胶，用于蛋白质分离。
  2. 解冻约 50 µL 分装的 rG4R1，合并至同一离心管中，充分混匀。用移液器准确测量体积，并加入等体积的 2x Laemmli 上样缓冲液（65.8 mM Tris-HCl pH 6.8，26.3% (w/v) 甘油，2.1% SDS，0.02% 溴酚蓝）和 BME（每 950 µL 2x Laemmli 缓冲液中加入 50 µL BME）。在 98 °C 下变性蛋白 10 分钟。
  3. 在1×上样缓冲液加BME中配制广谱分子量标记物的稀释液，使以下蛋白量可作为标准品上样至凝胶：31.3、62.5、125、250和500 ng。
    注意： 每种广谱分子量标记物中的蛋白质标准品含量均为 0.1 µg/µL，50 kDa 蛋白质除外，其含量为 0.3 µg/µL。这些标记物无需加热变性。
  4. 从凝胶中取出梳子，用标准1x SDS/甘氨酸电泳缓冲液冲洗加样孔。加入相当于25 µL和12.5 µL的rG4R1（即50 µL和25 µL变性蛋白），但最佳上样酶量应由使用者根据酶制剂的浓度差异自行确定（例如， 35 µL 样品上样至凝胶中 图3)。加入第7.3步制备的蛋白质标准品。确保移液器已正确校准，并在移液操作中尽可能精确，以保证定量结果的准确性。
  5. 以120 V电压电泳，直至染料前沿迁移至凝胶约2/3处（以确保构成宽分子量范围蛋白标记物的蛋白质得到充分分离）。
  6. 用剃刀切除凝胶中不含蛋白质的部分并丢弃。将凝胶置于玻璃烤盘或等效容器中。用考马斯亮蓝染料（每100 mL含50 mg考马斯亮蓝R-250，溶剂为体积比50:10:40的甲醇:乙酸:水）染色2将已通过滤纸漏斗过滤的 O 在室温下置于设定为确保凝胶充分振荡的旋转摇床上过夜。
  7. 用体积比为30:10:60的甲醇:乙酸:水溶液脱色凝胶2使用揉成团的无绒毛纸巾加快脱色过程。根据需要更换脱色液。持续脱色至背景足够低，能够清晰观察到rG4R1和蛋白质标准品；此阶段典型的凝胶图像如图所示 图3.
  8. 将脱色后的凝胶置于透明文件保护膜之间，以不低于300 dpi的分辨率扫描凝胶。将扫描图像导入图像分析软件（如Fuji Multiguage或同等软件），利用对应于75、100和150 kDa的蛋白质标准品绘制标准曲线（曲线表示质量（克）与光密度读数之间的关系）。在获取光密度值的过程中，须对每个待定量泳道扣除背景信号。
  9. 假设所上样至凝胶的 rG4R1 体积中的蛋白含量处于这些标准曲线的线性范围内，则可推算出每微升 rG4R1 所含蛋白的克数。
  10. 使用G4R1的分子量（120,000 g/mol）将推算出的rG4R1克数转换为摩尔数。
    注意： 每块凝胶将产生三个外推值（分别对应用于生成标准曲线的三种蛋白质标记物：75、100 和 150 kDa）。再运行两块凝胶，并重复步骤 7.1–7.10 进行染色和定量。根据第一块凝胶的定量结果，用户可判断在后续凝胶中需要上样多少量的 rG4R1，以使其信号处于蛋白标准品的线性范围内。总共获得九个外推值，代表高活性纯化 rG4R1 的浓度。将这九个值取平均，得到该批次特异性的 rG4R1 浓度，通常在 20–100 nM 范围内。根据这些数值（n = 9）计算标准差。

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结果

本方案（图1）通常可获得近乎纯的、具有催化活性的rG4R1。作为酶活性的衡量指标，通常观察到在G4活性检测（上文所述，图2）中，0.2 pmol的TAMRA标记四链G4-DNA有50%被0.2 - 0.013 µL范围内的rG4R1转化为单体。经考马斯亮蓝染色，纯化的rG4R1在预期的120 kDa处显示单一主条带，另有一微弱的约75 kDa污染条带，可能代表仍保留结合G4-DNA磁珠能力并能以ATP依赖方式洗脱的截短型rG4R1（图3）。目标条带通过蛋白质标准曲线进行定量，本方案通常每升细菌培养物可获得200 µL浓度为20–100 nM的纯化酶。

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讨论

本方案提供了一种高效表达、纯化和定量分离DHX36基因产物G4解旋酶1（G4-Resolvase1，G4R1，亦称为RHAU和DHX36）的方法（图1）。该方案包含两个纯化步骤：首先利用钴亲和磁珠进行His标签亲和纯化，随后通过G4-DNA偶联磁珠进行酶学特异性纯化。其中第二步具有独特优势，充分利用了重组G4R1蛋白对G4结构所具有的高亲和力、高特异性以及催化解旋活性。由于G4R1对G4结构具有极强的亲和力（解离常数Kd处于低皮摩尔范围），因此在从G4磁珠上洗脱前可使用高盐缓冲液（接近NaCl溶解度极限）进行洗涤，显著减少非特异性结合蛋白的污染。此外，G4R1对G4结构的催化活性使其可在加入ATP和MgCl2后被特异性地洗脱出具有活性的重组蛋白。该两步纯化策略可稳定获得高纯度、具有催化活性的重组G4R1蛋白13，产量足以满足大多数生物化学分析的需求。

以下几个关键步骤可确保获得高产量、高纯度且具有催化活性的rG4R1。第一步是优化细菌表达菌株中His-rG4...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢以下资助方的支持，包括Ware基金会（资助J.P.V.）、美国国立卫生研究院资助项目T32-CA079448（资助P.J.S.）以及鲍尔州立大学的启动资金（资助P.J.S.）。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
TriEx4-DHX36 质粒Addgene68368
Rosetta2(DE3)plysS 感受态细胞Novagen71403-4
S.O.C 培养基Thermo Fisher Scientific15544034 
Difco 优质肉汤Becton Dickinson243820
甘油Sigma-AldrichG5516
氯霉素Sigma-AldrichC1919在细菌平板/大量培养中使用浓度为 35 µg/mL
羧苄青霉素（经植物细胞培养测试）Sigma-AldrichC3416在细菌平板/大量培养中使用浓度为 50 µg/mL
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）Sigma-AldrichI6758
溶菌酶（来自鸡蛋清）Sigma-AldrichL6876
1 M Tris-HCl，pH 8Universal Scientific Supply Co. 1963-B或来自标准来源
1 M Tris-HCl，pH 7Universal Scientific Supply Co. 1966或来自标准来源
1.5 M Tris-HCl，pH 8.8用于制备分离胶（用于蛋白质定量凝胶）；来自标准来源
1 M Tris-HCl，pH 6.8用于制备浓缩胶（用于蛋白质定量凝胶）；来自标准来源
1 M Tris-乙酸盐，pH 7.8Universal Scientific Supply Co. 1981或来自标准来源
70% 乙醇来自标准来源
氯化镁（1 M 溶液）Life TechnologiesAM9530G
氯化钠Sigma-AldrichS7653
乙酸钠Sigma-AldrichS8750
20x SSCUniversal Scientific Supply Co. 1665或来自标准来源
β-巯基乙醇（2-BME）Sigma-Aldrich63689
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP8849
亮抑蛋白半硫酸盐Sigma-AldrichL8511
链霉亲和素磁性珠PromegaZ5482
0.5 M EDTA，pH 8 Universal Scientific Supply Co. 0718或来自标准来源
0.2 M EDTA，pH 6Universal Scientific Supply Co. 来自标准来源；初始用 NaOH 调节 pH，再用 HCl 将 pH 调回。  
α-乳白蛋白（牛乳来源 I 型）Sigma-AldrichL5385
钴金属亲和珠Clonetech635502
L-组氨酸Sigma-AldrichH8000
冰醋酸Fisher ScientificA38-500
腺苷-5'-三磷酸（来自细菌来源）SigmaA7699
40% 丙烯酰胺/Bis 溶液（37.5:1）Biorad161-0148
甘氨酸Sigma-Aldrich50046用于配制蛋白凝胶电泳缓冲液（192 mM 甘氨酸，25 mM Tris 碱，0.1% SDS）
10% 十二烷基硫酸钠（SDS）Universal Scientific Supply Co. 1667用于配制蛋白凝胶电泳缓冲液（192 mM 甘氨酸，25 mM Tris 碱，0.1% SDS）；或来自标准来源
10x TBE Sigma-Aldrich11666703001或来自标准来源
Tris 碱Fisher ScientificBP152-1用于配制蛋白凝胶电泳缓冲液（192 mM 甘氨酸，25 mM Tris 碱，0.1% SDS）；来自标准来源
TEMEDSigma-Aldrich411019
过硫酸铵（APS）Sigma-AldrichA3678
广谱蛋白分子量标记物PromegaV8491
生物素标记的 Z33 寡核苷酸（"Z33-Bio"）Oligos Etc5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-生物素 3’
TAMRA 标记的 Z33 寡核苷酸（"Z33-TAM"）Oligos Etc5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
荧光涂层薄层色谱板Life TechnologiesAM10110
蔗糖Sigma-AldrichF263730% 溶于 H2O
考马斯亮蓝 R-250Sigma-Aldrich27816
甲醇Fisher ScientificA412
多波段紫外灯可发射 365 nm 紫外光
台式离心机（带摆动转子）可冷却至 4 °C
微量离心机可冷却至 4 °C
Digital SonfierBranson或具有等效功能的设备，可提供超声波脉冲（30% 振幅，2 秒开/2 秒关）
50 °C 水浴用于 Z33 形成四链体结构
37 °C 细菌培养箱用于细菌转化及携带 TriEx4-DHX36 质粒的 Rosetta2 E. coli 大量培养物的初始过夜生长
37 °C/14 °C 摇床培养箱（用于细菌）用于携带 TriEx4-DHX36 质粒的 Rosetta2 E. coli 大量培养物的生长和蛋白诱导
分光光度计可读取 OD600；可根据碱基序列测定寡核苷酸浓度（例如 Biorad SmartSpec 3000）
温度计来自标准来源
PCR 排管来自标准来源
15 和 50 mL 离心管（聚丙烯）来自标准来源
微量离心管（2.0 mL）来自标准来源
500 mL 离心瓶（聚丙烯）Thermo Scientific3141-0500
标准规格的移液器吸头和血清移液管来自标准来源
加样枪头来自标准来源
自动重复移液器用于快速分装 rG4R1；来自标准来源
PCR 仪来自标准来源
液氮来自标准来源
干冰来自标准来源
Laemmli 上样缓冲液 Biorad161-0737
大板凝胶电泳装置Biorad我们使用 Biorad 的 Protean II xi cell 装置
磁铁Life Technologies12301D我们使用 One Lambda（现为 Thermo Fisher Scientific 品牌）的磁铁；Life 也是 Thermo 的子公司，因此此处列出的磁铁应为合适替代品
剃须刀片来自标准来源
滤纸和漏斗来自标准来源
玻璃烧杯来自标准来源
旋转摇床来自标准来源
Kimwipes 纸巾来自标准来源
透明文件保护套来自标准来源
扫描仪及配套 TWAIN 软件来自标准来源
图像分析软件例如 Fuji Multiguage 或等效软件
Microsoft Excel或等效软件 

参考文献

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ATP依赖性纯化组氨酸标签酶钴珠层析链霉亲和素磁性微珠酶活性测定重组蛋白纯化细菌表达系统质量控制步骤
一种基于G-四链体DNA亲和力的方法用于纯化具有酶活性的G4解旋酶1
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