G4解旋酶1与G-四链体（G4）结构的结合亲和力是目前报道中G4结合蛋白中最强的，并且在HeLa细胞中构成了G4-DNA解旋活性的主体。本文描述了一种新方案，该方案利用G4-解旋酶1的高亲和力及其ATP依赖性的解旋活性，特异性纯化具有催化活性的重组G4R1蛋白。
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方法文章
一种基于G-四链体DNA亲和力的方法用于纯化具有酶活性的G4解旋酶1
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
一种称为G-四链体（G4、G4结构）的高级核酸结构可在DNA和RNA的富含鸟嘌呤区域形成，并具有高度的热稳定性。人类基因组中存在>375,000个假定的G4形成序列，这些序列在启动子区域、非翻译区（UTRs）以及端粒重复序列中富集。由于这些结构可能影响复制和转录等细胞过程，细胞已进化出相应的酶来调控它们。其中一种酶是G4解旋酶1（G4R1），该酶由我们的实验室与Nagamine 等共同通过生物化学方法表征，发现其可极紧密地结合G4-DNA和G4-RNA（Kd 处于低皮摩尔浓度范围）。G4R1是HeLa细胞裂解液中大部分G4解旋活性的来源，并已被证实参与端粒代谢、淋巴系统发育、基因转录、造血以及免疫监视等过程。高效表达和纯化具有催化活性的G4R1，对于希望进一步深入了解G4结构与G4解旋酶之间动力学相互作用的研究实验室而言具有重要意义。本文中，我们描述了一种重组G4R1（rG4R1）的详细纯化方法。该方法结合了传统的亲和层析纯化技术，利用在人类密码子优化的细菌中表达的C端组氨酸标签酶，并进一步利用rG4R1结合并解旋G4-DNA的能力，通过ATP依赖性的洗脱步骤获得高活性的纯化酶。本方案还包括一个质量控制步骤，通过检测纯化后的酶解旋G4-DNA的能力来评估rG4R1的酶活性。同时提供了一种用于定量纯化rG4R1的方法。文中还讨论了该方案的若干替代性优化策略。
引言
G4 结构是在 DNA 和 RNA 的富含鸟嘌呤区域中形成的高稳定性核酸二级结构。G4 结构通过 Hoogsteen 氢键相互作用以及中心空腔内与单价阳离子（i.e. K+ 和 Na+）的配位键合而得以稳定，这些阳离子对 G4 结构显著的热稳定性具有重要贡献1,2。早期的生物信息学研究表明，人类基因组包含 >375,000 个“潜在的 G4 形成基序”3,4。最近的研究估计表明，G4 基序的数量可能高出 2 至 5 倍5，而另一项研究预测人类基因组中存在 716,310 个不同的潜在 G4 形成序列6。G4 形成序列在进化上是保守的，并非在基因组中随机分布。G4 基序在基因编码区富集，且超过 40% 的基因启动子含有 G4 基序7。有趣的是，基因中 G4 基序的富集程度已被证明可提示该基因的功能。例如，原癌基因和参与发育的基因中的 G4 结构富集程度显著高于肿瘤抑制基因8,
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方案
1. 用于rG4R1纯化的G4-DNA结构的制备（生物素标记G-四链体DNA G-四链体的形成）
- 订购以下DNA寡核苷酸，命名为Z33-Bio，合成规模为1 µmole：5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-生物素 3’。确保生物素基团位于寡核苷酸的3’端。
- 配制10x G4缓冲液：450 mM Tris-HCl（pH 8）、25 mM EDTA和2,500 mM NaCl。
- 将Z33寡核苷酸溶于250 µL水中（使寡核苷酸浓度约为2.5 mM）。加入25 µL 10x G4缓冲液并混匀。将寡核苷酸在50 °C孵育约48小时。
- 短暂离心收集管壁冷凝液（约1,000 × g，10秒）。加入约50 µL高分子量亲水性多糖（30% Ficoll溶于H2O）并混匀。灌制一块10%丙烯酰胺/1x TBE/10%甘油凝胶（凝胶尺寸：16 cm × 16 cm × 1 mm）。待凝胶聚合完成后，用1x TBE冲洗加样孔，并将形成的Z33-Bio寡核苷酸均匀加样至凝胶大部分区域（可通过Schlieren条带观察样品上样情况）。
- 在凝胶一端的泳道中，加入少量经98 °C加热10分钟的寡核苷酸（作为无结构对照）；另在一个泳道中加入少量凝胶上样染料，用于监测电泳进程。
- 使用1x TBE作为电泳缓冲液，在120 V....
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结果
本方案（图1）通常可获得近乎纯的、具有催化活性的重组G4解旋酶1（rG4R1）。通过上述G4活性检测方法评估酶活性时通常发现，在0.2 - 0.013 µL的rG4R1用量范围内，0.2 pmol的TAMRA标记四链G4-DNA底物中有50%被转化为单体（图2）。纯化的rG4R1经考马斯亮蓝染色显示，在预期的120 kDa处出现单一主条带，另在约75 kDa处有一微弱杂质条带，该条带可能代表截短但仍保留结合G4-DNA磁珠能力并能以ATP依赖方式洗脱的rG4R1（图3）。目标条带通过蛋白质标准曲线进行定量，本方案通常每升细菌培养物可获得200 µL浓度为20–100 nM的纯化酶。
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讨论
本方案提供了一种高效表达、纯化和定量分离DHX36基因产物G4解旋酶1（G4-Resolvase1，G4R1，亦称为RHAU和DHX36）的方法（图1）。该方案包含两个纯化步骤：首先利用钴亲和磁珠进行His标签亲和纯化，随后通过G4-DNA偶联磁珠进行酶学特异性纯化。其中第二步具有独特优势，充分利用了重组G4R1蛋白对G4结构所具有的高亲和力、高特异性以及催化解旋活性。由于G4R1对G4结构具有极强的亲和力（解离常数Kd处于低皮摩尔范围），因此在从G4磁珠上洗脱前可使用高盐缓冲液（接近NaCl溶解度极限）进行洗涤，显著减少非特异性结合蛋白的污染。此外，G4R1对G4结构的催化活性使其可在加入ATP和MgCl2后被特异性地洗脱出具有活性的重组蛋白。该两步纯化策略可稳定获得高纯度、具有催化活性的重组G4R1蛋白13，产量足以满足大多数生物化学分析的需求。
以下几个关键步骤可确保获得高产量、高纯度且具有催化活性的rG4R1。第一步是优化细菌表达菌株中His-rG4.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢以下资助方的支持，包括Ware基金会（资助J.P.V.）、美国国立卫生研究院资助项目T32-CA079448（资助P.J.S.）以及鲍尔州立大学的启动资金（资助P.J.S.）。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| TriEx4-DHX36 质粒 | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS 感受态细胞 | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco 优质肉汤 | Becton Dickinson | 243820 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 氯霉素 | Sigma-Aldrich | C1919 | 在细菌平板/大量培养中使用浓度为 35 µg/mL |
| 羧苄青霉素（经植物细胞培养测试） | Sigma-Aldrich | C3416 | 在细菌平板/大量培养中使用浓度为 50 µg/mL |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| 溶菌酶（来自鸡蛋清） | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl，pH 8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | 或来自标准来源 |
| 1 M Tris-HCl，pH 7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | 或来自标准来源 |
| 1.5 M Tris-HCl，pH 8.8 | 用于制备分离胶（用于蛋白质定量凝胶）；来自标准来源 | ||
| 1 M Tris-HCl，pH 6.8 | 用于制备浓缩胶（用于蛋白质定量凝胶）；来自标准来源 | ||
| 1 M Tris-乙酸盐，pH 7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | 或来自标准来源 |
| 70% 乙醇 | 来自标准来源 | ||
| 氯化镁（1 M 溶液） | Life Technologies | AM9530G | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | 或来自标准来源 |
| β-巯基乙醇（2-BME） | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| 亮抑蛋白半硫酸盐 | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| 链霉亲和素磁性珠 | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA，pH 8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | 或来自标准来源 |
| 0.2 M EDTA，pH 6 | Universal Scientific Supply Co. | 来自标准来源；初始用 NaOH 调节 pH，再用 HCl 将 pH 调回。 | |
| α-乳白蛋白（牛乳来源 I 型） | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| 钴金属亲和珠 | Clonetech | 635502 | |
| L-组氨酸 | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| 冰醋酸 | Fisher Scientific | A38-500 | |
| 腺苷-5'-三磷酸（来自细菌来源） | Sigma | A7699 | |
| 40% 丙烯酰胺/Bis 溶液（37.5:1） | Biorad | 161-0148 | |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | 50046 | 用于配制蛋白凝胶电泳缓冲液（192 mM 甘氨酸，25 mM Tris 碱，0.1% SDS） |
| 10% 十二烷基硫酸钠（SDS） | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | 用于配制蛋白凝胶电泳缓冲液（192 mM 甘氨酸，25 mM Tris 碱，0.1% SDS）；或来自标准来源 |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | 或来自标准来源 |
| Tris 碱 | Fisher Scientific | BP152-1 | 用于配制蛋白凝胶电泳缓冲液（192 mM 甘氨酸，25 mM Tris 碱，0.1% SDS）；来自标准来源 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| 过硫酸铵（APS） | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 广谱蛋白分子量标记物 | Promega | V8491 | |
| 生物素标记的 Z33 寡核苷酸（"Z33-Bio"） | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-生物素 3’ | |
| TAMRA 标记的 Z33 寡核苷酸（"Z33-TAM"） | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| 荧光涂层薄层色谱板 | Life Technologies | AM10110 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% 溶于 H2O |
| 考马斯亮蓝 R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A412 | |
| 多波段紫外灯 | 可发射 365 nm 紫外光 | ||
| 台式离心机（带摆动转子） | 可冷却至 4 °C | ||
| 微量离心机 | 可冷却至 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | 或具有等效功能的设备，可提供超声波脉冲（30% 振幅，2 秒开/2 秒关） | |
| 50 °C 水浴 | 用于 Z33 形成四链体结构 | ||
| 37 °C 细菌培养箱 | 用于细菌转化及携带 TriEx4-DHX36 质粒的 Rosetta2 E. coli 大量培养物的初始过夜生长 | ||
| 37 °C/14 °C 摇床培养箱（用于细菌） | 用于携带 TriEx4-DHX36 质粒的 Rosetta2 E. coli 大量培养物的生长和蛋白诱导 | ||
| 分光光度计 | 可读取 OD600；可根据碱基序列测定寡核苷酸浓度（例如 Biorad SmartSpec 3000） | ||
| 温度计 | 来自标准来源 | ||
| PCR 排管 | 来自标准来源 | ||
| 15 和 50 mL 离心管（聚丙烯） | 来自标准来源 | ||
| 微量离心管（2.0 mL） | 来自标准来源 | ||
| 500 mL 离心瓶（聚丙烯） | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| 标准规格的移液器吸头和血清移液管 | 来自标准来源 | ||
| 加样枪头 | 来自标准来源 | ||
| 自动重复移液器 | 用于快速分装 rG4R1；来自标准来源 | ||
| PCR 仪 | 来自标准来源 | ||
| 液氮 | 来自标准来源 | ||
| 干冰 | 来自标准来源 | ||
| Laemmli 上样缓冲液 | Biorad | 161-0737 | |
| 大板凝胶电泳装置 | Biorad | 我们使用 Biorad 的 Protean II xi cell 装置 | |
| 磁铁 | Life Technologies | 12301D | 我们使用 One Lambda（现为 Thermo Fisher Scientific 品牌）的磁铁；Life 也是 Thermo 的子公司，因此此处列出的磁铁应为合适替代品 |
| 剃须刀片 | 来自标准来源 | ||
| 滤纸和漏斗 | 来自标准来源 | ||
| 玻璃烧杯 | 来自标准来源 | ||
| 旋转摇床 | 来自标准来源 | ||
| Kimwipes 纸巾 | 来自标准来源 | ||
| 透明文件保护套 | 来自标准来源 | ||
| 扫描仪及配套 TWAIN 软件 | 来自标准来源 | ||
| 图像分析软件 | 例如 Fuji Multiguage 或等效软件 | ||
| Microsoft Excel | 或等效软件 |
参考文献
- Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).
- Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H.
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重印与许可
