原子力显微镜研究核苷酸切除修复中的DNA损伤识别

摘要

此处研究不同的DNA损伤识别方法 通过 以核苷酸切除修复系统为例，展示了单分子原子力显微镜成像技术。文中描述了DNA和蛋白质样品制备的步骤，以及原子力显微镜实验的操作与分析细节。

摘要

原子力显微镜成像是一种研究蛋白质-DNA相互作用的有力技术。这种单分子方法能够在异质样品中同时分辨不同的分子及分子组装体。在DNA相互作用蛋白体系的特定背景下，可以由此区分不同形式的蛋白质复合物及其在含有DNA片段的靶位点上的结合位置。本文介绍了一种将原子力显微镜应用于原核和真核生物核苷酸切除修复（NER）系统中DNA损伤识别研究的方法。文中描述了DNA和蛋白质样品的制备步骤，并提供了实验及数据分析的详细信息。这些数据有助于得出关于NER蛋白如何实现靶位点验证策略的重要结论。有趣的是，它们表明真核NER系统针对不同类型的DNA损伤采取了不同的识别与鉴定机制。此外，参与原核和真核NER系统的两种不同解旋酶具有各自独特的结构特性，这解释了这两个系统所表现出的不同策略。重要的是，这些实验和分析方法不仅可应用于DNA修复研究，同样也可广泛用于其他DNA相互作用蛋白体系的研究，例如参与复制或转录过程的系统。

引言

原子力显微镜（AFM）是一种用于分析蛋白质-DNA相互作用的有力技术^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}仅需少量样品即可在单分子水平上直接观察具有异质性的样品。这种异质性可能源于蛋白质的不同构象状态或寡聚状态。特别是在蛋白质-DNA样品中，蛋白质复合物可能因DNA的结合（无论是非特异性结合还是特异性结合至DNA上的特定靶位点）而呈现出不同的化学计量比和/或构象。异质性样品中还可能包含两种或多种不同类型的蛋白质，以及不同的蛋白质复合物形式例如，由单一类型蛋白质组成的同源复合物与由多种蛋白质组成的异源复合物）与DNA的相互作用方式可能存在差异。本文所讨论的研究利用原子力显微镜（AFM）在空气中对静态、干燥的DNA修复蛋白与含有损伤位点的长片段DNA（约900个碱基对，bp）结合样品进行成像。AFM具有较高的分子分辨率，可区分不同类型的蛋白质复合物，并确定蛋白质在DNA片段上的结合位置。重要的是，DNA底物中的损伤位点被引入至明确的位置。由于DNA中损伤位点的位置已知，因此通过分析蛋白质在DNA上的结合分布，可深入了解（不同）蛋白质复合物对损伤识别的特性差异。 例如，它们对特定类型损伤（相对于未受损DNA）的识别能力如何^2,3,4,5,6它们在DNA上的位置还可用于区分特异性结合于损伤位点的蛋白质复合物与非特异性结合于DNA其他区域的复合物。对这两类不同复合物（特异性结合于损伤位点的复合物与非特异性复合物）进行分别表征，可揭示复合物在靶位点识别过程中可能发生的构象变化。

本文重点关注的DNA修复蛋白是负责核苷酸切除修复（NER）通路中损伤识别的解旋酶。在细菌中，NER由UvrA、UvrB和UvrC三种蛋白共同完成。UvrA负责在UvrA₂UvrB复合物中进行初始的损伤识别₂UvrB₂ DNA扫描复合物。在UvrB确认损伤后，该复合物转变为单体UvrB并结合于损伤位点，这一特异性复合物可进一步招募原核NER内切酶UvrC。UvrC切除包含损伤的短片段单链DNA（ssDNA，12–13 nt）。随后，由DNA聚合酶填补缺失的片段，最后由DNA连接酶将新合成的片段与原始DNA连接起来。^9,10在真核生物中，核苷酸切除修复（NER）级联反应的大多数蛋白质属于大型多亚基转录因子IIH（TFIIH）复合物的一部分。在初始损伤识别之后 通过 三聚体CEN2-XPC-HR23B复合物招募TFIIH至DNA靶位点。当复合物内的XPD确认存在NER靶向损伤后，真核NER内切核酸酶XPG和XPF被招募，以切除包含该损伤的短片段（24–32 nt）单链DNA^9,10此处特别研究了原核和真核核苷酸切除修复（NER）中的解旋酶UvrB和XPD。这些解旋酶需要DNA中的一个未配对区域（即DNA泡状结构），以便将其加载到两条DNA单链中的一条上，并随后在ATP水解供能下沿该单链进行易位。因此，在底物中除了DNA损伤外，还引入了作为蛋白质加载位点的DNA泡状结构。

特异性损伤DNA底物的制备方法此前已有描述¹¹。该方法需要一个含有两个紧密相邻切刻酶（nickase）识别位点的环状DNA构建体（质粒）。在本研究中，使用了质粒pUC19N（2729 bp）（由NIEHS的S. Wilson实验室构建）。该质粒包含三个紧密相邻的Nt.BstNBI切刻酶识别位点，界定出一段48个核苷酸（nt）的区域。经切刻酶孵育后，可将这些位点之间的单链DNA片段切除，并用含有任意目标结构的寡核苷酸替换。每一步操作后，均通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全。与原始的超螺旋质粒相比，切刻后的环状DNA因电泳迁移率较低而可被区分。通过使用一种仅在切刻区域之间的底物序列内切割的限制性内切酶进行消化，可评估DNA的切口形成以及特异性底物寡核苷酸对被移除片段的替换情况。因此，对于已形成切口的DNA，该酶无法使环状质粒线性化；而在插入特异性寡核苷酸后，线性化能力则得以恢复。最后，利用两个内切酶限制性位点（理想情况下为单一切割位点），可生成线性DNA底物，其长度可根据需要设计，目标位点位于特定位置，同时在损伤位点的5'或3'方向一定距离处形成一个DNA泡状结构。

可通过NER解旋酶对损伤位点的识别进行研究 通过 AFM成像。解旋酶在损伤位点处的DNA转位停滞，在DNA上的蛋白位置分布中表现为一个峰，表明损伤识别的发生。由于这些解旋酶的DNA转位具有方向性，呈5'至3'极性，因此损伤识别对加载位点位置（损伤上游或下游的DNA泡）的依赖性还可揭示损伤更倾向于在被转位的单链DNA链上还是在相反的未被转位的单链DNA链上被识别。^5,9在接下来的部分中，将介绍所使用的方法，并简要讨论这些实验的主要发现。重要的是，类似于此处展示的DNA修复研究范例，原子力显微镜（AFM）成像可应用于不同DNA相互作用体系的研究，例如DNA复制或转录。^8,12,13,14.

方案

1. 样品制备

1. DNA底物的制备¹¹
   1. 在质粒中产生单链DNA缺口
      1. 在反应管中，使用适当的切刻酶（此处为 Nt.BstNBI）对质粒样品（此处为修饰后的 pUC19，即 pUC19N）进行完全消化，并根据制造商提供的说明书进行酶的热失活处理（示意图见图1）。起始反应体系建议为约 50 µL，质粒浓度约为 500 nM，以获得足够的产物产量。
      2. 通过琼脂糖凝胶电泳检测稀释样品（约 20 nM）中的质粒切刻¹⁵佩戴手套以防护用于DNA显像的DNA结合染料。
         注意：不同的电泳迁移率可用于区分切口（松弛）型和超螺旋型环状质粒DNA图1).
      3. 通过加入约10倍过量的互补寡核苷酸（寡核苷酸1）孵育，从质粒中移除切口位点之间的ssDNA片段 表1），在加热块中于接近寡核苷酸熔解温度的条件下（此处为 pUC19N，68 °C）以 300 rpm 振荡 30 分钟图1).
      4. 使用50 kDa分子量截留（MWCO）滤膜，在台式离心机中以10,000 × g离心10分钟，将带缺口的质粒与较小的DNA片段分离图1将滤膜倒置并插入新的1.5 mL离心管中，以1,000 x g离心3分钟，以洗脱浓缩的DNA。
      5. 用去离子过滤水将所得的浓缩DNA样品补至500 µL，加入约5倍过量的互补寡核苷酸，并重复步骤1.1.1.3和1.1.1.4至少3次。
      6. 通过使用适当的限制性内切酶（此处为 XhoI 或 BglII）在制造商推荐条件下孵育，检测 DNA 是否完全形成切口。使用稀释后的（切口型与切口-缺口型）DNA 样品（约 20 nM）。进行琼脂糖凝胶电泳，以区分线性化质粒（不含单链缺口）与未切割 DNA（含缺口 DNA），其中以切口型 DNA 作为阳性对照，并加入 DNA 分子量标记物作为参考。 图1佩戴手套。
   2. 使用修饰的单链DNA寡核苷酸填补缺口
      1. 退火带有缺口的质粒 通过 孵育约25倍过量的5'磷酸化寡核苷酸，该寡核苷酸包含选定的特异性靶位点，于约45 °C孵育4小时图1）。此处使用含有损伤的48 nt单链DNA，损伤类型为荧光素加合的胸腺嘧啶或环丁烷嘧啶二聚体（CPD），并附加一段短的（8 nt）非互补序列以形成DNA泡状结构（参见 表1).
      2. 根据制造商说明书，使用T4 DNA连接酶在室温下孵育过夜，将退火后的插入片段共价连接至质粒图1）。在此反应中，加入含有ATP的浓缩缓冲液储存溶液，以形成适合连接酶作用的缓冲条件（例如，使用 UvrB 反应缓冲液：50 mM Tris-HCl pH 7.5，10 mM MgCl₂，50 mM KCl，5 mM DTT，1 mM ATP。
      3. 通过使用适当的限制性内切酶（同1.1.1.6步骤）消化稀释后的样品，按照制造商提供的方案进行处理，随后进行琼脂糖凝胶电泳（同1.1.1.6步骤），以检测特异性寡核苷酸是否插入缺口质粒中 图1).
   3. 线性DNA底物的制备
      1. 使用限制性内切酶对修饰后的质粒DNA进行消化（理想情况下选用在质粒中具有单一酶切位点的限制性内切酶），反应条件依照制造商推荐的方案进行（图1）。此步骤可产生在特定位置含有插入修饰的线性片段。此处使用 SspI 和 BspQI 分别在插入片段上游 613 bp 和下游 255 bp 处进行切割，从而获得一个 916 bp 的 DNA 片段，其中特异性损伤位点位于 DNA 长度约 30% 的位置。
         注意：对于此处所述的原子力显微镜（AFM）成像实验，长度在约200 bp至约2,000 bp之间的DNA片段是合适的底物。
      2. 分离目标片段 通过 琼脂糖凝胶电泳及使用商业试剂盒进行凝胶回收。佩戴手套以作防护。
      3. 可选地，使用解剖刀将琼脂糖凝胶切割，以分离DNA标记物和稀释样品泳道（前两道）与含有待纯化浓缩DNA的泳道。仅将凝胶的前两道所在部分置于紫外灯台上，使其暴露于紫外照射。
         1. 用手术刀切下对应目标片段的条带。将凝胶的两部分重新合并（移离紫外灯下）。以稀释样品中切除条带的位置作为参照，确定所需DNA底物条带的位置。由于浓度较高，应比稀释对照组切取稍宽的胶片。
            注意：由于本研究旨在探究紫外线损伤的识别，因此引入了额外的紫外线损伤 通过 通过该方法，可有效避免DNA底物受到紫外线照射。
      4. 计算DNA浓度 c 根据紫外-可见分光光度计在260 nm处测得的吸光度，利用朗伯-比尔定律及双链DNA（dsDNA）的平均摩尔消光系数计算 ε_{260 nm} 约 6,700 M⁻¹ 厘米⁻¹ 每碱基对：
         
         其中 L 为光程（测量池长度，通常为1 cm）。
2. 蛋白质的表达与纯化
   1. 重组表达UvrB E. coli 并纯化该蛋白质 通过 标准几丁质珠亲和¹⁵ 和尺寸排阻色谱¹⁵ 如前所述¹⁶.
      注意： uvrB 基因来自 Bacillus caldotenax 已克隆至pTYB1载体中。
   2. 表达 XPD E. coli 并纯化该蛋白质 通过 标准镍IDA亲和¹⁵ 和尺寸排阻色谱¹⁵ 随后进行阴离子交换层析¹⁵，如先前所述¹⁷.
      注意：该基因的 嗜热毛壳菌 着色性干皮病 组D蛋白（XPD）已被克隆至pBADM11载体中。 C. thermophilum p44 由 Caroline Kisker 实验室惠赠，其表达与纯化方法如文献所述¹⁷.

2. 原子力显微镜实验

1. 样品制备
   1. 可选步骤：将DNA底物在65 °C加热块中预孵育10分钟，以去除可能在冰箱储存期间形成的微量盐结晶。
   2. 配制反应缓冲液（10倍浓度，即10x缓冲液）。
      注意：XPD 反应缓冲液（1x 浓度）包含 20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM KCl、5 mM MgCl₂₂，1 mM TCEP，2 mM ATP；1× UvrB 反应缓冲液包含 50 mM Tris-HCl pH 7.5，50 mM KCl，10 mM MgCl₂，5 mM DTT 和 1 mM ATP。
   3. 在适宜的孵育条件下，将蛋白质以较高浓度预先孵育，以促进复合物的形成。取少量体积进行预稀释（例如，将1 µL的各蛋白质加入1x蛋白质反应缓冲液中至所需浓度，并混合小体积（例如在0.5 mL反应管中分别加入各蛋白质溶液1 µL。
      1. 将试管置于加热模块中，用于高于室温的孵育。根据预期的复合物化学计量比选择浓度比例，可采用等摩尔比或相应浓度。此处，将1 µL XPD（20 µM，溶于1 x XPD反应缓冲液）与1 µL p44（20 µM，溶于1x XPD反应缓冲液）混合，使两者的终浓度均为10 µM，在37 °C下孵育10分钟。
   4. 在0.5 mL反应管中，将样品于蛋白反应缓冲液中按适当的蛋白和DNA浓度孵育。此处使用500 nM UvrB或1 µM XPD + 1 µM p44，以及100 nM DNA。为节约试剂，使用微量移液器加入小体积液体。 例如，加入0.25–0.5 µL蛋白质（预先稀释至10倍反应浓度）和DNA，总体积为2.5–5 µL的1×蛋白反应缓冲液。将反应体系在37 °C金属浴中孵育30分钟。在台式离心机中短暂离心反应管（约1秒），以确保小体积液体充分混匀。
2. 样品沉积
   1. 准备云母基底：切割一块约 1 x 1 cm 的云母² 使用解剖刀从较大的云母条上切下一小片云母。利用胶带剥离多层云母矿物片的顶层，以暴露出洁净、平整且原子级光滑的基底表面。
      注意：可通过剥离更多层来重复使用云母片进行多次实验。
   2. 使用去离子过滤水配制AFM点样缓冲液， 例如，25 mM HEPES（pH 7.5），25 mM 醋酸钠，10 mM 醋酸镁。用 0.02 µm 注射器滤器过滤。
      注意：沉积缓冲液中的二价阳离子可螯合带负电荷的DNA分子，使其结合到云母表面，而云母在中性pH下同样带负电荷。如果使用相对较高浓度的Mg²⁺²⁺ 沉积缓冲液中的离子浓度可能对特定的蛋白质-DNA体系造成问题，此时可采用基于硅杂环戊烷的化学方法预先在云母表面修饰氨基，以提供带正电荷的表面用于锚定¹⁸随后可在不含或仅含少量二价阳离子的缓冲液中进行样品沉积。
   3. 将样品（见2.1）用沉积缓冲液稀释后，立即滴加到云母片上，滴加少量体积（此处为20 µL）。
      注意：稀释倍数取决于样品浓度。此处将样品稀释50–100倍。经验法则为：约1 nM的DNA可使约1,000 bp的片段获得良好的表面覆盖度。
   4. 立即用几毫升过滤的去离子水冲洗样品三到四次，吸去多余液体，并用温和的氮气流吹干。从样品沉积到获得干燥样品的整个过程可在30秒内完成。
   5. 用胶带将云母片边缘固定在显微镜载玻片上。
      注意：不同的原子力显微镜（AFM）系统对样品在载物台上的固定方式有不同的要求。其他AFM系统具有磁性载物台，云母片需固定在磁性圆盘上。 例如，使用热熔胶。所用原子力显微镜（AFM）系统的详细信息见材料表。
3. 原子力显微镜成像
   1. 将样品（参见2.2.5）置于原子力显微镜载物台中央，并用磁性垫片将显微镜载玻片固定在载物台上。
   2. 将原子力显微镜（AFM）探针插入探针架中。使用带有尖锐探针的悬臂（<10 nm）原子力显微镜探针，适用于空气中振荡式间歇接触模式成像。使用原子力显微镜探针，例如下所列 材料表根据原子力显微镜（AFM）型号，将探针插入探针夹持器中，并通过拧紧夹具螺丝（手动拧紧）将其固定。将探针夹持器插入AFM测量头中。此步骤中，将测量头背部朝下放置。
   3. 将原子力显微镜（AFM）测量头置于样品上方。具体操作取决于AFM型号。此处需确保测量头的支脚稳定地位于载物台的凹槽内。确保云母片位于载物台上，使AFM探针能够在其正上方悬停。载物台右侧的微调螺丝可用于对样品进行精细定位。
   4. 将原子力显微镜（AFM）的激光对准悬臂背面，以获得位置敏感光电探测器上最强的信号，激光被反射至该探测器。具体操作细节取决于AFM型号。
      1. 此处，转动原子力显微镜（AFM）测量头右侧和后侧的旋钮，调节AFM激光的x轴和y轴位置，使其准确对准悬臂末端中心。在AFM视频窗口中观察反射信号（如具备该功能，可点击摄像图标并选择输入源：S-video）。
      2. 粗略定位后，通过调节两个旋钮微调激光位置，优化探测器的总和信号（AFM软件中“总和与偏转测量仪”窗口中的Sum）。保持激光位于悬臂末端，总和信号的数值取决于AFM仪器和悬臂类型（此处：目标值约为8.5）。 >5).
   5. 通过将原子力显微镜（AFM）激光反射调节至探测器阵列中心（此处：转动AFM测量头左侧的旋钮），对探测器阵列上下两个光电二极管的差分信号（此处：总和与偏转信号窗口中的偏转信号）进行调零。
      注意：与零值的偏差表示由于表面相互作用引起的悬臂梁偏转，原子力显微镜（AFM）将该偏转转换为高度信息。
   6. 使用AFM软件中的频率调谐功能（此处：主控面板/调谐窗口中的auto tune命令）确定悬臂梁的共振频率。选择与驱动悬臂梁振荡的压电元件输入1 V相对应的振幅。将振荡频率设置为略低于共振频率（约5%），并将振荡相位调零。
   7. 使用粗调进样模式（此处：主控面板窗口中的“Engage”命令）将探针尖端接近样品表面，直至达到保护设定值（设定点）。以自由振荡幅度的约 2% 衰减作为设定点（此处，在主控面板中输入设定点 980 mV）。
   8. 使用原子力显微镜（AFM）软件降低设定点，使AFM针尖与样品表面精细接触。成像时应进入排斥模式，悬臂振荡相位（“总和与偏转仪”窗口中的相位）应略低于自由振荡状态下的相位（接触前，此处通常约为70）。最终设定点通常为自由振幅（1 V）的70%至80%。
   9. 扫描前，在主通道面板中选择用于记录的信号，选择高度（Ht）和振幅（Am）。
   10. 开始样品扫描（此处为“主控面板”窗口中的“Do Scan”命令）。使用例如2.5 µm/s的扫描速度（“主控面板”中的“Scan Speed”命令），对4 µm × 4 µm或8 µm × 8 µm的扫描区域（在“主控面板”中输入“Scan Size”）进行成像，像素分辨率为2,048或4,096（分别为“主控面板”中的“Scan Points”和“Scan Lines”）。
   11. 保存图像文件（主面板中的“保存图像”命令），不进行拟合修改（在主通道面板/保存平面拟合中选择“无”）。
   12. 对于进一步分析，处理已保存的图像。加载图像（在AFM分析菜单中选择“浏览已保存数据”命令）。打开修改面板（按图像顶部区域的M键）。对高度图像（扩展名HtR）在x和y方向上应用平面拟合（在修改面板的“平面拟合”窗口中选择“XY”命令，选择平面拟合阶数3）。然后对图像进行平整化处理（在修改面板的“平整化”窗口中选择“平整化”命令），选择平整化阶数3。
   13. 将图像导出为TIFF文件（点击图像顶部区域的Commands，选择对应2,048像素分辨率的TIFF Export 2x），以供进一步分析。

3. 原子力显微镜分析

1. 蛋白质复合物体积
   1. 通过原子力显微镜软件中对图像进行直接目视检查，预筛选相关的蛋白质-DNA复合物，采用合适的配色方案以最大化不同大小复合物的外观差异（参见不同复合物在 图2；此处：AFM 软件中的 SeaLandAndFire 颜色方案。 对于XPD样品，可能的复合物包括 XPD/p44-DNA 以及 XPD-DNA 以及 p44-DNA，由于其相对较大的不同分子质量，二者大小明显不同 XPD （约95 kDa）和p44（约40 kDa）。
   2. 测量DNA上各个蛋白质峰的体积以确认复合物类型。可使用不同的图像软件实现此操作（此处使用原子力显微镜软件中的截面分析工具）。
      1. 使用截面窗口的游标测量蛋白质峰截面的高度（h）和直径（d）。直径应在颗粒截面靠近底部的位置进行测量。
      2. 使用简单的数学模型确定峰的体积（V）， 例如，使用以下基于球冠模型的公式：
         
   3. 将测量的体积转换为近似的蛋白质分子质量。
      1. 首先，使用一系列已知分子量的蛋白质对原子力显微镜（AFM）系统进行体积到分子量（MW）转换的校准（此处：针对5种不同的蛋白质，分别在其单体、二聚体、三聚体或四聚体状态下，共进行了12次实验，每次实验包含25至851个数据点）。 ^4,19,20. 沉积并成像蛋白质（如上文2.2和2.3所述），并按照上述方法（3.1.2）测量其体积。将测得的体积对其已知的分子量作图。所得图形将显示体积（V）与分子量（MW）之间的线性关系，该关系可通过数据拟合直线获得方程。对于本实验所用的AFM系统，得到如下关系式¹⁹:
         
         注意：此步骤无需在每次测量前重复进行，仅需执行一次。在相似成像条件下，使用直径略有差异的原子力显微镜探针所获得的图像，均可应用该分子量校准曲线。
      2. 根据测得的体积（3.1.2）以及体积与分子量的校准关系（3.1.3.1），确定蛋白质复合物的近似分子量²⁰，可提供其分子组成的信息。 例如。对于XPD/p44样品，分别观察到约50 kDa、约100 kDa和约140 kDa的条带，与p44-DNA复合物（或仅由DNA高级结构引起的峰）、仅XPD峰以及XPD/p44峰一致。
2. 蛋白质复合物在DNA上的定位
   1. 确定DNA片段长度。
      1. 在原子力显微镜图像中追踪DNA片段 例如，使用合适图像分析软件的手绘线功能（例如，参见材料表）并测量该线条的长度。
         注意：排除DNA聚集体以及被图像边缘裁切的片段。
      2. 使用合适的数据分析和绘图软件，将整个实验中获得的DNA长度数据分组并绘制直方图例如，参见 材料表).
      3. 使用数据分析与绘图软件对长度分布进行高斯曲线拟合，以确定 DNA 片段的长度。为了确定插入 DNA 目标位点的位置（见 1.1），仅包含长度在高斯曲线中心两个标准差范围内的 DNA 片段（y = y₀ + z exp(-2(x-x_c)²/ w²），其中 z 为归一化因子，x_c 和 w 分别为高斯分布的中心值和半高全宽，在进一步的分析中使用。
         注意：高斯曲线中心处的DNA长度应接近DNA片段的理论长度（按0.34 nm/bp计算）。比理论值短达10%的情况较为常见，可能是由于原子力显微镜（AFM）分辨率的限制所致。
   2. 确定蛋白质峰在DNA底物上的位置。
      1. 按照3.2.1.1节所述，测量蛋白质峰距离较近的DNA片段末端的距离，并除以DNA总长度，得到以DNA长度分数为单位的距离。
      2. 使用合适的数据分析与绘图软件，将测得的距离数据分组并绘制直方图（参见 例如, 图3作为经验法则，选择一个能使数据点数量 n 产生约 √n 个区间（bin）的区间大小。
         注意：由于此处无法区分DNA末端，作图时仅显示至DNA长度的0.5（DNA片段中心）。由于DNA末端结合并非本研究的重点，为排除DNA末端对分析的影响，应在位置0稍后处开始对位置数据进行分箱处理。例如，此处：从0.02的DNA长度片段进行分箱。
   3. 根据蛋白质复合物位置分布确定靶位点特异性。
      1. 将最大值（增强结合事件）在位置分布中的曲线拟合为高斯曲线，方法同3.2.1.3，但以背景结合高度为基底（参见 图3).
      2. 计算特异性 S 特定位点与非特异性DNA背景（蛋白质分子结合于非特异性DNA位点）的比值，使用以下公式计算²¹
         
         A_sp：特异性复合物的数量（高斯曲线下的面积）
         A_nsp：非特异性复合物的数量（背景区域的面积， 即 （DNA长度比例）×（平均背景高度y）₀）；此处DNA长度的覆盖比例为0.48（直方图起始于0.02 DNA长度）
         N：可能的DNA结合位点数量（此处：N = 914，不包括DNA末端）
3. DNA 弯曲角度
   1. 使用合适的图像分析软件中的角度测量工具，测量沿DNA骨架中心放置的两条线之间的夹角β，顶点位于蛋白质信号峰中心（参见 例如，插图位于 图4）。对具有统计学意义数量的蛋白质-DNA复合物测量角度（>50，理想情况下 >100)^2,3,5.
      注意：DNA 弯曲角度定义为 180°-β^2,3,5.
   2. 使用数据分析与绘图软件（见材料表），通过将 DNA 弯曲角度分组，生成弯曲角度分布直方图。
   3. 使用高斯曲线拟合弯曲角度分布。如果分布中出现多个明显峰值，则选择多峰高斯拟合。高斯曲线的中心位置给出该物种的平均弯曲角度状态。
   4. 如果不同蛋白质变体或不同蛋白质复合物种类的分布中弯曲角度（高斯拟合的极大值）出现明显偏移，则应采用学生t检验来评估该变化的显著性水平。

结果

基于蛋白质复合物体积区分不同类型的复合物

原核生物核苷酸切除修复（NER）解旋酶UvrB的解旋酶活性在结合DNA后得到增强^22,23。UvrB需要DNA中的一个未配对区域（即DNA泡状结构），才能正确加载到两条单链DNA中的一条上。体内，这种DNA结构由NER级联中的另一个蛋白质介导的DNA相互作用提供；而在体外实验中，可在双链DNA片段中靠近靶向损伤的位置人工引入泡状结构。蛋白质-蛋白质相互作用也能增强UvrB对DNA的结合能力⁹。然而，一旦UvrB加载到DNA上，其活性似乎不再依赖于蛋白辅因子⁹。相比之下，真核生物NER解旋酶XPD需要与蛋白p44相互作用才能激活其解旋酶活性，p44与XPD一样，在体...

讨论

对结合在包含特定靶位点的长DNA片段上的蛋白质结合位置进行原子力显微镜（AFM）统计分析，可以揭示蛋白质识别这些位点所采用的特定策略的有趣细节^2,3,4,5,6。为了正确解读所获得的位置分布结果，必须精确知道DNA中靶位点的位置。这可通过将特定序列位点引入环状质粒DNA的已知序列位置，再利用限制性酶切技术切下包含该特定位点的DNA片段来实现。在AFM图像分析蛋白质结合位置时，仅能纳入长度正确的DNA片段（即与切下的完整片段长度一致），因为只有这些片段的靶位点位置是已知的。值得注意的是，此处所述的制备方法产生的是两端无法区分的线性DNA底物。因此，位置分布只能从0 × DNA长度（蛋白质结合于DNA片段末端）到0.5 × DNA长度（蛋白质结合于片段中心）进行测量和绘制。此外，对于未精确位于底物中心的靶位点，这些分布...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分子力探针（MFP）3D	Asylum Research	N/A	原子力显微镜（AFM）
Precision 390	DELL	N/A	计算机
ThermoMixer 及 1.5 mL 块	Eppendorf	5382000015	用于DNA制备的加热块
Rotilabo 恒温金属浴 H 250 &以及适用于 0.5 mL 离心管的模块	卡尔·罗斯有限公司	Y264.1 && Y267.1	用于蛋白质-DNA 孵育的加热块
Mini-Sub Cell GT	伯乐生命科学有限公司	1704467	带有凝胶灌注装置和电源的电泳槽
Power Pac Basic	伯乐生命医学产品（上海）有限公司	1645050	电泳电源
Centifuge 5415 D 配转子	Eppendorf	2262120-3	台式离心机
Ultra-Lum 电子紫外透射仪 MEB-15	超亮	900-1322-02	紫外照射台
NanoDrop ND-1000	VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH	N/A	紫外分光光度计
TKAX-CAD 加 0.2 μm胶囊滤器	Unity Lab Services	N/A	去离子水过滤装置
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>软件
Igor Pro 上的 MFP 软件	Asylum Research	N/A	原子力显微镜软件
ImageJ（开源Java图像处理）	NIH Image	N/A	图像分析软件
Excel（Microsoft Office）	微软公司	N/A	数据分析软件
Origin9 / Origin2016	OriginLab Corporation	N/A	统计数据分析与绘图软件
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>材料
OMCL-AC240TS	奥林巴斯	OMCL-AC240TS	AFM悬臂梁
V-5级白云母	SPI Supplies	1805	云母片
Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell	Millipore 爱尔兰有限公司	UFC505096	离心过滤器
NucleoSpin Extract II	Macherey-Nagel GmbH	740 609.250	琼脂糖凝胶回收试剂盒
Rotilabo 纤维素滤纸 111A 型	卡尔罗斯特有限责任公司	AP59.1	原子力显微镜沉积印迹纸
Anatop 25 (0.02 μm)	Whatman GmbH	6809-2102	注射器滤器
SSpI，BspQI	新英格兰生物实验室（NEB）	R0132, R0712	用于DNA底物制备的限制性内切酶
XhoI, BglII		R0146, R0144	用于DNA制备对照的限制性内切酶
切刻限制性内切酶 Nt.BstNBI	New England Biolabs（NEB）	R0607	nickase
T4 DNA连接酶	新英格兰生物实验室（NEB）	M0202S	连接酶
Tris、HEPES	卡尔·罗斯有限公司	4855, 9105	缓冲液化学试剂
NaCl, MgCl2，KCl，MgAcetate	Carl Roth GmbH	3957, HN03, HN02, P026	盐类化学品
NaAc	Sigma-Aldrich Chemie GmbH	32318	盐类化学品
DTT、TCEP、EDTA		6908, HN95, 8040	化学品/试剂
琼脂糖，乙酸，HCl	卡尔·罗斯有限公司	2267, 3738, K025	试剂
ATP	卡尔罗斯特有限责任公司	K054	核苷酸
表1中的寡核苷酸#1	Biomers	定制	互补DNA寡核苷酸
表1中的寡核苷酸#2、#3和#6	Integrated DNA Technologies (IDT)	定制	含荧光素的寡核苷酸
寡核苷酸 #4  以及表1中的#5	私有（可从 TriLink 或 GlenResearch 等供应商获取）		含环嘧啶二聚体的寡核苷酸
SafeSeal反应管 0.5 mL和1.5 mL	Sarstedt	72.704 和 72.706	孵育管
GeneRuler 1 kb	赛默飞世尔科技	SM0311	DNA 标准分子量标记
6x 浓缩凝胶上样缓冲液（紫色）	New England Biolabs (NEB)	51406	DNA上样染料
Midori Green	Nippon Genetics Europe GmbH	999MG28055	DNA染料