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方法文章

转基因小鼠外周接种α-突触核蛋白纤维后神经炎症的生物发光成像

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DOI：

10.3791/55503

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2017年4月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Centre for Prions and Protein Folding Diseases & Department of Biochemistry, University of Alberta

本文内容

摘要

向表达人类α-突触核蛋白A53T家族性突变和萤火虫荧光素酶的Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠腹腔或舌部外周注射α-突触核蛋白纤维，可诱导其中枢神经系统产生神经病理学改变，包括神经炎症。

摘要

为了研究错误折叠α-突触核蛋白的朊病毒样行为，需要能够快速且简便地传播α-突触核蛋白朊病毒样颗粒并引发中枢神经系统（CNS）神经病理学改变的小鼠模型。本文描述了将α-突触核蛋白纤维注射到双转基因Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠体内，足以诱导神经病理学疾病，注射途径可为舌内注射或腹腔注射。该小鼠模型在朊病毒蛋白启动子驱动下过表达携带A53T突变的人源α-突触核蛋白，并在胶质纤维酸性蛋白（Gfap）启动子驱动下表达萤火虫荧光素酶。与纯合子Tg(M83+/+)小鼠相比，后者从8个月龄开始出现严重的神经系统症状，而杂合子Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠在达到22个月龄前不会自发产生疾病。有趣的是，通过腹腔注射α-突触核蛋白纤维后，五只Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠中有四只出现以瘫痪为特征的神经系统疾病，中位潜伏期为229 ± 17天。患病动物的大脑和脊髓中出现大量磷酸化α-突触核蛋白的沉积。这些α-突触核蛋白聚集体不溶于沙克斯尔（sarkosyl），并与泛素和p62共定位，同时伴随炎症反应，导致星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化。出乎意料的是，舌内接种α-突触核蛋白纤维在诱导疾病方面效果较差，五只注射小鼠中仅有一只在285天后表现出α-突触核蛋白病理改变。我们的研究结果表明，通过舌内途径接种，尤其是通过腹腔途径接种，能够在Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠中成功诱导具有突触核蛋白病典型特征的神经系统疾病。这为深入研究由α-突触核蛋白朊病毒样颗粒引发的朊病毒样发病机制提供了一个新的模型。

引言

越来越多的证据表明，α-突触核蛋白具有与朊病毒蛋白相似的特性，尤其是在其能够自我成核并在细胞之间以及沿神经通路传播错误折叠方面。α-突触核蛋白的特性也被称为“类朊病毒”或“朊样”，这一观点得到了移植实验观察结果的支持，提示错误折叠的α-突触核蛋白可从病变神经元传播至新移植的健康神经元。1,2,3,4此外，将错误折叠的α-synuclein直接注射到脑内或外周组织中， 例如 后肢肌肉或肠壁的病变会导致α-突触核蛋白病理学改变在中枢神经系统远端部位扩散5,6,7,8,9,10我们进一步详细分析了α-突触核蛋白朊病毒样物质通过外周途径的传播，并探讨了一个问题：错误折叠的α-突触核蛋白在单次舌内或腹腔注射后是否可能侵入中枢神经系统（CNS），这一特性此前已在朊病毒中得到证实，但在错误折叠的α-突触核蛋白中尚未见报道。在将朊病毒注射至舌部后，其可通过舌下神经通路传播，进而实现向中枢神经系统的神经侵入，最终到达位于脑干的舌下神经核。11我们选用Tg(M83)作为小鼠模型+/-:Gfap-luc+/-) 过表达在朊病毒启动子驱动下的人源A53T突变型α-突触核蛋白以及在控制下的萤火虫荧光素酶的小鼠 Gfap 通过生物发光监测星形胶质细胞活化，该方法此前已在朊病毒感染小鼠脑组织中得到验证12在我们实验室中，双转基因Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-小鼠直到23月龄时才发病，这一点已被其他研究证实13通过舌内或腹腔途径单次注射人源α-突触核蛋白纤维，可在Tg(M83)小鼠的脑和脊髓中诱导出具有病理特征的神经系统疾病。+/-:Gfap-luc+/-)小鼠，支持α-突触核蛋白朊病毒样颗粒与朊病毒具有重要相似特征的假说14.

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方案

所有涉及动物的实验程序均获得北莱茵-威斯特法伦州环境署（LANUV）动物保护委员会的批准。动物饲养和护理均按照标准条件进行，保持12小时光照/12小时黑暗循环，并可自由获取食物和水。

1. 动物模型

  1. 将半合子 Tg(Gfap-luc+/-) 小鼠与半合子 Tg(M83+/-) 小鼠杂交，以获得半合子双转基因 Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) 小鼠15,16。
  2. 使用实时 PCR 检测后代中编码人源 α-突触核蛋白的转基因，同时使用标准 PCR 检测萤火虫荧光素酶12,17。
  3. 在动物六至八周龄时进行接种。

2. 接种物制备

  1. 按照先前所述方法，在含有150 mM NaCl的20 mM Tris-HCl（pH 7.2）Tris缓冲盐水（TBS）中制备带有A53T突变的单体重组人源α-突触核蛋白14。
  2. 将3 µg/µL的单体重组人源α-突触核蛋白置于旋转摇床中，以800 rpm转速在37 °C下振荡5天，以制备用于接种的纤维状α-突触核蛋白。
  3. 将纤维聚集体用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，使终浓度达到腹腔注射用1 µg/µL或舌内注射用2 µg/µL。
  4. 在冰上使用棒状超声仪对α-突触核蛋白纤维进行超声处理，设置为50%振幅，每次脉冲0.5秒，共40次脉冲，脉冲间间隔1秒，总时长1分钟。为避免交叉接种导致的污染，每次制备不同接种物时应使用洁净的超声探头。

3. 舌内注射

  1. 通过腹腔注射给予动物 100 mg/kg 的氯胺酮和 10 mg/kg 的赛拉嗪进行麻醉。轻捏动物的脚趾，确认其后肢无回缩反应，以确保麻醉效果充分。在麻醉期间，使用兽用眼膏涂抹动物眼睛，防止角膜干燥。
  2. 将麻醉后的动物小心地用胶带固定在加热板上，呈仰卧位，头部朝向操作者。
  3. 用 27 G 一次性皮下注射器吸取 5 µL 超声处理后的 α-突触核蛋白纤维或 PBS。
  4. 使用一把带锯齿尖端的钝头镊子夹住动物的口腔使其张开，再用另一把较小的镊子小心地将舌头拉出，以便暴露舌底侧用于注射。
  5. 将注射器针头刺入舌底右侧或左侧靠近舌下神经的区域。等待 5 秒后缓慢注入接种物。注射完成后，再等待 5 秒，然后缓慢退出针头，以确保接种物已渗入组织且在拔针过程中不发生泄漏。
  6. 解除动物的固定，将其留在加热板上，并持续监测直至完全苏醒。

4. 腹腔注射

  1. 进行腹腔注射时，将动物置于麻醉舱中，以2 L/min的流速和2%的蒸发器设定，通过吸入异氟烷/氧气进行短暂麻醉。轻捏动物脚趾，确认其后肢无回缩反应，以确保麻醉效果充分。
  2. 用27 G一次性皮下注射针头吸取50 µL超声处理后的α-突触核蛋白纤维或PBS。
  3. 将小鼠保持背侧朝上、头部朝下并偏离操作者约45°的体位，直接将针头插入腹腔，注意避免穿透位于腹壁后方的小肠或盲肠。持续观察动物，直至其从麻醉中恢复。

5. 生物发光成像

  1. 每2至4周使用生物发光成像系统对Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠进行成像。
  2. 成像前，将小鼠置于异氟烷/氧气麻醉舱中进行短暂麻醉，气体流速为2 L/min，蒸发器设置为2%。轻捏小鼠脚趾，确认其后肢无回缩反应，以确保麻醉充分。
  3. 使用脱毛膏对小鼠头部进行剃毛和脱毛处理。用无刺激性记号笔将耳朵涂成黑色，以阻断非特异性生物发光信号。
  4. 将D-荧光素钾盐（荧光素酶的底物）用PBS溶解，配制成30 mg/mL的储存液。分装为1 mL等份，于-20 °C保存。避免溶解后的D-荧光素暴露于光线下。
  5. 注射前称量小鼠体重。根据150 mg/kg体重计算所需D-荧光素的确切注射体积。经腹腔注射D-荧光素后，将小鼠放回麻醉舱中。
  6. 启动成像软件。待成像系统达到工作温度后，在控制面板中点击“Initialize”按钮以初始化系统。
  7. 选择“Luminescent”和“Photograph”按钮。设置曝光时间为60秒，binning为“Medium”，F/Stop为“1”，EM增益为“Off”。
  8. 确认激发滤光片设置为“Block”，发射滤光片设置为“Open”，并将样本高度设为1.50 cm。
  9. 注射D-荧光素10分钟后，将小鼠放置于成像舱内的加热板上，确保其鼻部正确对准麻醉气体出口。关闭吸入麻醉舱的异氟烷/氧气气流，开启成像舱的气流，流速为0.25 L/min，蒸发浓度为2%。妥善关闭成像舱门。
  10. 点击“Acquire”按钮开始采集生物发光信号，采集过程持续60秒。随后停止异氟烷供气，并将小鼠放回笼中，密切观察直至其完全恢复。
  11. 使用成像软件对生物发光信号进行定量分析。在“Tool Palette”中选择“ROI Tools”。在“ROI Tools”下的“Type”中选择“Measurement ROI”。
  12. 在“ROI Tools”中点击"circle"工具，并从下拉菜单中选择需绘制的ROI数量——理想情况下为三只小鼠选择“3”。
  13. 在图像上，对每个ROI右键点击，在“Properties”中将宽度和高度调整为1.25 cm。将每个ROI定位至需要定量的脑区上方。
  14. 在图像左上角，将单位面板设置为“radiance (photons)”。
  15. 在“Tool Palette”中选择“Image Adjust”，并调整“Color Scale”的最小值和最大值，例如从0.20e6调整至1.00e6。
  16. 在“File”菜单下，选择“Save”保存数据。

6. 生物化学分析

  1. 根据既定方案分离脑组织和脊髓18,19。
  2. 在蛋白酶和磷酸酶抑制剂（用 PBS 稀释至 1x）存在下，分别将全脑和全脊髓样本在 PBS 中匀浆，使用组织匀浆器以 6,000 rpm 进行两次 30 秒的匀浆。确保脑和脊髓样本被匀浆至终浓度为 20%（wt/vol）。
  3. 将样本置于冰上，使用超声波仪以 50% 振幅持续脉冲 10 秒，进行两次超声处理。
  4. 通过将匀浆液与 PBS 中的 1.5 M NaCl 按 1:1 比例稀释，调整匀浆液至 PBS 中含 10%（vol/vol）和 750 mM NaCl。
  5. 为去除细胞碎片，将匀浆液在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟。保留上清液用于后续步骤，弃去沉淀。
  6. 根据制造商说明书，使用二辛可宁酸（BCA）法测定匀浆液中的蛋白浓度。将脑匀浆液中的 1.0 mg 总蛋白或脊髓匀浆液中的 0.8 mg 总蛋白与 N-月桂酰肌氨酸混合，终浓度为 10%（wt/vol），在冰上孵育 15 分钟。
  7. 将匀浆液铺在 3 mL 10%（wt/vol）蔗糖垫（溶于蒸馏水）上，在 4 °C 条件下以 465,000 × g 超速离心 1 小时。
  8. 将沉淀重悬于含有 4% 十二烷基硫酸钠（SDS）、2% β-巯基乙醇、192 mM 甘氨酸、25 mM Tris 和 5%（wt/vol）蔗糖的缓冲液中。
  9. 将样本在 100 °C 下煮沸 5 分钟，然后上样至 SDS-聚丙烯酰胺凝胶，在吗啉乙磺酸（MES）缓冲系统中进行电泳。
  10. 在半干转印系统中，将分离的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
  11. 将膜置于含 0.4%（vol/vol）甲醛的 PBS 溶液中，在室温下以 35 rpm 在旋转器上孵育 30 分钟，使蛋白质与膜交联。
  12. 在含有 0.05%（vol/vol）Tween 20 和 5%（wt/vol）脱脂奶粉的 TBS 缓冲液中，室温封闭膜 1 小时。
  13. 将膜在封闭缓冲液中与一抗于 4 °C 过夜孵育。
  14. 用 TBS 缓冲液洗涤膜三次，然后在 TBS 中与辣根过氧化物酶或荧光染料标记的二抗室温孵育 1 小时。
  15. 根据既定方案20，通过化学发光或荧光检测结合的二抗信号。

7. 免疫荧光分析

  1. 将解剖得到的脑和脊髓组织在组织处理仪中进行脱水，并使用石蜡包埋仪将其包埋于石蜡中。
  2. 用切片机将石蜡包埋的组织切成8 µm厚的冠状切片，并将切片贴附于载玻片上。
  3. 将组织切片先后置于两份二甲苯溶液中各孵育5至10分钟以脱蜡，再通过一系列梯度乙醇溶液（100%、90%、70%、50%）进行水化，最后用H2O处理。
  4. 将切片在0.01 M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中室温孵育5分钟，并在微波炉中煮沸10分钟。
  5. 让切片冷却至室温，然后用3%过氧化氢溶液孵育30分钟，以抑制内源性过氧化物酶活性。
  6. 用含20%（体积比）正常山羊血清、1%（体积比）牛血清白蛋白（BSA）和0.5% Triton X-100的PBS溶液在室温下孵育1小时，对组织切片进行封闭。
  7. 将切片与一抗在含1%（体积比）正常山羊血清、1%（体积比）BSA和0.25% Triton X-100的PBS溶液中4 °C孵育过夜。
  8. 用含0.25%（体积比）Triton X-100的PBS溶液洗涤两次，再用PBS洗涤一次。
  9. 将切片与相应荧光染料标记的二抗以及核染料DAPI在含1%（体积比）正常山羊血清、1%（体积比）BSA的PBS溶液中室温孵育1小时。
  10. 用含0.25%（体积比）Triton X-100的PBS溶液洗涤两次，再用PBS洗涤一次，随后用封片剂封片，并使用共聚焦激光扫描显微镜观察染色结果。

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结果

通过舌部或腹腔外周注射α-突触核蛋白朊病毒样物质，可在双转基因Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠的中枢神经系统（CNS）中诱导神经病理学改变（表1和图1）。单次腹腔注射α-突触核蛋白纤维后，5只小鼠中有4只出现神经系统疾病，平均潜伏期为229 ± 17天。出乎意料的是，经舌内注射α-突触核蛋白纤维后，5只小鼠中仅有1只在285天后出现中枢神经系统疾病。注射PBS的小鼠在420天的实验周期内未出现任何疾病。

通过蛋白质印迹法进行生化分析，并使用针对α-突触核蛋白Ser129位点的磷酸化特异性EP1536Y抗体进行检测，结果显示，经两种传播途径感染的患病动物脑组织和脊髓中均积累了磷酸化且嗜硫素不溶性的α-突触核蛋白聚集物（表2和图2）。相比之下，P...

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讨论

将α-突触核蛋白纤维通过腹腔注射至Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠体内，是一种可诱导神经系统疾病并伴随神经炎症的简便方法，能够重现突触核蛋白病的重要特征。类似地，舌部注射是α-突触核蛋白朊病毒样物质在转基因小鼠中实现神经侵袭的另一途径，但效率较低。我们选择在注射后420天终止实验，不能排除更多甚至全部注射纤维的小鼠在更晚时间点发病的可能性。此外，使用Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠可实现对星形胶质细胞增生的无创可视化，为监测α-突触核蛋白神经侵袭在整个小鼠生命周期中所引发的炎症反应提供了一种简便方法。

一个关键步骤是接种物的制备。看似微不足道的因素，如聚集时间、超声处理时间、内毒素的含量，或用于注射的纤维数量，都可能通过影响错误折叠α-突触核蛋白的种子效应倾向而影响实验结果21。因此，在制备用于注射的接种物时，始终采用相同的条件非常重要。进行舌内注射时需考虑到，不仅舌下神经，其他颅...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Olga Sharma、Theresa Hundt 以及德国神经退行性疾病中心（DZNE）显微镜和动物设施部门工作人员提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗肌动蛋白抗体默克密理博MAB1501
抗α-突触核蛋白、磷酸化S129抗体 [pSyn#64]和光015-25191
抗α-突触核蛋白、S129位磷酸化抗体 [EP1536Y]Abcamab51253
抗GFAP抗体DakoZ0334 01
抗IBA-1抗体和光019-19741
抗Sequestosome-1（p62）抗体Proteintech18420-1-AP
抗泛素抗体 [Ubi-1]默克密理博MAB1510
磷酸盐缓冲液（PBS）Invitrogen14190169
氯胺酮 Ratiopharm100 mg/kg
赛拉嗪Ratiopharm10 mg/kg
27 G 注射器VWR613-4900
异氟烷 Piramal HealthcarePZN  4831850
脱毛膏Veet
Secureline 实验室标记笔 Neolab25040
D-荧光素钾盐AcrisLK1000030 mg/mL 储备液
恒温混匀仪Eppendorf5776671
Sonopuls Mini20 超声波破碎仪Bandelin3648
IVIS Lumina II 成像系统PerkinElmer
Living Image 3.0 软件PerkinElmer
Tg(M83)+/-) 小鼠或 B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J 小鼠杰克逊实验室004479
标准型镊子Fine Science Tools11000-16
窄型纹式镊子精细科学工具11002-12
N-月桂酰基肌氨酸SigmaL5125-100G
Optima Max-XP 超速离心机 贝克曼库尔特TLA-110 转子 
厚壁聚碳酸酯管贝克曼库尔特362305
NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi 蛋白凝胶赛默飞世尔科技WG1401BOX
HRP 标记抗体CaymanCay10004301-1
IR Dye 680 标记抗体 LI-COR 生物科学926-68070
SuperSignal West Dura 延长发光底物赛默飞世尔科技34075
Stella 3200 成像系统Raytest
Odyssey红外成像系统 LI-COR 生物科学
Tween 20 MP BiomedicalsTWEEN 201
Triton X-100SigmaSA/T8787
Immobilon-FL PVDF 膜默克密理博IPFL00010
二甲苯SigmaRoth
过氧化氢SigmaSA/00216763/000500工作液 3%
牛血清白蛋白（BSA） 赛默飞世尔科技A3294-100G
山羊血清赛默飞世尔科技PCN5000
4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）赛默飞世尔科技D1306工作稀释度 1:50,000
Fluoromount 封片剂 OmnilabSA/F4680/000025
LSM700 共聚焦激光扫描显微镜卡尔·蔡司
HALT蛋白酶和磷酸酶抑制剂赛默飞世尔科技 10516495
Precellys 24-Dual 匀浆仪 Peqlab91-PCS24D
Alexa Fluor 488 标记抗体赛默飞世尔科技A31619
Alexa Fluor 594 标记抗体赛默飞世尔科技A11005
皮尔斯 BCA 蛋白质 检测 试剂盒赛默飞世尔科技10741395
切片机 RM2255Leica
LSM700 共聚焦激光扫描显微镜卡尔·蔡司

参考文献

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