需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

使用定量实时 PCR 检测大鼠腹膜中 microRNA 的表达

7.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/55505

⸱

2017年6月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用实时定量反转录聚合酶链式反应检测大鼠腹膜中微小RNA表达的实验方案。该方法适用于研究多种病理条件下大鼠腹膜中微小RNA的表达谱。

摘要

微小RNA（miRNA）是一类小分子非编码RNA，可在转录后水平调控信使RNA的表达。大鼠多种器官和组织中的miRNA表达谱已被广泛研究。然而，针对大鼠腹膜中miRNA的纯化及其表达检测，目前尚无标准化的方法。我们建立了一种高效且可靠的实验方法，利用实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）对大鼠腹膜中的miRNA进行纯化与定量分析。本实验方案包括四个步骤：1）腹膜样本的分离纯化；2）从腹膜样本中提取包含miRNA在内的总RNA；3）将miRNA逆转录为cDNA；4）通过qRT-PCR检测miRNA的表达水平。应用该方法，我们成功发现，在大鼠腹膜纤维化模型中，六种miRNA（miRNA-142-3p、miRNA-21-5p、miRNA-221-3p、miRNA-223-3p、miRNA-327和miRNA-34a-5p）在腹膜中的表达水平较对照组显著升高。该实验方案可用于研究多种病理状态下大鼠腹膜中miRNA的表达谱。

引言

microRNA（miRNA）是一类短链非编码RNA，可在转录后水平调控信使RNA（mRNA）的表达1。miRNA表达水平的变化可调控多种mRNA的表达，这些mRNA在癌症、炎症、代谢紊乱和纤维化等多种病理过程中发挥关键作用2,3,4,5,6,7,8。因此，miRNA在新型生物标志物和治疗靶点方面具有潜在应用价值2,3,4,5,6,7,8。目前已在多种大鼠器官和组织（包括肝脏、心脏、肺和肾脏）中确定了miRNA的表达谱9。然而，针对大鼠腹膜中miRNA的纯化与检测，尚未建立标准化的方法。

本方案的总体目标是成功纯化并检测大鼠腹膜中的miRNA。首先，使用玻璃匀浆器对腹膜组织样本进行匀浆处理，随后在微量离心柱中利用生物聚合物降解系统进行处理10。接着，采用基于二氧化硅膜的离心柱从腹膜组织样本中纯化总RNA（包括miRNA）10。然后，以纯化的总RNA为模板，在逆转录酶、多聚腺苷酸聚合酶和寡核苷酸-dT引物的作用下合成cDNA11。最后，通过使用嵌入染料的qRT-PCR方法检测miRNA的表达水平11。本方案的理论依据来自先前的研究，这些研究表明，通过简单的流程即可在组织中实现miRNA的有效纯化与检测8,10,11。已有报道指出，使用微量离心柱中的生物聚合物降解系统以及基于二氧化硅膜的离心柱，能够从组织中纯化出高质量的总RNA10。此外，本方案中采用逆转录酶、多聚腺苷酸聚合酶和寡核苷酸-dT引物从纯化总RNA合成cDNA的方法，以及利用嵌入染料通过qRT-PCR检测miRNA表达的方法，均已被证实具有高准确性和高灵敏度11。同时，该流程操作简便，节省时间，并可减少技术误差。因此，本方案适用于在多种病理条件下需要对大鼠腹膜中miRNA进行高精度、高灵敏度检测的研究工作。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物实验方案均经日本医科大学动物伦理委员会批准，并依照日本医科大学实验动物使用与护理指南中的规定进行。

1. 腹膜样本采集

  1. 准备以下物品：装有浸透异氟烷棉球的50 mL离心管、软木板、含磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿、手术剪和镊子。
  2. 使用过量异氟烷处死一只大鼠，然后用70%乙醇喷洒大鼠腹部皮肤，并将其仰卧固定在软木板上。
  3. 使用剪刀和镊子在腹部皮肤、肌肉和腹膜上做纵向切口。
  4. 用镊子夹起腹膜，用手术剪在其上部沿膈肌下方最低肋骨处和下侧外侧区域做横向切口。接着，用手术剪做外侧纵向切口，将腹膜从体内移除。然后，在培养皿中用PBS清洗腹膜。
  5. 使用手术剪和镊子切取并修整20 mg（3–5 mm2）的腹膜组织样本，此尺寸适用于后续步骤。

2. 从腹膜样本中纯化总RNA

注意：此处使用玻璃匀浆器和微型离心柱中的生物聚合物剪切系统，将重为 20 mg 的腹膜组织样本进行匀浆处理。随后，采用基于二氧化硅膜的离心柱法从腹膜组织样本中分离总 RNA。

  1. 准备以下物品：1.5 或 2.0 mL 微量离心管、100% 乙醇、氯仿、玻璃匀浆器、冰、置于微量离心柱中的生物大分子剪切系统10、基于二氧化硅膜的离心柱10、酚/胍类裂解试剂、含胍和乙醇的洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 1）以及含乙醇的洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 2）。
  2. 取 20 mg 腹膜组织样本放入玻璃匀浆器中，并加入 700 µL 酚/胍类裂解试剂。
  3. 通过缓慢下压并旋转研杵的方式对腹膜组织样本进行匀浆。在冰上重复此操作数十次，直至腹膜组织样本完全溶解于酚/胍类裂解试剂中。
  4. 为进一步实现充分匀浆，将匀浆后的裂解液转移至置于 2.0 mL 收集管中的微量离心柱式生物大分子剪切系统中，随后在 4 °C 条件下以 14,000 × g 离心 3 分钟。
  5. 将匀浆后的裂解液转移至新的微量离心管中。
  6. 向匀浆裂解液中加入 140 µL 氯仿，盖紧管盖，然后通过反复倒置混匀 15 秒。
  7. 将样本在室温下孵育 2–3 分钟，随后在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟。
  8. 小心吸取上清液（通常为 300 µL）至新的微量离心管中，避免扰动沉淀物，并加入 1.5 倍体积的 100% 乙醇（通常为 450 µL），然后涡旋振荡混匀 5 秒。
  9. 用移液器将最多 700 µL 的样品加入置于 2.0 mL 收集管中的基于二氧化硅膜的离心柱中，盖紧柱盖，随后在 15,000 × g 条件下离心 15 秒。离心后弃去收集管中的穿流液。
  10. 向基于二氧化硅膜的离心柱中加入 700 µL 洗涤缓冲液 1，以严格洗涤样本。盖紧柱盖，随后在 15,000 × g 条件下离心 15 秒。离心后弃去收集管中的穿流液。
  11. 向基于二氧化硅膜的离心柱中加入 500 µL 洗涤缓冲液 2，以去除任何残留的盐分。盖紧柱盖，随后在 15,000 × g 条件下离心 15 秒。离心后弃去收集管中的穿流液。
  12. 重复步骤 2.11。
  13. 再次将基于二氧化硅膜的离心柱在 15,000 × g 条件下离心 1 分钟。离心后弃去收集管中的穿流液。
  14. 将基于二氧化硅膜的离心柱转移至新的 1.5 mL 收集管中，然后向柱中加入 25 µL 无 RNase 水。盖紧柱盖，在室温下静置 5 分钟，随后在 15,000 × g 条件下离心 1 分钟。
  15. 将含有总 RNA 的 25 µL 洗脱液转移至新的微量离心管中，使用前于 −80 °C 保存。

3. 总RNA的逆转录

注意：参考并遵循《定量实时PCR实验发表的最低信息标准》（MIQE）指南有助于促进良好的实验实践，并获得可靠且明确的结果12。
注意：此处使用逆转录酶、poly(A)聚合酶和oligo-dT引物，将1.0 µg的总分离RNA进行逆转录。

  1. 准备以下物品：1.5 mL 微量离心管；八联管；无 RNase 水；冰；逆转录试剂盒（见材料表）11。
  2. 配制主混合液，每管包含 2.0 µL 10x 核酸混合液、2.0 µL 逆转录酶混合液（来自试剂盒）和 4.0 µL 5x hi-spec 缓冲液，总体积为 8.0 µL。
  3. 将 8.0 µL 主混合液（来自试剂盒）分装至各管中。
  4. 使用分光光度计测定总 RNA 的量。向每管中加入从腹膜样本中提取纯化的 1.0 µg 总 RNA。
    注意：可直接以总 RNA 为模板进行 qRT-PCR，用于检测纯化总 RNA 的质量。若存在 DNA 污染，qRT-PCR 将出现非预期的扩增产物。
  5. 向每管中加入无 RNase 水，使总体积达到 20 µL。然后通过移液器充分混匀，并离心 15 秒。
  6. 将样品在 37 °C 下孵育 60 分钟，随后立即在 95 °C 下孵育 5 分钟。
    注意：此步骤可在热循环仪中进行。
  7. 将 cDNA 转移至新的微量离心管中，并用无 RNase 水稀释 10 倍（1:10）。
  8. 稀释后的 cDNA 可暂时置于冰上保存，长期保存则应置于 −80 °C，使用前取出。

4. miRNA 的 qRT-PCR

注意：miRNA 的 qRT-PCR 检测使用嵌合染料法。此处使用的引物针对 RNA、U6 小核 RNA 2（RNU6-2）、miRNA-142-3p、miRNA-21-5p、miRNA-221-3p、miRNA-223-3p、miRNA-327 和 miRNA-34a-5p。

  1. 收集以下物品：1.5 mL 微量离心管、用于 qRT-PCR 的 96 孔反应板、96 孔反应板用粘性封膜、miRNA 特异性引物、基于绿色染料的 PCR 试剂盒（参见材料表）11以及实时荧光定量PCR仪。
  2. 配制主混合液，每孔包含12.5 µL的2x PCR主混合液、2.5 µL浓度为5 µM的miRNA引物（溶于无核酸酶水中）和1.25 µL的10x通用引物。
  3. 向96孔板的每个孔中加入22.5 µL的预混液。
  4. 向每个孔中加入 2.5 µL 模板 cDNA。
  5. 用96孔反应板专用粘性封板膜密封反应板，然后在1,000 × g条件下离心30秒。
  6. 使用实时荧光定量PCR仪及其配套软件，按照以下程序运行PCR扩增循环。
    1. 将 PCR 板放入实时荧光定量 PCR 仪中。在实时荧光定量 PCR 软件中设置实验参数（输入实验名称，选择 "96孔" 对于实验类型的仪器，选择 "2−ΔΔCT 方法" 对于定量方法，选择 "SYBR Green 试剂" 用于检测目标序列的试剂，选择 "标准斜坡速度" 用于仪器运行。
    2. 然后，为每个孔中的样本和目标miRNA分配名称。样本应始终进行双复孔或三复孔检测，以获得足够的数据用于结果验证。选择参考样本和内参对照。选择 "无" 作为被动参照使用的染料
    3. 输入反应体积 "20 µL" 按照实时荧光定量PCR软件中的说明设置以下PCR扩增循环条件：95 °C预变性15 min，随后进行40个循环，每个循环包括94 °C变性15 s、55 °C退火30 s、70 °C延伸30 s。
  7. 使用实时PCR仪器的软件分析qRT-PCR数据。确认软件自动设定的阈值和基线在每个孔中均合适。
  8. 检测各样本中目标miRNA的循环阈值（Ct值）。循环阈值是指扩增曲线与阈值线的交点。随后，以RNU6-2作为内参对照，对目标miRNA的表达水平进行归一化处理，并采用2−ΔΔCt法计算目标miRNA的相对表达水平。−ΔΔCT 方法13.
    注意：应验证内源性对照miRNA表达水平的稳定性。在本实验中，RNU6-2被证实于各组中均呈高表达且相对稳定。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本文结果基于我们先前报道的研究8。我们研究了腹膜纤维化中的miRNA表达谱。腹膜纤维化是腹膜透析的主要并发症，其特征是间皮细胞单层的丧失以及细胞外基质成分的过度积聚，并与腹膜膜功能衰竭相关14,15。通过向12周龄、体重为230–250 g的雄性大鼠每周5天腹腔注射100 mL/kg腹膜透析液（含2.5%葡萄糖、100 mM NaCl、35 mM乳酸钠、2 mM CaCl2、0.7 mM MgCl2和20 mM甲基乙二醛）持续3周，建立腹膜纤维化大鼠模型16。以下组别作为对照：未接受任何处理的大鼠（假处理大鼠）和注射不含甲基乙二醛的腹膜透析液的大鼠（对照大鼠）。根据miRNA微阵列筛选结果，通过本论文所述的qRT-PCR方法检测发现，与假处理大鼠和对照大鼠相比，腹膜纤维化大鼠腹膜组织中6种miRNA（miRNA-142...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

采用本论文所述方案，已成功从大鼠腹膜中纯化并利用qRT-PCR检测了miRNA。qRT-PCR数据分析的可靠性取决于所纯化miRNA的质量。因此，可在qRT-PCR之前通过分光光度计测定260 nm与280 nm处吸光度比值来检测miRNA的纯度。当使用qRT-PCR无法获得显著的miRNA扩增时，可提高模板cDNA的浓度，也可提高各miRNA特异性引物的浓度。

检测miRNA表达水平的替代方法有多种，包括微阵列、Northern印迹和核糖核酸酶保护分析。与Northern印迹或核糖核酸酶保护分析相比，qRT-PCR是一种灵敏度高、通量高且所需样本量极少的方法。微阵列可同时检测大量miRNA的表达，其数据通常与qRT-PCR获得的结果具有较强的相关性17；然而，目前尚未就一种能够验证不同研究团队之间微阵列数据比较有效性的方法达成共识18。

本方案存在以下局限性。首先，该方案对miRNA检测的验证尚未在其他器官（如肝脏、肺脏和肾脏）中...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢重田美弥子提供的出色技术支持。本工作部分由日本学术振兴会科学研究费补助金（课题编号 25461252）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
QIA shredderQiagen79654微型离心柱中的生物聚合物破碎系统
miRNeasy Mini 试剂盒Qiagen217004基于二氧化硅膜的离心柱
QIAzol 裂解试剂Qiagen79306基于苯酚/胍的裂解试剂
Buffer RLTQiagen79216洗涤缓冲液 1
Buffer RWTQiagen1067933洗涤缓冲液 2
miScript II RT 试剂盒 Qiagen218161包含 10× 核酸混合物（含脱氧核苷酸、核糖核苷三磷酸和寡聚 dT 引物）；miScript 逆转录酶混合物（含多聚A聚合酶和逆转录酶）；miScript HiSpec 缓冲液
miScript SYBR Green PCR 试剂盒Qiagen218073包含 QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 和 miScript 通用引物
RNU6-2 引物  QiagenMS00033740未公开
miRNA-142-3p 引物QiagenMS000314515'-UGUAGUGUUUCC
UACUUUAUGGA-3'  
miRNA-21-5p 引物QiagenMS000090795'-UAGCUUAUCAG
ACUGAUGUUGA-3'
miRNA-221-3p 引物QiagenMS000038575'-AGCUACAUUGU
CUGCUGGGUUUC-3'
miRNA-223-3p 引物QiagenMS000333205'-UGUCAGUUUG
UCAAAUACCCC-3'
miRNA-34a-5p 引物QiagenMS000033185'-UGGCAGUGUCU
UAGCUGGUUGU-3'
miRNA-327 引物QiagenMS000008055'-CCUUGAGGGG
CAUGAGGGU-3'
用于 qRT-PCR 的 MicroAmp 光学 96 孔反应板Thermo Fisher Scientific431681396 孔反应板
MicroAmp 光学压敏膜 Thermo Fisher Scientific4311971用于 96 孔反应板的压敏膜
QuantStudio 12K Flex 实时 PCR 系统Thermo Fisher Scientific4472380实时 PCR 仪器
QuantStudio 12K Flex 软件版本 1.2.1Thermo Fisher Scientific4472380实时 PCR 仪器软件
甲基乙二醛Sigma-AldrichM0252
MidpericTerumo未分配 腹膜透析液
Sprague–Dawley 大鼠SLC未分配 

参考文献

  1. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
  2. Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
  3. Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
  4. Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
  5. Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
  6. Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
  7. Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
  8. Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
  9. Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005(2014).
  10. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  11. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  12. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  13. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  14. Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).
  15. Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
  16. Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
  17. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate? BMC Genomics. 6, 59(2005).
  18. Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary? Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

RNA纯化逆转录miRNA检测腹膜纤维化大鼠模型总RNA提取qRT-PCR实验方案
使用定量实时 PCR 检测大鼠腹膜中 microRNA 的表达
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。