通过共聚焦显微镜检测配体激活的G蛋白偶联受体的内化

摘要

本方案描述了在哺乳动物细胞中通过共聚焦显微镜检测G蛋白偶联受体（GPCR）内化的方法。内容包括基本的细胞培养、转染及共聚焦显微镜操作流程，提供了一种高效且易于解读的方法，用于检测融合表达的GPCR亚细胞定位及其内化过程。

摘要

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）是一种用于高对比度成像的光学成像技术。该技术可有效可视化荧光融合蛋白（如绿色荧光蛋白GFP），以确定其表达、定位及功能。目标蛋白的亚细胞定位对于蛋白的鉴定、表征及功能分析具有重要意义。内化是调控G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导的主要机制之一，可确保细胞对刺激产生适当的反应。本文介绍了一种利用共聚焦显微镜检测HEK293细胞中GPCR亚细胞定位及内化过程的实验方法。此外，本实验还提供了有关细胞培养与转染的一些细节。该方案适用于多种广泛使用的荧光标记物，可用于观察大多数蛋白的亚细胞定位以及GPCR的内化过程。该技术将有助于研究人员高效调控哺乳动物细胞系中GPCR基因的表达，并推动对GPCR亚细胞定位与内化过程的研究。

引言

细胞具有货物运输机制，可将胞外物质（如配体、微生物、营养物质和跨膜蛋白）转运至细胞内，以获取信息、能量及其他用途^1,2。这一过程对于细胞稳态、组织功能以及细胞整体存活至关重要。利用细胞表达荧光融合蛋白是研究跨膜受体（如G蛋白偶联受体，GPCR）在信号通路中的定位与内化过程的一种有力方法³。

利用来自维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）的绿色荧光蛋白（GFP）标记融合蛋白，并结合直接荧光检测技术，已在蛋白质靶向研究中得到广泛应用^4,5,6。基于GFP的检测方法具有可在活细胞中实时成像的优势，同时避免了固定所导致的人工假象⁷。目前已构建一系列多功能克隆载体，以促进在多种细胞中表达与GFP融合的蛋白质^8,9。pEGFP-N1载体是一种广泛应用且已商业化的质粒载体，编码经优化的增强型绿色荧光蛋白（EGFP），其相较于野生型GFP在哺乳动物细胞中具有更强的荧光信号和更高的表达水平。为观察在哺乳动物细胞中表达的EGFP荧光信号，应采用488 nm激发光和507 nm发射光进行荧光显微镜检测，优先使用共聚焦显微镜。

监测受体的亚细胞定位及其配体介导的内化是研究G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导与功能的常用技术^10,11。在大多数情况下，内化会导致GPCR脱敏（即尽管激动剂存在，刺激反应仍减弱）^12,13。内化的受体可被转运至溶酶体并降解，也可被循环回收至细胞膜表面，具体命运取决于受体的性质及实验中所用的细胞系。

促性腺激素释放激素受体（GnRHRs）属于G蛋白偶联受体（GPCR）家族，具有典型的GPCR蛋白结构，包括一个细胞外氨基末端、一个细胞内-COOH末端以及七个跨膜（TM）结构域¹⁴。先前已有报道，将重组质粒SjGnRHR-EGFP（包含来自Sepiella japonica的GnRHR基因）转染至细胞，并通过共聚焦显微镜检测在HEK293细胞中表达的EGFP标记的SjGnRHR，同时已确立GFP荧光作为跨膜蛋白定位实验的报告信号¹⁵。目前，通过共聚焦显微镜观察发现，由中国台湾S. japonica促性腺激素释放激素（SjGnRH）激活的SjGnRHR内化过程呈现出时间和剂量依赖性。

方案

1. 细胞制备

1. 细胞复苏
   1. 将冻存的人胚胎肾293（HEK293）细胞从液氮罐中取出，迅速放入37 °C水浴中，持续振荡1 - 2分钟。
   2. 向一个10 cm细胞培养皿中加入10 mL预平衡的生长培养基（DMEM培养基，含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液），轻柔地将解冻后的细胞加入该培养基中。
   3. 将细胞置于37 °C、水套式CO₂培养箱中孵育，环境为含95%空气和5% CO₂的湿润气氛，孵育时间为2 - 4小时。
   4. 2 - 4小时后，检查细胞是否已贴壁。更换预平衡的生长培养基，并继续培养24 - 48小时。
      注意：更换培养基有助于去除二甲基亚砜（DMSO），从而保护细胞免受损伤。
2. 细胞传代
   1. 培养24 - 48小时后，当细胞生长接近融合状态时，弃去原有培养基，用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，轻轻晃动培养皿。
   2. 弃去PBS，加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液（生理盐水配制，含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA）。为充分消化细胞，轻轻晃动培养皿后吸除胰蛋白酶-EDTA溶液，将培养皿放入37 °C水套式CO₂培养箱中孵育3分钟。
      注意：在此期间，准备三个新的10 cm细胞培养皿，每个皿中加入10 mL预平衡的生长培养基。
   3. 在光学显微镜下观察细胞是否已从皿底脱落。向培养皿中加入2 mL预平衡的生长培养基，用移液器吹打混匀，立即吸取0.6 mL细胞悬液分别接种至三个新培养皿中。再次轻柔吹打混匀，将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下继续孵育。

2. 细胞接种

1. 24 - 48 小时后，当传代细胞生长至接近汇合时，弃去预温的生长培养基，并用 2 mL PBS 洗涤细胞。轻轻晃动培养皿。
2. 弃去 PBS，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。为完全消化细胞，小心晃动培养皿，吸除胰蛋白酶-EDTA 溶液，然后将培养皿放入 37 °C、带水套的 CO₂ 培养箱中孵育 3 分钟。
   注意：在此期间，向 6 孔板的每个孔中加入 2 mL 预温的生长培养基，以完成准备工作。
3. 在显微镜下观察，若发现细胞已从培养皿底部脱落，向培养皿中加入 1 mL 预温的生长培养基。用移液器吹打混匀，立即吸取 0.1 mL 细胞悬液（根据细胞生长密度调整体积）加入已准备好的 6 孔板的每孔中（即含 2 mL 预温生长培养基的无细胞 6 孔板）。轻轻吹打混匀，将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。

3. 细胞转染

1. 转染方法1：使用脂质体试剂
   注意：请参见材料表中的转染试剂1。
   1. 次日，确保细胞融合度达到85 - 95%。
   2. 取3 µg质粒DNA（500 ng/µL）和100 µL低血清培养基加入无菌微量离心管中，轻轻混匀。室温孵育5分钟。
   3. 在另一无菌微量离心管中加入9 µL试剂1和100 µL低血清培养基，轻轻混匀。室温孵育5分钟。
   4. 将稀释后的质粒混合物与稀释后的试剂1混合（总体积 = 215 µL）。轻轻混匀，室温孵育20分钟。
   5. 吸除细胞培养板中的培养基，每孔加入1.5 mL不含FBS的新鲜DMEM培养基。
   6. 将215 µL DNA-转染试剂混合物逐滴加入每孔中，并通过轻轻摇晃培养板混匀。
   7. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育4 - 8小时，然后更换为含10% FBS的新鲜DMEM培养基。
   8. 在进行任何实验前，继续在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞24 - 48小时。
2. 转染方法2：使用脂质体试剂
   注意：请参见材料表中的转染试剂2。
   1. 在无菌微量离心管中加入2 µg质粒DNA（500 ng/µL）、4 µL试剂2和100 µL低血清培养基。轻轻混匀，室温孵育15分钟。
   2. 将转染混合物逐滴加入细胞中。
   3. 转染后，在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞24 - 48小时，再进行后续实验。

4. 载玻片上的细胞培养

1. 从培养用6孔板中移除生长培养基。
2. 用1 mL不含钙和镁的PBS洗涤细胞单层。
3. 加入0.5 mL胰蛋白酶-EDTA。轻轻晃动培养皿后吸除胰蛋白酶-EDTA。将培养板在37 °C和5% CO₂条件下孵育3分钟。实际孵育时间因所用细胞系而异。 
   注意：在此期间，准备一个新的12孔板，并在每个孔中放入直径为15 mm的无菌盖玻片。对于容易脱落的HEK293细胞，使用经赖氨酸、层粘连蛋白或胶原蛋白包被的盖玻片可改善细胞贴附。
4. 当细胞脱落后，向每孔加入1 mL预热的完全生长培养基。通过移液混匀后，立即转移 所需数量的细胞至含盖玻片的12孔板中。向每个 孔中添加新鲜的完全生长培养基，调整总体积至1 mL。
5. 将细胞在37 °C和5% CO₂条件下孵育16–24小时。
   注意：30–60分钟后，大部分细胞将已贴附于无菌盖玻片上。

5. 共聚焦显微镜检测

1. 细胞定位
   1. 培养16 - 24小时后，当细胞在12孔板中的无菌盖玻片上生长至接近汇合时，向每孔加入膜探针DiI，使其终浓度为5 µM。在37 °C、5% CO₂条件下孵育30分钟。
   2. 30分钟后，移除预温的培养基，并用冷PBS（2 - 8 °C）洗涤细胞两次。
   3. 向每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液（溶于PBS中）固定细胞，轻轻振荡15分钟。
      注意：多聚甲醛经皮肤接触或吸入具有中等毒性，被列为可能的人类致癌物。称量和操作多聚甲醛时应使用化学通风橱、带通风的天平罩或其他防护措施。
   4. 用PBS洗涤固定后的细胞两次。向每孔加入200–300 µL DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液（0.5 µg/mL），室温孵育10分钟。
   5. 用PBS洗涤细胞两次。小心从孔板中取出盖玻片，吸去多余的PBS。将其倒置在已滴加一滴封片剂（50% v/v甘油/水）的载玻片上。去除载玻片上多余的封片剂。
2. 细胞内化
   1. 培养16 - 24小时后，当细胞在12孔板中的无菌盖玻片上生长至接近汇合时，移除预温的培养基，并加入新鲜预温的DMEM培养基（37 °C）。在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。
   2. 用不同浓度（0、10^-12、10^-9 和 10^-6 M）的配体处理细胞30分钟，并用10^-6 M配体处理不同时间（0、10、30 和 60分钟）。
   3. 用冷PBS（2 - 8 °C）洗涤细胞两次。向每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液（溶于PBS中）固定细胞，轻轻振荡15分钟。
   4. 用PBS洗涤细胞两次。小心从孔板中取出盖玻片，吸去多余的PBS。将其倒置在已滴加一滴封片剂（50% v/v甘油/水）的载玻片上。去除载玻片上多余的封片剂。
3. 共聚焦显微镜观察
   1. 开启共聚焦显微镜的硬件设备，包括汞灯电源、计算机、扫描仪和激光器。登录操作系统账户，启动软件，检查配置并选择激光器。按照说明书顺序依次开启共聚焦显微系统的各个单元。
   2. 将制备好的载玻片放置于显微镜载物台上。使用载物台控制器将样品移至物镜下方。当使用油镜时，在盖玻片上滴加一滴杉木油。放置盖玻片时应使其面向物镜。
   3. 在荧光显微镜下找到目标细胞。
   4. 切换至扫描模式。选择激光功率及发射荧光染料的光谱范围。通过调节激光强度及其他参数，获取高质量的共聚焦图像。

结果

图1 展示了共聚焦显微镜系统的一个示例。 图2 展示pEGFP-N1在HEK293细胞中的表达。GFP信号在细胞质和细胞核中均被检测到。 图3 显示促性腺激素释放激素受体（GnRHR）的亚细胞定位 S. japonica 在HEK293细胞中，与我们先前发表的结果一致¹⁵C末端带有EGFP标签的融合蛋白 SjGnRHR（促性腺激素释放激素受体）SjGnRHR-EGFP）在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）下呈绿色。经DAPI染色的细胞核呈蓝色。DiI染色使细胞膜呈现红色。合并图像中细胞表面的黄色信号表明红色与绿色信号重叠，证明GnRHR-EGFP定位于细胞质膜 SjGnRHR

图4 和 ...

讨论

本文介绍的实验方案提供了一种高效且易于解读的方法，用于检测在HEK293细胞中表达的G蛋白偶联受体融合蛋白的亚细胞定位和内化情况。该技术可轻松适用于多种不同的基因和细胞类型，例如可用于研究家蚕（Bombyx mori）冠心素受体在HEK293细胞和BmN细胞中的细胞定位与内化过程¹⁶。

该强大检测方法的成功应用依赖于几个关键因素。首要的是细胞的良好状态，这对于实现高效的转染和保证数据质量至关重要。转染孵育时间、转染与其他实验之间的间隔，以及在成像前将转染后的细胞传代至盖玻片上等步骤，均可能对培养的细胞造成损伤。因此，维持细胞的良好状态是本实验所有步骤的重要前提。此外，为获得高质量的共聚焦显微镜图像，必须避免细胞密度过高导致的细胞过度挤压。为了尽量减少荧光标签对G蛋白偶联受体（GPCR）定位的影响，我们构建了将EGFP融合至受体胞内C末端的表达载体。将目标基因成功且高效地转染入细胞同样至关重要。不同细胞系之间的转染效率可能存在显著差异。因此，可能需要根据所使用的特定细胞类型对实验方案中的某些步骤进行优化。例如，在转染方...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEK293细胞系
DMEM/高糖	Hyclone	SH30022.01	高糖，4.0 mM L-谷氨酰胺
胎牛血清（FBS）	PuFei	1101-100
磷酸盐缓冲液（PBS）	Genom	GNM10010
青霉素-链霉素	Genom	GNM15140
0.25% 胰蛋白酶 & 0.02% EDTA	Genom	GNM25200
Opti-MEM (1x)	GIBCO, by Life Technologies	31985-062	低血清培养基
Lipofectamine 2000 转染试剂	Invitrogen	11668027	试剂1
X-tremeGENE HP DNA 转染试剂	Roche	6366236001	试剂2
DAPI染色液	Beyotime	C1006
DiI	Beyotime	C1036
抗荧光淬灭封片剂	Beyotime	P0126
多聚甲醛	国药集团化学试剂有限公司（SCRC）	80096618
100 mm细胞培养皿	CORNING	430167
6孔板	ExCell Bio	CS016-0092
12孔板	ExCell Bio	CS016-0093
盖玻片	NEST	801007
显微镜载玻片	Citoglas	10127105P-G
Thermo Scientific Forma CO2 培养箱	Thermo	3111
TCS SP5II 激光扫描共聚焦显微镜	Leica	5100001311