本方案描述了在哺乳动物细胞中通过共聚焦显微镜检测G蛋白偶联受体（GPCR）内化的方法。内容包括基本的细胞培养、转染及共聚焦显微镜操作流程，提供了一种高效且易于解读的方法，用于检测融合表达的GPCR亚细胞定位及其内化过程。
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本文内容
摘要
摘要
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）是一种用于高对比度成像的光学成像技术。该技术可有效可视化荧光融合蛋白（如绿色荧光蛋白GFP），以确定其表达、定位及功能。目标蛋白的亚细胞定位对于蛋白的鉴定、表征及功能分析具有重要意义。内化是调控G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导的主要机制之一，可确保细胞对刺激产生适当的反应。本文介绍了一种利用共聚焦显微镜检测HEK293细胞中GPCR亚细胞定位及内化过程的实验方法。此外，本实验还提供了有关细胞培养与转染的一些细节。该方案适用于多种广泛使用的荧光标记物，可用于观察大多数蛋白的亚细胞定位以及GPCR的内化过程。该技术将有助于研究人员高效调控哺乳动物细胞系中GPCR基因的表达，并推动对GPCR亚细胞定位与内化过程的研究。
引言
细胞具有货物运输机制，可将胞外物质（如配体、微生物、营养物质和跨膜蛋白）转运至细胞内，以获取信息、能量及其他用途1,2。这一过程对于细胞稳态、组织功能以及细胞整体存活至关重要。利用细胞表达荧光融合蛋白是研究跨膜受体（如G蛋白偶联受体，GPCR）在信号通路中的定位与内化过程的一种有力方法3。
利用来自维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）的绿色荧光蛋白（GFP）标记融合蛋白，并结合直接荧光检测技术，已在蛋白质靶向研究中得到广泛应用4,5,6。基于GFP的检测方法具有可在活细胞中实时成像的优势，同时避免了固定所导致的人工假象7。目前已构建一系列多功能克隆载体，以促进在多种细胞中表达与GFP融合的蛋白质8,9。pEGFP-N1载体是一种广泛应用且已商业化的质粒载体，编码经优化的增强型绿色荧光蛋白（EGFP），其相较于野生型GFP在哺乳....
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方案
1. 细胞制备
- 细胞复苏
- 将冻存的人胚胎肾293（HEK293）细胞从液氮罐中取出，迅速放入37 °C水浴中，持续振荡1 - 2分钟。
- 向一个10 cm细胞培养皿中加入10 mL预平衡的生长培养基（DMEM培养基，含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液），轻柔地将解冻后的细胞加入该培养基中。
- 将细胞置于37 °C、水套式CO2培养箱中孵育，环境为含95%空气和5% CO2的湿润气氛，孵育时间为2 - 4小时。
- 2 - 4小时后，检查细胞是否已贴壁。更换预平衡的生长培养基，并继续培养24 - 48小时。
注意：更换培养基有助于去除二甲基亚砜（DMSO），从而保护细胞免受损伤。
- 细胞传代
- 培养24 - 48小时后，当细胞生长接近融合状态时，弃去原有培养基，用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，轻轻晃动培养皿。
- 弃去PBS，加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液（生理盐水配制，含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA）。为充分消化细胞，轻轻晃动培养皿后吸除胰蛋白酶-EDTA溶液，将培养皿放入37 °C水套式CO2培养箱中孵育3分钟。
注意：在此期间，准备三个新的10....
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结果
图1 展示了共聚焦显微镜系统的一个示例。 图2 展示pEGFP-N1在HEK293细胞中的表达。GFP信号在细胞质和细胞核中均被检测到。 图3 显示促性腺激素释放激素受体（GnRHR）的亚细胞定位 S. japonica 在HEK293细胞中，与我们先前发表的结果一致15C末端带有EGFP标签的融合蛋白 SjGnRHR（促性腺激素释放激素受体）SjGnRHR-EGFP）在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）下呈绿色。经DAPI染色的细胞核呈蓝色。DiI染色使细胞膜呈现红色。合并图像中细胞表面的黄色信号表明红色与绿色信号重叠，证明GnRHR-EGFP定位于细胞质膜 SjGnRHR
图4 和 .......
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讨论
本文介绍的实验方案提供了一种高效且易于解读的方法，用于检测在HEK293细胞中表达的G蛋白偶联受体融合蛋白的亚细胞定位和内化情况。该技术可轻松适用于多种不同的基因和细胞类型，例如可用于研究家蚕（Bombyx mori）冠心素受体在HEK293细胞和BmN细胞中的细胞定位与内化过程16。
该强大检测方法的成功应用依赖于几个关键因素。首要的是细胞的良好状态，这对于实现高效的转染和保证数据质量至关重要。转染孵育时间、转染与其他实验之间的间隔，以及在成像前将转染后的细胞传代至盖玻片上等步骤，均可能对培养的细胞造成损伤。因此，维持细胞的良好状态是本实验所有步骤的重要前提。此外，为获得高质量的共聚焦显微镜图像，必须避免细胞密度过高导致的细胞过度挤压。为了尽量减少荧光标签对G蛋白偶联受体（GPCR）定位的影响，我们构建了将EGFP融合至受体胞内C末端的表达载体。将目标基因成功且高效地转染入细胞同样至关重要。不同细胞系之间的转染效率可能存在显著差异。因此，可能需要根据所使用的特定细胞类型对实验方案中的某些步骤进行优化。例如，在转染方.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本文作者感谢谢佳燕教授在技术协助和设备使用方面提供的支持。本研究由国家自然科学基金（41406137）提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HEK293细胞系 | |||
| DMEM/高糖 | Hyclone | SH30022.01 | 高糖，4.0 mM L-谷氨酰胺 |
| 胎牛血清（FBS） | PuFei | 1101-100 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Genom | GNM10010 | |
| 青霉素-链霉素 | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% 胰蛋白酶 & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | 低血清培养基 |
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Invitrogen | 11668027 | 试剂1 |
| X-tremeGENE HP DNA 转染试剂 | Roche | 6366236001 | 试剂2 |
| DAPI染色液 | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Beyotime | P0126 | |
| 多聚甲醛 | 国药集团化学试剂有限公司（SCRC） | 80096618 | |
| 100 mm细胞培养皿 | CORNING | 430167 | |
| 6孔板 | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12孔板 | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| 盖玻片 | NEST | 801007 | |
| 显微镜载玻片 | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 培养箱 | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II 激光扫描共聚焦显微镜 | Leica | 5100001311 |
参考文献
- Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L.
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