通过高通量抑制剂筛选鉴定调控胚胎干细胞多能性的激酶的简易方法

摘要

本文介绍了一种定量且可扩展的方案，用于对调控 naive-primed 多能性转换的激酶相关小分子进行靶向筛选。

摘要

胚胎干细胞（ESCs）能够自我更新或分化为所有类型的细胞，这种现象被称为多能性。目前已描述了不同的多能性状态，分别称为"初始态"和"始发态"多能性。关于调控初始态与始发态转换的机制，目前仍知之甚少。特别是对于决定初始态和始发态多能性状态的蛋白激酶，尽管目前已有越来越多高质量的工具化合物可用于探究激酶功能，但相关知识依然匮乏。本文中，我们介绍一种可扩展的平台，用于在小鼠胚胎干细胞中针对调控初始态-始发态多能性转换的激酶进行靶向小分子筛选。该方法利用简单的细胞培养条件以及常规的试剂、材料和设备，发现并验证对多能性具有此前未被认识作用的激酶抑制剂。我们还讨论了该技术的潜在应用，包括筛选其他小分子文库，例如日益复杂的激酶抑制剂以及新兴的表观遗传学工具化合物文库。

引言

胚胎干细胞（ESCs）具有自我更新或分化为成体中任何细胞类型的潜能，这种特性被称为多能性¹。最近的研究表明，存在发育阶段不同的多能性状态，分别称为"初始态"和"始发态"多能性²。初始态胚胎干细胞所处的发育状态类似于着床前胚胎中的细胞状态³。相比之下，始发态多能性胚胎干细胞已准备退出多能状态，并进一步分化为特定的胚胎谱系^4,5。

幼稚态和始发态多能性由不同的基因调控网络标记。幼稚态多能性特征在于关键多能性转录因子的表达，如 Nanog、Krueppel样转录因子（Klfs）、Rex1² 和 Esrrb⁶在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中， primed 多能性表现为 naïve 多能性标志物的表达降低，并具有特定的基因表达特征，其中包括从头DNA甲基转移酶 Dnmt3b 的表达⁷. 在体，已启动的多能性植入后上胚层干细胞（EpiSCs）^4,5 此外表达上胚层标志物 Fgf5 以及谱系启动标志物如 Brachyury⁸.

mESCs 为研究调控 naive-primed 多能性转换的机制提供了可操作的模型 体外在白血病抑制因子（LIF）和胎牛血清（FBS）培养条件下，小鼠胚胎干细胞（mESCs）在 naive 和 primed 多能性状态之间发生动态转换^9,10LIF-Jak-Stat3 信号通路的功能是促进一种初始态基因调控网络¹¹，而通过成纤维细胞生长因子4（Fgf4）Erk1/2通路的自分泌信号则驱动向始发态的转变¹²然而，系统地评估蛋白激酶在决定不同多能性状态中的作用仍是一个挑战。

本文介绍了一种定量且可扩展的平台，可用于对调控多能性从初始态向始发态转变的激酶相关小分子进行靶向筛选。我们采用简单的小鼠胚胎干细胞（mESC）培养条件，结合常规试剂、材料和设备，发现并验证了若干激酶抑制剂具有此前未被充分认识的维持初始态多能性的能力。此外，我们还探讨了该技术潜在的拓展应用，包括用于筛选其他小分子化合物库，例如新兴的靶向表观遗传调控因子的抑制剂文库。

方案

1. 小分子激酶抑制剂文库的收集

1. 从公开可获取的激酶抑制剂文库中整理抑制剂集合， 例如 哈佛医学院的集成网络细胞特征库（Library of Integrated Network-based Cellular Signatures，LINCS），包含228种高效且具有选择性的激酶抑制剂（http://lincs.hms.harvard.edu）；以及由工业界研究人员构建的蛋白质激酶抑制剂集合（Protein Kinase Inhibitor Set，PKIS），包含376种化合物（https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS）¹³或者，可从市售化合物中自行组建定制的激酶抑制剂库。
   注意：在我们的实验室中，已收集了72种强效且高选择性的工具激酶抑制剂，涵盖51种主要靶点激酶，所有这些抑制剂均可从商业渠道获得。
2. 将激酶抑制剂配制到96孔板中，用于在多种浓度（使用1、0.1和0.01 mM）下进行高效的高通量处理。每块板中均设置仅含DMSO的对照孔，以及已知可分别促进原始态和始发态多能性的参考对照抑制剂PD173074（FGFRi）和Ruxolitinib（JAKi）。在电子表格或类似软件中进行标注。

2. 筛选准备用小鼠胚胎干细胞培养条件与操作步骤

1. 通过向10 cm培养皿中加入5 mL 0.1%（w/v）明胶溶液，室温孵育5分钟，制备0.1%明胶包被的10 cm培养皿。吸除明胶溶液，让培养皿干燥2分钟。
2. 将任何标准的小鼠胚胎干细胞（mESC）系在含100 ng/mL GST-LIF、10%胎牛血清和5% Knockout血清替代物的标准mESC培养基（见材料表）中，于37 °C、5% CO₂条件下，在0.1%明胶包被的10 cm培养皿中培养。每天更换培养基，并每两天在约80%融合度时以1:5至1:10的比例传代mESC。
3. 传代mESC时，吸除培养基，并用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每块培养皿。
4. 每块mESC培养皿中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液（0.05%胰蛋白酶，0.02% EDTA），于37 °C孵育10分钟。
5. 用4 mL mESC培养基重悬消化后的细胞，于1,200 rpm离心5分钟。
6. 用5 mL mESC培养基充分重悬细胞沉淀，反复吹打以获得单细胞悬液。
7. 取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝（0.4%）混合进行细胞计数。将混合液加入细胞计数板或使用血细胞计数板配合光学显微镜进行计数。
8. 使用多通道移液器将3 × 10³个mESC接种至0.1%明胶包被的96孔板中，每孔终体积为100 µL培养基。
9. 使用多通道移液器以1:100稀释比例加入激酶抑制剂（每100 µL培养基中加入1 µL抑制剂）。轻轻吹打培养基以混匀抑制剂与细胞悬液，然后将细胞置于生物安全柜中静置1小时，确保细胞在培养表面均匀分布。在不更换培养基的情况下继续培养48小时。
   注意：1 mM、0.1 mM和0.01 mM的储存液分别对应最终抑制剂浓度为10 µM、1 µM和0.1 µM。我们建议筛选实验从1 µM的终浓度开始，以确保有效抑制主要靶点激酶的同时，尽量减少脱靶效应。

3. 激酶抑制剂筛选分析

1. 使用多通道移液器和吸液器，以 200 µL PBS 清洗 96 孔 mESC 培养板。
2. 在 150 µL 裂解缓冲液（20 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1% NP-40 (v/v)，0.5% 脱氧胆酸钠 (w/v)，10 mM β-甘油磷酸钠，10 mM 焦磷酸钠，1 mM NaF，2 mM Na₃VO₄，完全蛋白酶抑制剂混合片剂）中制备细胞裂解物。
3. 将裂解物在 V 型底 96 孔板中以 1,500 × g 离心 30 分钟，以澄清提取物。
4. 使用 96 孔真空点印迹装置，将 100 µL 上清液固定到硝酸纤维素膜上。
5. 干燥膜后，用 40 mL Ponceau S 染色，以确认转移的一致性。
6. 用 TBST 洗涤膜，并在含 3% (w/v) 脱脂奶粉的 TBST 中封闭。
7. 在含 3% (w/v) 脱脂奶粉的 TBST 中，以 1:1,000 (v/v) 稀释度加入 Nanog 和 Dnmt3b 抗体，4°C 孵育过夜。
8. 在 TBST 中洗涤 3 次，每次 10 分钟，然后在 30 mL 含 3% (w/v) 脱脂奶粉的 TBST 中，以 1:10,000 (v/v) 稀释度加入二抗孵育。
9. 使用数字免疫印迹成像系统显影。
   注意：如有可能，建议采用定量荧光免疫印迹检测 Nanog 和 Dnmt3b。然而，Dnmt3b 的荧光免疫印迹背景信号过高，因此 Nanog 使用 800 nm 荧光抗兔二抗，Dnmt3b 使用抗小鼠 HRP 二抗。

4. 筛选数据的分析及对抑制剂作为真正多能性调控因子的验证

注意：这是确保仅鉴定出真正多能性调节剂的关键步骤。必须根据 Nanog:Dnmt3b 比值和总体信号对抑制剂进行初步筛选，以确保不会选择对小鼠胚胎干细胞存活产生不利影响的激酶抑制剂进入后续分析。

1. 使用免疫印迹分析软件对 Nanog 和 Dnmt3b 信号进行定量，并将数值导入电子表格或类似软件中。计算所有样品相对于 DMSO 对照组的 Nanog:Dnmt3b 比值。同时测定 Nanog 和 Dnmt3b 的总信号强度，以确保激酶抑制剂不会通过影响 mESC 存活率而改变 Nanog:Dnmt3b 比值。
2. 根据 Nanog:Dnmt3b 比值的排序结果，鉴定可促进原始态多能性（Nanog:Dnmt3b 比值高于对照组）和始发态多能性（Nanog:Dnmt3b 比值低于对照组）的抑制剂。设定阈值为对照组数值的 2 倍偏差，并排除那些导致 Nanog+Dnmt3b 总信号低于 DMSO 对照组 50% 的激酶抑制剂，从而获得高可信度的激酶抑制剂列表，这些抑制剂可分别稳定原始态（高 Nanog:Dnmt3b 比值）和始发态（低 Nanog:Dnmt3b 比值）多能性状态。
3. 通过将 mESCs 以每 6 孔 2 × 10⁵ 个细胞接种于 2 mL 培养基中，并在不更换培养基的情况下加入 1 µM 浓度的激酶抑制剂处理 48 小时，对候选抑制剂进行验证。
4. 使用裂解缓冲液裂解 mESCs，并通过常规 SDS-PAGE 免疫印迹分析 Nanog 和 Dnmt3b 的表达水平。
5. 进一步通过 SDS-PAGE 免疫印迹检测原始态多能性标志物 Klf2 和 Klf4 以及 Oct4 的表达，以确认在 48 小时抑制剂处理后多能性状态得以维持。

结果

利用本文所述方法（图1），我们对包含228种高效且特异性激酶抑制剂的LINCS文库进行筛选，以鉴定能够调控小鼠胚胎干细胞（mESC）多能性的化合物。该文库以0.1 mM浓度制备，经1:100稀释后，在mESC中的最终筛选浓度为1 µM。48小时后，裂解mESC并制备提取物，用于Nanog和Dnmt3b表达水平的定量点印迹分析（图2，顶部）。为简洁起见，此处未展示其他筛选浓度的结果。针对每种激酶抑制剂计算Nanog与Dnmt3b的比值，并据此对化合物进行排序，同时设定2倍截断值（图2，底部）。将各抑制剂处理组中总Nanog和Dnmt3b信号相对于对照组的水平叠加至排序结果中，并应用0.5倍截断值，以排除对mESC具有显著毒性的抑制剂。选择可稳定原始态（naïve state）的激酶抑制剂，通过传统的Nanog/Dnmt3b免疫印迹法进行验证（图3）。这些抑制剂的主要激酶靶点列于表1。我们还展示了该筛选方法在鉴定可稳定始发态（primed state）抑制剂方面的适用性¹⁴。

图 1：筛选调控初始态-始发态转换的激酶抑制剂的工作流程。 将 mESC 用包含 228 种化合物的激酶抑制剂文库处理，终浓度为 1 µM。制备裂解液并转移至硝酸纤维素膜进行免疫点印迹分析，检测 Nanog 和 Dnmt3b 的表达水平（图改编自 Williams et al.¹⁴）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：初始态-始发态多能性筛选分析及抑制剂鉴定。（上图）代表性 Nanog 和 Dnmt3b 免疫点印迹图像。（下图）各激酶抑制剂的 Nanog 和 Dnmt3b 值均相对于 DMSO 对照组进行测定，并计算 Nanog:Dnmt3b 比值及总的相对 Nanog+Dnmt3b 信号强度，据此对抑制剂进行排序并与 DMSO 对照组比较。筛选出使 Nanog:Dnmt3b 比值较 DMSO 对照组升高或降低超过 2 倍阈值的抑制剂，作为驱动初始态或多能性始发态的候选因子。设定低于 DMSO 对照组 2 倍的阈值，以排除影响小鼠胚胎干细胞（mESC）存活的抑制剂。用于进一步验证的抑制剂已高亮标出。（图改编自 Williams et al.¹⁴）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：已鉴定出的候选化合物的验证。 对小鼠胚胎干细胞（mESCs）分别使用 1 µM AZD4547（一种选择性 FGFR 抑制剂）或图 2 筛选中鉴定出的指定抑制剂进行处理。通过标准 SDS-PAGE 和免疫印迹分析测定 Nanog:Dnmt3b 水平。相对 Nanog:Dnmt3b 和 Nanog+Dnmt3b 的数值列于下方表格中，其中可稳定原始多能状态的抑制剂以绿色标出。请点击此处查看该图的放大版本。

化合物	主要靶点		其他靶点
AV-951	VEGFR
HG-6-64-01	ABL、BRAF、RET、CSF1R、EGFR、EPHA8、FGFR、FLT3、KIT、LOK、MAP4K1、p38b、MUSK、PDGFR、TAOK3、TNNI3K
WH-4-023	Lck		Src
R406	Syk
GW-572016	HER2		EGFR
KIN001-244	PDK1
WZ-4-145	CSF1R、DDR1、EGFR、TIE1、PDGFR2
WZ-7043	CSF1R、DDR1、FGFR 和 TAO1
GW786034	VEGFR1		VEGFR2，VEGFR3
AZD-1480	JAK2

表1：筛选出的命中化合物及其主要激酶靶点。

讨论

本文展示了一种广泛适用的方法，用于探究激酶信号通路在调控多能性从初始态向始发态转变过程中的作用，这解决了胚胎干细胞领域中的一个关键科学问题。尽管高通量基因组学和转录组学方法已被常规用于鉴定初始态和始发态多能性状态的关键转录调控因子，但解析多能性的信号网络仍具挑战性。我们现提出一种灵活的策略，利用化学抑制剂来鉴定调控小鼠胚胎干细胞（mESCs）中初始态-始发态多能性转变的激酶。该方法依赖于大多数研究细胞信号转导和胚胎干细胞生物学的实验室均具备的常规设备、试剂和材料。该技术平台成功的关键在于我们建立了一种可靠的定量检测方法，用于评估初始态与始发态多能性之间的转变。该检测方法的建立经历了对细胞接种密度、抑制剂孵育时间以及免疫印迹条件的多次反复优化。

小分子方法在治疗性胚胎干细胞（ESC）应用中的合理使用正受到越来越多的关注^15,16。小分子筛选的一个主要优势在于，工具化合物被设计和/或修饰以实现高效的细胞摄取，因此转染效率不再成为限制因素，也无需使用慢病毒等具有潜在危害的递送系统。此外，抑制剂通常可同时抑制激酶家族中的多个同工型（例如 Fgfr1-4、Jak1-3），从而克服了RNA干扰和CRISPR/Cas9等遗传学或基因组干扰技术因功能冗余而面临的局限性。随着来自学术界和制药行业药物发现项目中越来越多高效且具有选择性的工具化合物的出现，那些研究较少、功能尚不明确的激酶将被推向ESC研究的前沿。因此，我们提出，这种高通量筛选方法将为探索核心ESC调控网络开辟新的研究途径。

该技术的一个微小局限在于，即使是最有效且最具选择性的小分子抑制剂，在体内也会结合并抑制多个不相关的激酶。in vivo。然而，随着激酶抑制剂谱型数据日益全面，激酶抑制剂的功能性靶点能够被快速识别（http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan；http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase-inhibitors）。最后，原则上，我们的平台可应用于任何具备高质量免疫印迹抗体的小分子化合物库和/或细胞检测体系。这将有助于研究多条参与多能性调控的调节通路，并促进发现可调控多种细胞过程的小分子抑制剂。具体而言，我们预计应用新兴的小分子化合物库，例如结构基因组联盟（Structural Genomics Consortium）正在开发的表观遗传探针（http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics），有望揭示更多调控多能性转变的新型调控因子。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
mESC 培养基
CCE mESC	ATCC	ATCC SCRC-1023
DMEM 培养基	Gibco	11965092
L-谷氨酰胺	Gibco	25030081	终浓度：2 mM
青霉素/链霉素	Gibco	15140122	终浓度：50 U/mL
2-巯基乙醇	Sigma	M6250	终浓度：0.1 mM
白血病抑制因子（GST 融合蛋白）	MRC-PPU 试剂与服务		终浓度：100 ng/mL
白血病抑制因子	Thermo	PMC9484	终浓度：100 ng/mL
非必需氨基酸	Gibco	11140050	终浓度：0.1 mM
丙酮酸钠	Gibco	11360070	终浓度：1 mM
KnockOut 血清替代物	Invitrogen	10828-028	终浓度：5%
限定型胎牛血清	Fisher	10703464	终浓度：10%
名称	公司	货号	备注
组织培养材料
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红	Thermo	25300054
猪皮明胶	Sigma	1890
Nunc MicroWell 96 孔微孔板	Thermo	156545
不含钙、镁的 DPBS	Gibco	14190136
V 型底 96 孔板	Greiner Bio-one	651261
名称	公司	货号	备注
裂解缓冲液
Tris 缓冲液	VWR	103157P
氯化钠	VWR	97061
EDTA	Sigma	E4884
1% NP-40	Sigma	9016-45-9
脱氧胆酸钠	Sigma	D6750-100g
β-甘油磷酸钠	Sigma	G9422
焦磷酸钠	Sigma	13472-36-1
氟化钠	Sigma	450022
正钒酸钠	Sigma	450243
Roche 完全蛋白酶抑制剂混合片剂	Sigma	CO-RO
名称	公司	货号	备注
化学试剂
Tween	Sigma	P1379-1L
脱脂奶粉	Marvel
名称	公司	货号	备注
蛋白质印迹
Protran BA 85 硝酸纤维素膜，0.45 &micor;M  孔径（20 cm × 20 cm 片，25 片装）	GE	10401191
丽春红 S	Sigma	P7170-1L
名称	公司	货号	备注
实验设备
Minifold I 系统	GE	10447850
ChemiDoc 成像仪	BioRad	1708280
LiCor Odyssey 成像仪	LiCor
名称	公司	货号	备注
抗体
抗小鼠 Nanog 抗体	Reprocell	RCAB001P
抗 Dnmt3b 抗体	Imgenex	IMG-184A
IRDye 800CW 驴抗兔二抗	Licor	926-32213
抗小鼠 HRP 二抗	Cell Signalling Technology	7076S
抗 Klf2 抗体	Millipore	09-820
抗 Klf4 抗体	R&D Systems	AF3158
抗 Oct4 抗体	Santa Cruz	sc-5279