方法文章

协议的可视化类固醇机关及其互动器官在果蝇免疫染色果蝇

DOI：

10.3791/55519

⸱

2017年4月14日

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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我们描述了解剖，固定，并在果蝇幼虫和成年女性类固醇合成器官，研究类固醇激素的生物合成及其调控机制的免疫染色的协议。除了类固醇合成器官，我们可以形象地类固醇合成器官的神经支配和类固醇合成的靶细胞，如生殖系干细胞。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在多细胞生物体中，一小群细胞被赋予了在其生物活性的专门功能，诱导生长繁殖全身反应。在昆虫幼虫前胸腺（PG）和生物合成的主要类固醇激素称为蜕皮类的成年女性卵巢发挥重要作用。这些ecdysteroidogenic器官来自神经系统，通过它合成的时间是由环境因素影响的支配。在这里，我们描述了可视化ecdysteroidogenic机关和幼虫它们之间的互动器官和果实蝇成虫果蝇 ，这为研究类固醇激素的生物合成及其调控机制的合适模型系统的协议。熟练的解剖，我们保持着ecdysteroidogenic器官的位置和它们互动的器官，包括大脑，腹神经索和其他组织。用免疫染色针对ecdysteroidogenic酶ntibodies，通过组织特异性启动子的转基因驱动的荧光蛋白质一起，是可用来标记ecdysteroidogenic细胞。此外，ecdysteroidogenic器官的支配，也可以通过特异性抗体或多种类型的神经元GAL4驱动程序的集合标记。因此，ecdysteroidogenic机关及其神经元连接可以同时通过免疫组化和转基因技术，可视化。最后，我们将介绍如何可视生殖干细胞，其增殖和维护由蜕皮类控制。这种方法有助于类固醇激素的合成及其神经调节机制的全面了解。

引言

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在多细胞生物，一组单元被赋予了在其生物活性的特殊功能是整个人体不可缺少的。为了履行自己的使命，每一个组织或器官表达了一系列有关其功能的基因，并与其他组织进行通信，以协调在发展的背景下开展活动。为了描述这种专门的细胞功能和脏器间的相互作用，我们需要与其他类型的细胞被保持完整的多架构沿着指定一组细胞。

这种专门的器官的一个例子是类固醇合成器官，许多生物合成酶介导的转化步骤从胆固醇活性类固醇激素1。大多数这些酶的基因的类固醇在器官特异性表达，并且所述生物合成途径被紧紧地通过经由体液输入和神经元的输入许多外部刺激调节。一旦合成类固醇激素分泌到血淋巴和靶向许多组织和器官，用于调节各种基因2的表达。因此，类固醇激素的作用诱导全身性反应保持动态平衡，生长和繁殖。

为了研究类固醇激素的生物合成的功能和类固醇激素的多效性的动作， 果蝇可被用作一个合适的模型系统。在幼虫期，昆虫类固醇激素，蜕皮甾类，在专门的内分泌器官生物合成称为前胸腺（PG）3。在PG，几个ecdysteroidogenic酶特异性催化多个转换步骤从胆固醇蜕皮激素，其控制在适当的发育阶段4蜕皮和变态。因此，在蜕皮甾体滴度的动态变化被调节通过响应于环境暗示许多信号传导途....

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方案

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注:协议的总体方案示于图1。

1.幼虫环压盖的解剖（RG）

注:在D中。 黑腹果蝇 ，属于cyclorrhaphous双翅目，在PG是内复合内分泌器官称为环腺（RG， 图2D）。既然是不可行的是，PG被手术从其它类型的细胞（稍后讨论）的分离，一个实际的目标是通过解剖分离完整的，未损坏的RG。

  1. 幼虫在适当的发育阶段的准备
    注意:要同步果蝇幼虫的发育阶段，有必要窄时间窗内收集鸡蛋，并在适当的时间，以收集幼虫。
    1. 在25℃下收集鸡蛋用于在葡萄果汁琼脂平板2个小时。
    2. 收集刚孵出1 用镊子在解剖显微镜下第一龄幼虫，并将它们传送到包含捣碎标准酵母/玉米面飞食品小瓶。
      注:幼虫的年龄由下式表示，"产卵（HAEL）小时后"，"孵化后小时（HAH）"，或"L3蜕皮（hAL3E）小时后"。
    3. 在适当的时间点，收集与一次性塑料循环上演幼虫避免不必要的伤害。为了最小化在第三龄幼虫的发育进展的差，收集在70 HAEL（48 HAH）第2 次龄幼虫，并允许他们在2周小时的时间间隔蜕皮。然后，收集L....

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结果

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我们使用了上述协议，以可视化类固醇合成器官和果蝇幼虫和成年女性的互动器官。协议的总体方案示于图1。

的RG，包括PG（ 图2D），是比大脑更小和更透明的，并且位于大脑（ 图2A-C和3A-E）的前侧-背侧。以标记PG细胞，几组都产生各种类型的针对ecdysteroidogenic酶的抗体（ 即 ，梦幻岛23，Spookier 24，护罩20，幻影25，无实体25和阴影26）。其中，抗罩（SRO）抗体可靠地用于通过免疫染色以标记PG（ 图2C，2E，和3C）。另外，该比纳尔γ基因表.......

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讨论

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我们研究了蜕皮类固醇的生物合成和果蝇及其调控机制，并制定了解剖和免疫染色的协议。蜕皮甾类生物合成的定时是通过神经元输入33受环境线索，所以它是用脑，VNC，和解剖过程中其他组织沿着保持ecdysteroidogenic器官的神经支配必不可少的。

如上所述， 黑腹果蝇 PG形成与语料库allata（CA）和所述语料库cardiaca（CC）（ 图2D）的复合物的内分泌器官RG。虽然PG产生蜕皮类固醇，CA和CC分别产生保幼激素和激素adipokinetic，。此解剖性质已经阻碍了研究人员在D中学习ecdysteroidogenesis。 果蝇 ，相比于其他昆虫。然而，在过去的几十年里，飞遗传学公顷小号让我们来标识在PG 4特异表达的许多ecdysteroidogenic基因。这些基因在护士细胞或卵巢

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披露

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没有利益冲突的声明。

致谢

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我们感谢赖科·凯泽和Tomotsune Ameku他们为这项工作提供技术支持。我们也感谢凯·托，奥尔加·亚历克西科，明子江东，马赛基·米拉，布鲁明顿果蝇库存中心，京都库存中心（DGRC），以及发展研究杂交瘤细胞银行股票和试剂。这项工作是由日本学术振兴会KAKENHI授权号16K20945，内藤基金会，和井上学研究奖授予YSN支持;并通过文部科学省从格兰特KAKENHI数16H04792一笔赠款，RN。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
种蛋收集
组织培养皿 （55 mm）合一1-8549-02 葡萄汁琼脂盘
收集杯HIKARI KAGAKU
酵母酱东方干酵母，东京
100% 葡萄汁Welch Food Inc.
<强壮>幼虫
小瓶（12ml，40&次;23.5 毫米，PS）SARSTEDT58.487
一次性回环AS ONE6-488-01
标准苍蝇食品 在 Blooington stock center 的网站上接收我们。
<强>解剖
解剖显微镜卡尔蔡司Stemi 2000-C
解剖显微镜徕卡S8 AP0
组织培养皿（35 x 10 毫米，未处理）IWAKI1000-035
SylgardTORAY培养皿内凝结硅
Terumo 针（27G，0.40 x 19 毫米） TERUMONN-2719S"刀"
，Inox，#5Dumont，瑞士
昆虫针（直径 0.18 毫米）滋贺品牌鱼片解剖
微型剪刀NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. MB-50-10
<强>固定
超纯水默克 Millipore
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）
甲醛Nacalai tesque16222-65
多聚甲醛Nacalai tesque02890-45
Triton-X100Nacalai tesque35501-15
微管 （1.5 ml）INA OPTIKACF-0150
孵育
作为一个 swist mixer TM-300（摇杆）作为一个TM-300摇杆
血清白蛋白SIGMA9048-46-8
一抗
抗 Sro（豚鼠）、1：1000
抗 GFP（兔）、1：1000分子探针A6455Shimada-Niwa 和 Niwa，2014
抗 GFP（小鼠 mAb，GF200），1：100Nakarai tesque04363-66
抗 5HT（兔），1：500SIGMAS5545
抗 Hts 1B1（小鼠）发育研究杂交瘤细胞库 （DSHB）1B1
抗 DE 钙粘蛋白（大鼠）、1：20DSHBDCAD2
抗 nc82（小鼠）、1：50DSHBnc82
<强>二抗
山羊抗兔 IgG （H+L） 二抗，Alexa Fluor 488 偶联物Life TechnologiesA-11008
山羊抗小鼠 IgG （H+L） 二抗，Alexa Fluor 488 偶联物Life TechnologiesA-11001
山羊抗大鼠 IgG （H+L） 二抗，Alexa Fluor 546 偶联物Life TechnologiesA-11081
山羊抗豚鼠 IgG （H+L） 二抗，Alexa Fluor 555 偶联物LifeA-21435
Alexa Fluor 546 染料偶联鬼笔环肽技术A-22283
封片剂
微量载玻片Matsunami Glass Ind.，Ltd.SS7213
方形显微镜 盖玻片Matsunami Glass Ind.，Ltd.
FluorSave 试剂（封固剂）Calbiochem345789
移液管 1 ml（一次性滴管）WATSON5660-222-1S
imaging
LSM700 激光扫描显微镜系统蔡司倒置 Axio Observer。Z1 SP 左
图像处理
LSM700 ZENCarl Zeiss这是一个基于 64 位Microsoft Windows7作系统
ImageJ
Fly stocks
w;GMR45C06-GAL4 来自布卢明顿果蝇库存中心。（#46260）
无人机GFP;无人机mCD8：：GFP来自东京大学 K. Ito 的礼物。
w[1118]
w; 幻影-GAL4#22/UAS-turboRFP
w;UAS-mCD8：：GFP;TRH-GAL4参见 Ref29， Alekseyenko， O. V， Lee， C. &克拉维茨，EA（2010）
w;UAS-mCD8：：GFP 来自布卢明顿果蝇库存中心。（#32188）
yw;; nSyb-GAL4 来自布卢明顿果蝇库存中心。（#51941）
切割组织镊子的牛 Life C218181卡尔

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell.....

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