我们描述了一种用于解剖、固定和免疫染色黑腹果蝇（Drosophila）幼虫及成年雌性个体中类固醇生成器官的实验方案，以研究类固醇激素的生物合成及其调控机制。除了类固醇生成器官外，我们还对这些器官的神经支配以及类固醇作用的靶细胞（如生殖系干细胞）进行可视化观察。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
在果蝇 Drosophila melanogaster 中通过免疫染色可视化类固醇生成器官及其相互作用器官的实验方案
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
在多细胞生物中，少数细胞群体具有特殊的生物合成功能，能够诱导机体对生长和繁殖产生系统性反应。 在昆虫中，幼虫期的前胸腺（PG）和成虫雌性卵巢在合成一类主要的类固醇激素——蜕皮类固醇（ecdysteroids）中发挥关键作用。这些合成蜕皮类固醇的器官受到神经系统的神经支配， 其生物合成的时机可受环境信号的调控。本文介绍了一种用于可视化果蝇 Drosophila melanogaster 幼虫和成虫中蜕皮类固醇合成器官及其相互作用器官的实验方案，该体系是研究类固醇激素生物合成及其调控机制的适宜模型。通过熟练的解剖技术，可保持蜕皮类固醇合成器官及其相互作用器官（包括脑、腹神经索及其他组织）的原始位置。利用针对蜕皮类固醇合成酶的抗体进行免疫染色，结合组织特异性启动子驱动的转基因荧光蛋白标记，可有效标记蜕皮类固醇合成细胞。此外，还可利用特异性抗体或多种神经元类型中表达的GAL4驱动系对蜕皮类固醇合成器官的神经支配进行标记。因此，可通过免疫染色与转基因技术 同时可视化 蜕皮类固醇合成器官及其神经连接。最后，本文还描述了如何可视化生殖系干细胞，其增殖与维持受蜕皮类固醇的调控。该方法有助于全面理解类固醇激素的生物合成过程及其神经调控机制。
引言
在多细胞生物中，一群细胞具有特定的生物活性功能，这对整个机体至关重要。为了完成其功能，每种组织或器官都会表达一系列与其功能相关的基因，并与其他组织进行通讯，以协调发育过程中的各项活动。为了表征这些特化的细胞功能及器官间的相互作用，我们需要特异性地标记某一类细胞，同时保持多细胞结构中其他类型的细胞完整不变。
这类特化器官的一个例子是类固醇生成器官，其中多种生物合成酶介导了从胆固醇转化为活性类固醇激素的各个步骤1。这些酶基因中的大多数仅在类固醇生成器官中特异性表达，并且该生物合成途径通过体液输入和神经输入受到多种外界刺激的严密调控。一旦合成，类固醇激素即被分泌到血淋巴中，并作用于多种组织和器官，以调控大量基因的表达2。因此，类固醇激素的作用可诱导产生系统性反应，以维持机体稳态、生长和繁殖。
为了研究类固醇激素生物合成的功能以及类固醇激素的多效性作用， 黑腹果蝇 可作为合适的模型系统。在幼虫阶段，昆虫类固醇激素蜕皮激素在一种称为前胸腺（prothoracic gland, PG）的特化内分泌器官中生物合成。3在咽侧体（PG）中，多种合成蜕皮激素的酶特异性催化胆固醇转化为蜕皮酮的多步反应，该激素在适当的发育阶段调控蜕皮和变态过程。4<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：整体实验方案流程如图1所示。
1. 幼虫环腺（RG）的解剖
注意：在属于环裂亚目双翅目的D. melanogaster中，咽侧体（PG）位于一个称为环腺（RG）的复合内分泌器官内（图2D）。 由于无法通过手术将PG与其他类型的细胞完全分离（后文将讨论），一个可行的目标是通过解剖分离出完整且未受损的RG。
- 准备适当发育阶段的幼虫
注意：为了同步发育阶段 D. melanogaster 幼虫，必须在较短的时间窗口内收集卵，并在适当的时间收集幼虫。- 在25 °C条件下，于葡萄汁琼脂平板上收集卵2小时。
- 收集新孵化的1st 在解剖显微镜下用镊子挑取龄期幼虫，并转移至含有压碎的标准酵母/玉米粉果蝇食物的小瓶中。
注意：幼虫的年龄以 "卵孵化后小时数（hAEL）", "孵化后小时（hAH）"，或 "L3蜕皮后小时数（hAL3E）". - 在适当的时间点，使用一次性塑料接种环收集处于特定阶段的幼虫，以避免造成不必要的损伤。为尽量减....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们采用上述方案对黑腹果蝇（D. melanogaster）幼虫和成年雌性个体中的类固醇生成器官及其相互作用器官进行可视化观察。各方案的整体流程如图1所示。
RG，包括 PG（图 2D），比脑更小且更透明，位于脑的前背侧图2A-C 和 3A-E）。为了标记PG细胞，多个研究团队已针对蜕皮类固醇合成酶开发了多种类型的抗体 (即, 永无乡23，更诡异的24, 遮蔽物20，模体25, 无实体25和影子26）。其中，抗Shroud（Sro）抗体可靠地用于通过免疫染色标记PG（图 2C, 2E，以及 3C<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们研究了黑腹果蝇（D. melanogaster）中蜕皮甾醇的生物合成及其调控机制，并设计了一套用于组织解剖和免疫染色的实验方案。蜕皮甾醇的生物合成时间受环境信号通过神经输入的影响33，因此在解剖过程中必须保持蜕皮甾醇合成器官与脑、腹神经索（VNC）及其他组织之间的神经支配完整性。
如上所述， D. melanogaster PG 与咽侧体（corpora allata, CA）和心侧体（corpora cardiaca, CC）共同构成一个复杂的内分泌器官——围咽器官（RG）图 2D）。尽管咽侧体（PG）产生蜕皮类固醇，但咽侧体（CA）和心侧体（CC）分别产生保幼激素和脂肪体激活激素。这一解剖学特性已成为研究中的障碍 研究正在研究 蜕皮类固醇生成 D. 黑腹果蝇与其他昆虫相比。然而，在过去的几十年中，果蝇遗传学研究使我们能够鉴定出许多特异性表达于咽侧体（PG）的蜕皮类固醇.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
我们感谢 Reiko Kise 和 Tomotsune Ameku 在本研究中提供的技术支持。同时感谢 Kei Ito、Olga Alekseyenko、Akiko Koto、Masayuki Miura、Bloomington Drosophila Stock Center、KYOTO Stock Center（DGRC）以及发育研究杂交瘤库提供的果蝇品系和试剂。本研究得到 Y.S.N. 获得的日本学术振兴会（JSPS）科研费补助金（编号 16K20945）、内藤财团、井上科学研究奖励金资助；以及 R.N. 获得的文部科学省（MEXT）科研费补助金（编号 16H04792）的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>卵收集 | |||
| 组织培养皿（55 mm） | AS ONE | 1-8549-02 | 用于葡萄汁琼脂平板 |
| 收集杯 | 光科学 | ||
| 酵母膏 | 东方干酵母，东京 | ||
| 100% 葡萄汁 | Welch Food Inc. | ||
| <强>饲养幼虫 | |||
| 小瓶（12 ml，40×23.5 毫米，聚苯乙烯（PS） | SARSTEDT | 58.487 | |
| 一次性接种环 | AS ONE | 6-488-01 | |
| 标准果蝇食物 | 布卢明顿果蝇中心网站上的收货人信息。 | ||
| <强>解剖 | |||
| 解剖显微镜 | 卡尔·蔡司 | Stemi 2000-C | |
| 解剖显微镜 | Leica | S8 AP0 | |
| 组织培养皿（35 × 10 mm，未处理） | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | 在培养皿中包埋硅 | |
| Terumo 针头（27G，0.40 × 19 mm） | TERUMO | NN-2719S | A "刀" 切割组织 |
| 镊子，Inox，#5 | 杜蒙，瑞士 | ||
| 昆虫针（直径0.18 mm） | 志贺品牌 | 用于去骨解剖 | |
| 微型剪刀 | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| <强>固定 | |||
| 超纯水 | 默克密理博 | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | |||
| 甲醛 | Nacalai Tesque | 16222-65 | |
| 多聚甲醛 | Nacalai Tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| 微型离心管（1.5 ml） | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| <强>孵育 | |||
| As one Swist Mixer TM-300（摇床） | 作为一个 | TM-300 | 摇床 |
| 牛血清白蛋白 | SIGMA | 9048-46-8 | |
| <强>一抗 | |||
| 抗Sro抗体（豚鼠），1:1000 | |||
| 抗GFP（兔），1:1000 | 分子探针 | A6455 | Shimada-Niwa 和 Niwa，2014 |
| 抗GFP（小鼠单克隆抗体，GF200），1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| 抗5HT（兔），1:500 | SIGMA | S5545 | |
| 抗Hts 1B1（小鼠） | 发育研究杂交瘤库 (DSHB) | 1B1 | |
| 抗DE-钙黏蛋白（大鼠），1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| 抗nc82（小鼠），1:50 | DSHB | nc82 | |
| <强>二抗 | |||
| 山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记 | Life Technologies | A-11008 | |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记 | Life Technologies | A-11001 | |
| 山羊抗大鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 546标记 | Life Technologies | A-11081 | |
| 山羊抗豚鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 555标记 | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 荧光染料标记的鬼笔环肽 | Life Technologies | A-22283 | |
| <强>封片剂 | |||
| 显微载玻片 | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| 方形显微镜盖玻片 | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave 封片剂（封片试剂） | Calbiochem | 345789 | |
| 移液管 1 ml（一次性滴管） | WATSON | 5660-222-1S | |
| <强>成像 | |||
| LSM700 激光扫描共聚焦显微镜系统 | 卡尔·蔡司 | 倒置 Axio Observer. Z1 SP 左侧 | |
| <强>图像处理 | |||
| LSM700 ZEN | 卡尔·蔡司 | 它是一个基于 64 位 Microsoft Windows 7 操作系统的特殊用户界面 | |
| ImageJ | |||
| <强>果蝇品系 | |||
| w；GMR45C06-GAL4 | 来自布卢明顿果蝇资源库。（#46260） | ||
| UAS–GFP；UAS–mCD8::GFP | 东京大学伊藤K.惠赠 | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w；UAS-mCD8::GFP；TRH-GAL4 | 参见参考文献29，Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010) | ||
| w；UAS-mCD8::GFP | 来自布卢明顿果蝇资源中心。（#32188） | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | 来自布卢明顿果蝇资源中心。（#51941） |
参考文献
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell.....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
