评估淀粉样蛋白-β和Tau神经病理学转基因小鼠模型中的自发交替、新物体识别和肢体抓握行为

摘要

本文介绍了一种分阶段的行为学筛选方法，可用于在β-淀粉样蛋白沉积和tau蛋白病变的转基因小鼠模型中，筛选对认知功能和运动功能具有体内疗效的化合物。这些方法经过优化，适用于筛选化合物在短期记忆和工作记忆任务中的活性。

摘要

本文介绍了一种分阶段的行为学检测方法，可用于筛选在β-淀粉样蛋白沉积和tau蛋白病变的转基因小鼠模型中对认知功能和运动功能行为具有体内疗效的化合物。该检测范式包括Y型迷宫中的自发交替实验、新物体识别实验以及肢体抓握实验。选择这些实验的原因如下：1）能够检测与人类疾病状态相关的认知或运动功能域及其对应神经环路的功能；2）具有明确的终点指标；3）具备易于实施的质量控制检查；4）可采用中等通量的形式进行；5）实验过程中研究人员干预较少。本方法适用于希望筛选在短期记忆和工作记忆任务中，或在阿尔茨海默病小鼠模型相关的功能性运动行为中具有活性化合物的研究人员。本文所述方法所采用的行为学测试涉及多个不同的脑区，包括海马体和多种皮层区域。若研究人员希望使用专门评估单一脑区介导认知功能的测试，可将这些技术作为其他行为学测试的补充手段。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，可导致严重的认知功能下降，目前全球约有4400万人受其影响。目前尚无任何可改变疾病进程的AD治疗手段，凸显了迫切需要在临床前阶段发现针对该病的新型治疗策略。已开发出多种不同的转基因小鼠模型，可再现阿尔茨海默病的多个方面^1,2，包括患者认知功能受损的领域³这些小鼠模型是促进高效筛选的有用工具 体内.

在评估化合物潜在的体内疗效时，必须采用分阶段的方法，既要筛选其在相关认知领域中的有效性，也要监测可能影响用于评估认知的特定终点指标的行为。许多阿尔茨海默病（AD）转基因小鼠模型表现出活动过度及其他可能干扰特定认知测试的行为，从而限制了这些测试在药物筛选中的应用⁴。此外，若要在药物筛选环境中实施某种方法，所采用的具体测试应具备至少中等通量、具有明确定义的终点指标，并且操作流程应尽量减少研究人员的干预。基于这些标准，可建立具有良好可重复性、低实验内和实验间变异度以及足够效应量的行为学筛选方法，以满足化合物筛选的需求。本文详细描述了我们用于筛选可缓解β-淀粉样蛋白沉积症和tau蛋白病转基因小鼠模型中认知与运动表型的化合物的方法^5,6。所述方法借鉴了文献中常用的多种行为学范式⁷，并进行了特定优化和质量控制，以便适用于与AD相关的转基因小鼠模型。本方案可与多种数据采集和分析系统配合使用，假定研究人员已掌握相关软件的操作知识。

方案

本出版物中详述的方法已由Hilltop Laboratory Animals的机构动物照护与使用委员会（IACUC）审核，以确保动物的照护、使用及人道待遇符合所有适用的联邦、州和地方法律与法规要求，包括联邦《动物福利条例》（AWRs，CFR 1985）以及《公共卫生服务关于实验动物人道照护与使用的政策》（PHS Policy，PHS 1996）。

1. 所有行为评估的通用指南

1. 在接触任何动物之前，用新的笼卡覆盖现有的笼卡，新笼卡上仅标注唯一的、盲化的动物编号。
   注意：在常规给予化合物/安慰剂期间接触小鼠的研究人员，不得参与小鼠的行为学评估。
2. 调暗或关闭顶灯，调整光照条件，使旷场或迷宫地面的照度为30–35 lux。
3. 对于持续数周的研究，应每周记录一次体重，作为评估整体健康状况的间接指标。
   注意：若需更全面的健康检查，可额外进行笼边观察，评估毛发质量、姿势、步态和自发运动情况。

2. 使小鼠适应研究人员的抓取操作

1. 在进行任何行为学实验前两天，使小鼠适应操作处理。将笼具从笼架上取下，置于水平表面上。
2. 打开笼子的盖子。以即将进行的行为学实验中的相同方式抓取小鼠。将小鼠置于手心，在其所在笼子上方。
3. 测量小鼠从研究者手中跳回鼠笼的潜伏期。握住小鼠的时间最长不超过5 s。
   注意：潜伏期 ≥2 秒的小鼠被视为“已习惯化”。潜伏期表现出的小鼠 <在第一次试验中持续2秒的小鼠当天需再进行2次额外的适应性训练。
4. 让小鼠接受连续2天的抓取适应训练。记录在2天结束时仍未适应的任何小鼠。^nd 天

3. 通过Y型迷宫中自发交替行为的测量来评估空间工作记忆⁸

1. 首次使用前，用无香味的含氯消毒湿巾彻底清洁Y迷宫，随后用70%乙醇（EtOH）和去离子水（dH₂O）冲洗⁹。将迷宫的各臂明确标记为“A”、“B”和“C”或其他等效的唯一标识符。
2. 在测试开始前，设置数据采集系统或视频摄像机，并确保对小鼠在迷宫中的运动进行正确追踪。使用已知长度的标尺或其他物体的视频图像校准迷宫中的距离。
   注：本方案中的行为学方法适用于多种数据采集系统，作者假设执行该实验的操作者已熟练掌握所选数据采集系统的使用。功效分析表明，每组需要10至15只小鼠的样本量，才能达到β ≤0.2的统计功效。
3. 将小鼠笼从笼架上取下，轻轻放置在靠近Y迷宫的桌面上。将小鼠从其饲养笼中取出，轻轻放入Y迷宫的一个臂中，使其朝向中心区域。实验人员应退至足够远的位置，确保小鼠无法看到实验人员。
4. 在将小鼠放入迷宫后，立即启动数据/视频采集系统。
5. 按下播放键，记录每只小鼠10分钟的自发行为。一次测试结束后，将小鼠轻柔地放回其饲养笼，并将笼子放回笼架。
6. 每次测试之间，均需用无香味的含氯消毒湿巾彻底清洁迷宫，随后用70%乙醇（EtOH）和去离子水（dH₂O）冲洗。重复步骤3.4，以完成所有小鼠的测试。
7. 在所有小鼠完成Y迷宫探索后，分析数据采集系统记录的数据，或人工评分各次测试的视频。当小鼠的四只脚均越过中央区域的边界进入某一臂，且其鼻尖朝向该臂末端时，记为一次有效的臂进入。
   注：将分析的终点指标包括：在迷宫中移动的总距离、在每个臂内（包括中央区域）移动的总距离、在每个臂内（包括中央区域）停留的总时间、总的臂进入次数、进入每个臂的次数，以及臂进入顺序的序列列表，用于评估交替次数。
8. 当小鼠在连续三次臂进入中进入三个不同的臂时，记为一次自发交替。自发交替百分比（%）按以下公式计算：
   
   注：例如，若臂进入顺序为：ABCCBABCABC，则实验人员应记录共6次自发交替（依次为：ABC、CBA、ABC、BCA、CAB、ABC）。在总共11次臂进入中，自发交替百分比为67%。
9. 进行以下质量控制检查，以确保数据能够无偏地反映自发交替行为。
   1. 对自发交替百分比与总移动距离及总臂进入次数分别进行皮尔逊相关性分析。
      注：若自发交替百分比与任一参数存在显著相关性，则提示可能存在过度运动对表观认知终点指标的干扰，需进一步审慎分析数据¹⁰。
   2. 使用单因素方差分析（1-way ANOVA）分析进入每个臂的次数。
      注：若该分析结果显著，则表明环境中存在某些线索，吸引了小鼠偏向迷宫的某一特定区域。

通过测量新物体识别能力评估中期识别记忆^11,12,13

1. 对于该测试的每个阶段，需使用无味含氯消毒湿巾彻底清洁旷场实验装置，随后用70% EtOH和dH₂O擦拭。₂O 在初次使用前。
2. 在物体暴露前一晚，使小鼠适应开放场环境。
   1. 在习惯化阶段开始之前，设置好数据采集系统或视频摄像机，并确认能够正确追踪小鼠在迷宫中的运动。使用带有已知长度标尺或其他已知尺寸物体的视频图像，校准场地中的距离。在软件中标记场地的角落，以便评估位置偏好。
      注意：本实验方案中的行为学方法可与多种数据采集系统配合使用，作者假设执行该方案的研究人员已熟练掌握其所选用的数据采集系统的操作。功效分析表明，每组需要15至20只小鼠，才能达到β ≤0.2的统计功效。
   2. 将笼子从架子上取下，轻轻放置在靠近实验区域的桌面上。
   3. 将小鼠从饲养笼中取出，轻轻放置于旷场中央。小鼠放入旷场后，立即启动追踪软件和/或视频记录系统。
   4. 让小鼠在实验区域内自由探索30分钟。
      注意：在此期间，研究人员不得打扰小鼠。
   5. 习惯化阶段结束后，将小鼠放回其原饲养笼，并使用无香味的含氯消毒湿巾彻底清洁实验区域，随后用70% EtOH和dH₂O擦拭。₂O.
   6. 重复步骤 4.2.2，直至所有小鼠均适应实验环境。
   7. 在所有小鼠均适应实验区域后，分析视频。
      注意：需分析的指标包括小鼠在旷场中的总移动距离和在每个角落停留的时间。若与小鼠模型相关，还应将刻板行为纳入分析中即肌阵挛性转角跳跃、转圈 等等。表现出在竞技场特定区域停留时间存在偏好的小鼠将被排除在后续实验之外，因为这会影响物体探索行为。
      注意：新物体识别实验的第一阶段是让小鼠熟悉一个物体。本实验程序的这一部分将称为样本阶段。
   8. 在开始样本阶段实验前，将物体放入实验 arena 中，并使用固定橡皮泥将物体固定在地板上，以防止动物移动物体。将两个相同的物体对齐至某一特定墙壁，并确保墙壁与物体之间留有足够距离，以便小鼠能够从各个角度自由探索物体。
   9. 设置数据采集系统或视频摄像机，并确认能够准确追踪迷宫中小鼠和物体的活动。使用已知长度的标尺或其他物体的视频图像，对实验区域的距离进行校准。
   10. 在软件中标记竞技场的四个角落，以评估位置偏好。在软件中标记物体，并分别追踪每种物体的探索行为。即，“对象A”和“对象B”）。
   11. 将笼子从架子上取下，轻轻放置在靠近实验区域的桌面上。
   12. 将小鼠从饲养笼中取出，轻柔地放置于实验区域中央，使其面向物体。
   13. 让小鼠自由探索物体15分钟。在此期间不要打扰小鼠。
   14. 实验结束后，轻柔地将小鼠放回其饲养笼中。使用70% EtOH和dH₂O清洁实验区域及物体。₂O. 将这些物体放回实验区域。
   15. 重复步骤 4.2.11，直至所有小鼠均熟悉某一物体。
   16. 在所有小鼠均已熟悉物体后，分析视频。
       注意：当满足以下条件时，才计为一次物体探索：小鼠朝向物体，鼻尖距物体在2 cm以内，动物身体中点位于物体2 cm以外，且上述条件持续至少1秒。此外，若动物虽已满足探索标准但在探索期间表现出静止不动，则 > 10秒后，则认为探索阶段结束。
   17. 按如下方法计算每只小鼠的物体偏向得分。
       
       注意：对象偏好评分低于20%或高于80%的小鼠将被排除在后续实验之外。
3. 新物体识别实验的最后阶段是评估动物对环境中新物体和熟悉物体的探索行为，此阶段称为测试阶段。该阶段在样本阶段结束后2-3小时进行。
   1. 在测试阶段会话开始前，将物体放入实验 arena 并固定在地面上，以防止动物移动这些物体。
      1. 将物体置于竞技场内相对于样本阶段的相同位置¹³.
      2. 在不同基因型和处理组之间平衡新物体与熟悉物体的相对位置。
      3. 确保墙壁与物体之间留有足够的距离，以便小鼠能够从各个角度自由探索物体。
   2. 设置数据采集系统和/或视频摄像机。确认小鼠和迷宫中物体的追踪正常。使用已知长度的标尺或其他物体的视频图像校准实验区域的距离。
   3. 在软件中标记实验区域的角落，以评估位置偏好。在软件中标记物体，并分别追踪每种物体的探索行为。即，“新异”和“熟悉”）
   4. 将笼子从架子上取下，轻轻放置在靠近实验区域的桌面上。
   5. 将动物轻柔地放置于实验区域中央，使其面向物体。记录小鼠自由探索物体10分钟。
   6. 测试结束后，将小鼠从实验区域移出并放回其原居住笼具中。使用无香味的含氯消毒湿巾、70%乙醇和去离子水彻底清洁实验区域及物体。₂每次实验结束后进行O。
   7. 重复步骤 4.4.3，直至完成所有动物的评估。
   8. 所有小鼠的物体探索行为测量完成后，对视频进行分析。
      注意：当满足以下条件时，才计为一次物体探索：小鼠朝向物体，鼻尖距物体在2 cm以内，动物身体中点距物体超过2 cm，且上述条件持续至少1秒。此外，若动物虽已满足探索标准但在探索期间表现出静止不动，则 > 10 秒后，则认为探索阶段结束。
   9. 通过比较动物探索新物体与熟悉物体所花费的时间，评估新物体识别能力。文献中通常报告三种方法。
      1. 使用重复测量检验分析探索新物体和熟悉物体的原始时间。当基因型和/或处理不影响总探索时间时，该方法最为适用。
      2. 使用以下公式计算新奇偏好：
         
         注意：该值表示探索新物体的时间占探索物体总时间的百分比。取值范围为0%（完全未探索新物体）至100%（仅探索新物体），50%表示对新物体和熟悉物体的探索时间相等。
      3. 计算辨别指数¹¹，使用公式：
         
         注意：该值表示探索新物体与熟悉物体的时间差异相对于探索物体总时间的比例。数值范围为-1（仅探索熟悉物体）到+1（仅探索新物体），数值为0表示对新物体和熟悉物体的探索时间相等。
   10. 移除因过度活跃的运动行为或其他刻板行为而未参与测试阶段的动物，不予考虑¹¹.
       注意：用于剔除的标准必须是客观的，并事先确定 先验的 对于小鼠模型（即, <5^th 总探索时间的百分位数以及任一 >测试期间的平均转向角100度 >50^th 表现出肌阵挛性转角跳跃的百分位时间。

5. 利用肢体抓握评估小鼠的皮质脊髓功能¹⁴

1. 全程录像记录实验过程。使用便携式手持设备（即，智能手机或同等设备）进行视频录制。
   注：功效分析表明，每组需要10-15只小鼠的样本量，以达到β ≤0.2。
2. 将小鼠的饲养笼从笼架上取出，并放置于桌面上。在进行下一步操作前，应在视频中记录动物编号。
3. 轻柔地将小鼠从笼中取出，并用尾部悬吊5-10秒。视频必须完整记录小鼠悬吊期间的前肢和后肢动作。
4. 在至少采集5秒的视频后，将小鼠放回其原饲养笼中，并将笼子放回笼架。
5. 清洁桌面。重复步骤5.2，直至所有小鼠均完成记录。
6. 根据小鼠尾部悬吊视频，按照0-4分的评分标准对肢体抓握行为进行评分（评分标准详见表1）。观看悬吊小鼠的视频录像，并依据以下标准进行评分。
   1. 无肢体抓握现象。具有正常的逃脱性伸展反应。一只后肢表现出不完全伸展和活动能力丧失，但脚趾伸展正常。
   2. 双侧后肢均表现出不完全伸展和活动能力丧失，但脚趾伸展正常。
   3. 双侧后肢出现抓握动作，脚趾卷曲且无法活动。
   4. 前肢和后肢均出现抓握动作，肢体交叉，脚趾卷曲且无法活动。
7. 所有小鼠均由两名独立的研究人员进行评分。若两名评分者之间的评分差异超过1分，则需对该小鼠重新评分一次。
   1. 对于存在差异的评分，取其平均值作为最终得分。

表 1：肢体抓握评分说明。

结果

老年Tg2576小鼠在Y迷宫中的自发交替行为表现出显著缺陷^15,16，该表型可通过本文所述方法成功复制（图1A）。尽管这些小鼠在进入迷宫臂次数上呈现增加趋势（图1B），但该品系小鼠表现出的过度活跃并未影响其自发交替率（图1C）。相比之下，老年rTg4510小鼠在被放入Y迷宫后似乎表现出自发交替行为增加（图1D）。这实际上是由于极度的过度活跃（图1E）和刻板行为¹⁰所致，这些因素会显著干扰自发交替行为的准确测量（图1F）。在首次评估小鼠此项任务表现时，必须确保进入迷宫臂的次数和/或移动距离与自发交替率之间无显著相关性。

在进行新物体识别评估之前，需让小鼠适应即将开展测试的实验区域。在适应阶段，可评估小鼠的过度活跃行为（图 2A）以及其他与小鼠模型相关的刻板行为。在样本阶段，必须分别测量小鼠对每个物体的探索时间，以便排除在探索行为上表现出显著偏好的个体，不再纳入后续分析（图 2B，空心圆圈）。新物体识别通过比较小鼠对熟悉物体和新物体的探索程度来评估，通常有三种分析方法。如果不同基因型和/或处理组之间的总探索时间相似，则可直接使用各物体的原始探索时间，并结合适当的重复测量检验方法，判断新物体识别能力是否存在差异（图 2C）。若特定小鼠品系在总探索时间上存在差异，则可采用新奇偏好（图 2D）或辨别指数（图 2E）来评估新物体识别能力。

肢体抓握是一种用于量化皮质脊髓功能障碍的功能性运动检测方法。肢体抓握并非认知功能的测量指标，在多种转基因tau小鼠模型中均可观察到该现象^6,17,18,19，并重现了晚期阿尔茨海默病（AD）患者中所见的部分功能性运动缺陷。将小鼠通过尾巴悬吊会引发其逃避反应（图3A，“0”）。根据后肢无法伸展及脚趾不能张开的程度，按照0至4的评分标准进行评分（图3A）。采用本文所述的操作步骤，可在rTg4510小鼠中观察到显著的肢体抓握现象（图3B）。

图1：Y型迷宫中的自发交替行为。（A）将小鼠放入Y型迷宫后，它们会采用一种“非固定转换”的搜索策略，表现为每进入三个臂时，每个臂恰好被探索一次。老龄Tg2576小鼠在自发交替行为上表现出显著缺陷。根据本方法所述的操作流程，在使用一种专有化合物处理后，观察到自发交替行为显著恢复。数据采用单因素方差分析（1-way ANOVA），并使用Dunnett检验进行与Tg-PBS组的事后比较。**p <0.01。误差条表示标准误（SEM）。（B）本实验监测的各组之间臂进入次数无显著差异。数据采用单因素方差分析。误差条表示标准误（SEM）。（C）自发交替行为与臂进入次数之间无相关性，表明任何自发运动活动的差异均未影响对自发交替行为的量化结果。相关性检验采用Pearson相关性分析。（D）将rTg4510小鼠（6月龄）放入Y型迷宫后，其自发交替行为似乎显著高于同窝出生的野生型（WT）小鼠。数据通过单因素方差分析进行分析，并使用Dunnett检验进行与Tg-PBS组的事后比较。**p <0.01。误差条表示标准误（SEM）。（E）由于rTg4510小鼠表现出极度亢进的运动行为，其臂进入次数显著增多。数据通过单因素方差分析进行分析，并使用Dunnett检验进行与Tg-PBS组的事后比较。***p <0.001。误差条表示标准误（SEM）。（F）自发交替行为与臂进入次数之间存在显著相关性，表明亢进的运动表型掩盖了真实的自发交替行为。相关性检验采用Pearson相关性分析（r = 0.7，p <0.0001）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：新物体识别。（A）在开放场地适应阶段，可测量小鼠的自发运动及其他与特定小鼠模型相关的刻板行为。此处显示，老年Tg2576小鼠（22月龄）的自发运动显著高于同窝出生的野生型（WT）小鼠。数据采用单因素方差分析（1-way ANOVA），并使用Dunnett检验对Tg-Veh组进行事后比较。**p <0.01。误差条表示标准误（SEM）。（B）在样本阶段，分别追踪小鼠对两个相同物体的探索行为。对其中一个物体表现出明显探索偏向的小鼠（空心圆圈）被排除在测试阶段之外。（C–E）通过测量小鼠对新物体和熟悉物体的探索行为来评估新物体识别能力。新物体识别能力分别通过（C）原始探索时间、（D）新奇偏好指数或（E）辨别指数进行评估。C图中的数据采用重复测量双因素方差分析（2-way ANOVA），并使用Sidak检验进行成对比较。D–E图中的数据采用单因素方差分析，并使用Dunnett检验对Tg-Veh组进行事后比较。*p <0.05，**p <0.01。误差条表示标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：肢体抓握测试。（A）表现出不同程度肢体抓握行为的小鼠代表性图像，具体分级见表1。（B）与同窝出生的野生型（WT）小鼠相比，6月龄的rTg4510小鼠表现出显著的肢体抓握行为，评分依据为本方法。数据采用单因素方差分析（1-way ANOVA）进行分析，并使用Dunnett's检验对Tg-PBS组进行事后比较。***p <0.001，****p <0.0001。误差线表示标准误（SEM）。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

该技术相对于现有方法的重要性
该程序旨在用于筛选 体内 在β-淀粉样蛋白病和tau蛋白病的转基因小鼠模型中检测化合物的活性。此处采用的分阶段方法可确保在与阿尔茨海默病相关的认知领域中有效化合物的检出³此外，本文详述的方法采用具有明确定义终点指标的行为学测试，易于实施质量控制检查，可在中等通量模式下运行，且需要研究者的干预极少。这些特点使得该检测方法在个体动物内部及不同组间均表现出良好的可重复性，从而实现较低的检测内和检测间变异以及效应量（2 ≤f ≤6）足以在药物发现环境中支持行为特征分析。

实验方案中的关键步骤
目前用于阿尔茨海默病药物发现的许多小鼠模型均表现出与高度焦虑和攻击性一致的行为。因此，在进行此处所述的任何行为学测试之前，对动物进行操作习惯化处理至关重要。由于这些测试依赖于无动机驱动的自发行为，若实验人员因小鼠过度活跃、焦虑或具有攻击性而进行粗暴操作，将显著影响其行为表现。 heightened anxiety 可能导致小鼠无法完成任务，从而降低测试的整体效能。此外，测试环境中光照强度对于促进各项测试所需的自发运动至关重要。强光通常会增加啮齿类动物的焦虑情绪并抑制其运动活性，因此应特别注意将测试区域的环境光照强度调节至 30–35 lux。

该实验操作的另一个关键方面是尽量减少可能干扰动物完成任务能力的强烈环境线索。每次实验间隔期间对实验区域和物体进行清洁至关重要，因为小鼠会被环境中的新气味所吸引。若未能彻底清洁实验区域和物体，可能导致小鼠自发活动出现偏差，从而掩盖其真实认知表现。实验人员在操作过程中还应尽量避免使用个人护理产品以及香水或古龙水。最后，啮齿类动物在许多明显行为上表现出显著的昼夜节律和生物钟变化²⁰，包括学习与记忆能力²¹。因此，为了尽量减少基础行为和认知表现因昼夜节律导致的变异，所有实验应在每天相同的时间段内进行，且在不同组别和研究之间保持一致。

此外，针对新物体识别实验，样本阶段与测试阶段之间的延迟间隔，以及环境中物体的选择与放置位置是关键参数。记忆以三种不同的形式存在：短期记忆（STM）、中期记忆（ITM）和长期记忆（LTM）^22,23。将样本阶段与测试阶段之间的间隔从数分钟（STM）调整为数小时（ITM）或数天（LTM），会改变该实验程序所检测的记忆类型¹²。此外，在开展新物体识别测试之前，应使用一组测试小鼠队列对多种物体进行筛选，以排除探索行为中的潜在偏好偏差。若某一物体对测试队列小鼠具有过强的吸引力或排斥性，则不能用于新物体识别的评估。理想情况下，当所有拟用于测试的物体被放置于实验区域时，均应引起 naïve 小鼠队列相似的探索时间。对物体缺乏充分的测试与优化会显著降低新物体识别实验的检测效能。

修改与故障排除
有多个因素可能增加本文所述认知测试中表观变异性。许多阿尔茨海默病（AD）小鼠模型表现出过度活跃的运动行为³，这可能会掩盖或改变作为认知终点所测量的行为。此外，越来越多的证据表明，性别^24,25,26 甚至母体基因型²⁷ 都可能影响AD小鼠模型中神经病理学及认知表型的发展与进展。出现意外的变异性或无法成功实施某项行为学任务，可能与上述任一因素有关。在首次实施特定行为学测试时，结果应始终按性别、年龄以及（如适用）母体基因型进行分层分析。此外，应始终执行本方案中概述的质量控制检查，以确保过度活跃或其他刻板行为不会干扰对认知终点的定量评估。

环境也可能影响啮齿类动物的自发探索行为。研究人员无法察觉的气味或声音可能会吸引或驱赶小鼠，从而影响依赖自发行为的认知测试结果。在初次建立Y迷宫或新物体识别实验时，必须采取对照措施，以确保动物对物体和/或环境的探索不存在位置偏好。若观察到位置偏好，研究者必须仔细检查实验环境，并可能需要调整光照条件、实验装置的摆放位置，以及测试房间相对于设施内其他房间的位置。即，不要靠近交通频繁的区域或重型设备）以及实验区域的清洁程序。

在新物体识别实验中，对测试环境的适应是获得最佳表现的关键。例如，总探索时间较短可能是由于适应不足所致。除了本文所述的抓取（第2节）和测试 arena（第4.2节）适应程序外，也可采用每天3次、每次5分钟、连续2天的方式进行抓取及测试环境的适应。

该技术的局限性
与任何实验方法一样，这些行为学测试也存在局限性。之所以采用这些方法，是因为它们能够检测大脑皮层不同区域及海马的功能。如果小鼠模型在这些测试所涉及的脑区并未表现出功能缺陷，则这些技术将不适用。此外，我们选择的认知测试主要评估短期记忆。如果处于临床前评估阶段的化合物其作用机制预期不会影响短期记忆，则应相应地调整这些实验方案（例如，延长样本期与测试期间隔以评估长期记忆）。最后，这些测试依赖于无动机驱动的行为。因此，若小鼠模型表现出过度多动，或存在其他刻板行为而妨碍其对环境的探索，则这些方法可能并非最佳选择。作为替代方案，可对Tg2576或其他β-淀粉样变性小鼠模型使用恐惧条件反射实验，或对rTg4510及其他tau蛋白病变小鼠模型使用空间水迷宫实验³。

未来应用
一旦这些实验流程在实验室中成功建立，可进行多种改进或拓展，以评估其他认知功能和运动功能指标。例如，可修改新物体识别实验，以确定小鼠是否能够识别物体位置的变化¹³。或者，不使用物体，而改用其他小鼠，实施社会识别测试。在肢体抓握反射和运动功能方面，可补充使用悬丝实验和/或握力测试。本方法中详述的这些检测为筛选在阿尔茨海默病（AD）转化小鼠模型中具有in vivo（体内）功效的化合物提供了坚实的基础，并可根据特定小鼠模型的研究需求或独特的药物发现项目要求，以多种方式进行调整和优化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Topscan Lite-高通量	Cleversys		自动化行为分析。包括摄像头、视频采集系统和笔记本电脑。
ObjectScan	Cleversys		用于精确量化对象探索行为的软件模块
小鼠开放旷场实验	Cleversys	CSI-OF-M	新物体识别实验装置
小鼠Y型迷宫	自定义		臂：长30 cm，宽10 cm，高20 cm，彼此间隔120度放置。
开放场摄像机支架	自定义	自定义	高76 cm，宽115 cm，摄像头安装于两侧内侧30 cm处。  两个支架，每个覆盖两个盒子。
Y迷宫相机支架	自定义	自定义	高76厘米，宽115厘米，摄像头安装于两侧内侧30厘米处。  一个支架覆盖两个迷宫。
弹珠	英佩里亚玩具	8565	标准（直径15.5 mm）玻璃弹珠
骰子	Cardinal Industries	770	标准（0.650英寸）白色骰子，黑色点数
LOCTITE Fun-Tak	Henkel	B018A3AG0W	标准蓝色粘性胶带
EtOH	Nexeo Solutions	82452	70% 乙醇（使用蒸馏水将100%乙醇稀释而成）
dH2O	Tulpenhocken Spring Water Co.	-	宾夕法尼亚州 D.E.P. 编号 31，新泽西州 D.O.H. 编号 0049，纽约州卫生部证书编号 320
纸巾	Procter &宝洁	B019DM86LA	白，博恩蒂
手持式摄像机	Apple, Inc.	MKV92LL/A	肢体抓握行为视频采集，iPhone 6S Plus（或功能相当的设备）。
手套	SafePOINT, L.L.C.	GL640-2	标准型无粉乳胶手套，中号
光度计	Dr. Meter	LX1330B	开放场底部照度 = 35 LUX，Y迷宫底部照度 = 32 LUX
漂白消毒湿巾	Clorox		实验过程中设备的灭菌 &以及使用后