人洗涤血小板中的浊度测定：Pannexin1抑制剂亮蓝FCF对胶原诱导聚集的影响

摘要

我们介绍一种从人血中分离洗涤血小板并随后通过浊度法测定激动剂诱导血小板聚集的简便方法。作为示例，我们应用该方法研究人血小板在预先孵育潘尼克斯1通道抑制剂亮蓝FCF后对胶原的聚集反应。

摘要

比浊法是一种实验室技术，通过使用一种或多种激动剂，测定悬浮于血浆（富含血小板血浆，PRP）或缓冲液（洗涤血小板）中的血小板聚集程度。将洗涤血小板从其血浆环境中分离并去除抗凝剂后，可用于研究血小板的内在特性。在众多激动剂中，花生四烯酸（AA）、二磷酸腺苷（ADP）、凝血酶和胶原蛋白是最常使用的几种。血小板聚集反应通过在持续搅拌条件下，测定血小板悬液随时间变化的相对光密度（OD）来量化。均一悬浮状态的血小板在加入激动剂后会限制光线通过，血小板发生形态改变，导致OD短暂轻微升高。在此初始活化阶段之后，血小板逐渐形成聚集体，使光线更易通过悬液，从而导致OD降低。最终，聚集过程以百分比形式表示，参照物为贫血小板血浆或缓冲液的OD值。因此，每次实验开始前必须进行严格的校准。一般原则是：将未刺激的血小板悬液的OD值设为0%，而将不含血小板的悬液介质的OD值设为100%。血小板聚集通常以实时聚集曲线的形式呈现。比浊法是研究血小板功能最常用的实验室技术之一，被视为历史性的金标准，也被广泛用于开发旨在抑制血小板聚集的新型药物制剂。本文中，我们详细描述了以下两项实验方案：1）人源洗涤血小板的制备；2）采用比浊法分析经食用染料亮蓝FCF预处理后的人源洗涤血小板在胶原蛋白诱导下的聚集情况，该染料最近被鉴定为Pannexin1（Panx1）通道的抑制剂。

引言

血小板是血液中的重要成分，其主要功能是与凝血因子共同作用，在血管损伤后阻止出血。血小板是由骨髓中的巨核细胞产生的微小（2–3 µm）无核碎片¹血小板在未活化状态下循环，此时呈透镜状结构。当血管内皮中断时，血小板会聚集至血管损伤部位以堵塞破口，此过程称为初级止血。最初，血小板黏附于因损伤而暴露的内皮下分子（如胶原和血管性血友病因子），即黏附阶段。²然后，它们改变形态并分泌化学信使——激活步骤。最后，通过桥接受体相互连接——聚集步骤。初级止血之后是继发过程，涉及凝血级联反应的激活以及纤维蛋白的沉积，从而稳定初始血栓。².

急性缺血事件（如心肌梗死³）通常由动脉粥样硬化斑块因物理性破裂而引发血栓形成所致。目前抗血小板药物是治疗这一广泛流行疾病的基础，但其临床获益受到出血风险增加的限制。在心血管疾病患者中最常用的药物——阿司匹林和抗P2Y12化合物——分别作用于血栓素A2通路和ADP通路⁴，这两条通路是导致血小板活化的主要途径。然而，仍需开展创新性研究，以寻找能够理想平衡抗血栓效果与出血风险的新靶点。

自20世纪60年代⁵至今，比浊聚集测定法在研究中发挥了关键作用，不仅加....

方案

招募了五名无亲缘关系的健康志愿者，采集血液样本用于血小板分离和聚集试验。已获得书面知情同意，且该研究方案经日内瓦大学医院中央伦理委员会批准。所有志愿者均确认身体健康，且在实验前至少10天内未服用任何影响血小板功能的药物。

1. 人血采集与洗涤血小板分离的缓冲液制备

1. 通过将1.4 g柠檬酸一水合物（C₆H₈O₇•H₂O，66.6 mM）、2.5 g枸橼酸钠二水合物（Na₃C₆H₅O₇•2 H₂O，85 mM）和2 g无水D(+)-葡萄糖溶解于水中，配制100 mL的酸性枸橼酸葡萄糖（ACD）溶液。该溶液的pH约为4.5。
2. 按以下方法配制台氏液（Tyrode's buffer）的储备液
   1. 将80 g NaCl、2 g KCl、10 g NaHCO₃和0.58 g NaH₂PO₄*H₂O溶解于500 mL蒸馏H₂O中，配制储备液1。各成分的终浓度分别为2.73 M、53.6 mM、238 mM和8.4 mM。将溶液保存于4 °C。
   2. 将10.15 g MgCl<....

结果

血小板聚集仪软件会自动生成聚集曲线，并提供以百分比表示的最大聚集率数值。这些数值可复制到数据分析软件中，用于统计分析，并以柱状图形式展示最大聚集率。此外，也可选择将聚集曲线上各个数据点依次导出至电子表格软件，再导入统计软件中进行分析。例如 使用 GraphPad 绘制曲线图以直观显示曲线。一些研究者利用聚集曲线的最大斜率来计算反应速度，并通过计算曲线下面积来评估血小板活性。延迟时间（lag time）和形态变化也可通过图形直观呈现。

在对照条件下洗涤后人血小板聚集曲线的典型示例（H₂O）如图所示 图2A加入激动剂（胶原）后，血小板发生形态改变，导致聚集曲线出现短暂延迟后的下降。随后，聚集百分比随时间逐渐上升，约在3-4分钟时达到最大值。在6分钟记录的末期，聚集百分比略有下降，反映了部分解聚现象。如图所示 图2A-B预先将人洗涤血小板与Panx1通.......

讨论

人们迫切希望找到能够调节血小板功能的新药物，以在不增加出血风险的前提下预防血栓形成。为此， 体外 可靠且可重复地监测人血小板聚集反应的实验室检测方法至关重要。比浊聚集测定法操作简便，但在实施过程中需注意若干事项。检测必须在持续搅拌条件下进行，因为聚集过程在很大程度上依赖于搅拌。同时，必须将血小板维持在37 °C的生理温度，以避免任何形式的过早活化。血小板的预活化也可能发生在血液采集和洗涤血小板制备过程中，导致自发性聚集。因此，在血小板制备的整个过程中应采取谨慎措施。

比浊法基于测定血小板悬液的光密度（OD）。由于全血中存在红细胞，该技术不适用于全血中的聚集测定。因此，比浊法仅可用于富血小板血浆（PRP）或从PRP中分离的洗涤血小板。尽管比浊法操作简便且成本较低，但已被认为对微聚集体的存在不敏感^14,15。当微聚集体被认为具有关键重要性时，阻抗聚集测定法更为适用，该方法通过测量血小板黏附于浸入枸橼酸抗凝全血样本中的电极时电阻力的变化来进行检测

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
柠檬酸一水合物（C6H8O7*H2O）	Roth	5949-29-1	对眼睛有损伤/刺激危险
三水合柠檬酸钠（Na3C6H5O7*2H2O）	Sigma-Aldrich	S1804	-
D(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	-
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	S9888	-
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P9541	-
碳酸氢钠（NaHCO3）	Sigma-Aldrich	S6014	-
一水合磷酸二氢钠（NaH2PO4*H2O）	Sigma-Aldrich	S9638	-
六水合氯化镁（MgCl2*6H2O）	Sigma-Aldrich	M9272	-
六水合氯化钙（CaCl2*6H2O）	Sigma-Aldrich	442909	对眼睛有损伤/刺激危险
N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（Hepes）	ThermoFisher Scientific	15630	-
人血清白蛋白	CSL Behring	00257/374	-
盐酸	Sigma-Aldrich	320331	对呼吸系统具有腐蚀性和刺激性。可导致严重的皮肤和眼睛损伤。
Eppendorf 5810 R	Fisher Scientific	-	-
肝素	Drosspharm AG/SA	20810
前列环素 I2（PGI2）	Cayman	18220	-
马铃薯来源的腺苷酸酶（apyrase）	Sigma-Aldrich	A6535	-
纤维蛋白原（Haemocomplettan）	CSL Behring	HS 73466011	-
血小板聚集仪 SD-Medical	SD-Innovation	TA8V	-
亮蓝FCF（赤藓蓝二钠盐）	Sigma-Aldrich	80717	对水生生物有害并具有长期持续影响（避免释放到环境中）
胶原蛋白	Horm, Nycomed		-
花生四烯酸	Bio/Data corporation	C/N 101297	-
血细胞计数仪 Sysmex KX-21N	Sysmex Digitana	-	-
HEPES	Gibco	15630-056	-
玻璃比色皿	SD-Innovation	THCV1000	-
磁力搅拌器	SD-Innovation	THA100	-