我们介绍一种从人血中分离洗涤血小板并随后通过浊度法测定激动剂诱导血小板聚集的简便方法。作为示例，我们应用该方法研究人血小板在预先孵育潘尼克斯1通道抑制剂亮蓝FCF后对胶原的聚集反应。
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摘要
摘要
比浊法是一种实验室技术，通过使用一种或多种激动剂，测定悬浮于血浆（富含血小板血浆，PRP）或缓冲液（洗涤血小板）中的血小板聚集程度。将洗涤血小板从其血浆环境中分离并去除抗凝剂后，可用于研究血小板的内在特性。在众多激动剂中，花生四烯酸（AA）、二磷酸腺苷（ADP）、凝血酶和胶原蛋白是最常使用的几种。血小板聚集反应通过在持续搅拌条件下，测定血小板悬液随时间变化的相对光密度（OD）来量化。均一悬浮状态的血小板在加入激动剂后会限制光线通过，血小板发生形态改变，导致OD短暂轻微升高。在此初始活化阶段之后，血小板逐渐形成聚集体，使光线更易通过悬液，从而导致OD降低。最终，聚集过程以百分比形式表示，参照物为贫血小板血浆或缓冲液的OD值。因此，每次实验开始前必须进行严格的校准。一般原则是：将未刺激的血小板悬液的OD值设为0%，而将不含血小板的悬液介质的OD值设为100%。血小板聚集通常以实时聚集曲线的形式呈现。比浊法是研究血小板功能最常用的实验室技术之一，被视为历史性的金标准，也被广泛用于开发旨在抑制血小板聚集的新型药物制剂。本文中，我们详细描述了以下两项实验方案：1）人源洗涤血小板的制备；2）采用比浊法分析经食用染料亮蓝FCF预处理后的人源洗涤血小板在胶原蛋白诱导下的聚集情况，该染料最近被鉴定为Pannexin1（Panx1）通道的抑制剂。
引言
血小板是血液中的重要成分，其主要功能是与凝血因子共同作用，在血管损伤后阻止出血。血小板是由骨髓中的巨核细胞产生的微小（2–3 µm）无核碎片1血小板在未活化状态下循环，此时呈透镜状结构。当血管内皮中断时，血小板会聚集至血管损伤部位以堵塞破口，此过程称为初级止血。最初，血小板黏附于因损伤而暴露的内皮下分子（如胶原和血管性血友病因子），即黏附阶段。2然后，它们改变形态并分泌化学信使——激活步骤。最后，通过桥接受体相互连接——聚集步骤。初级止血之后是继发过程，涉及凝血级联反应的激活以及纤维蛋白的沉积，从而稳定初始血栓。2.
急性缺血事件（如心肌梗死3）通常由动脉粥样硬化斑块因物理性破裂而引发血栓形成所致。目前抗血小板药物是治疗这一广泛流行疾病的基础，但其临床获益受到出血风险增加的限制。在心血管疾病患者中最常用的药物——阿司匹林和抗P2Y12化合物——分别作用于血栓素A2通路和ADP通路4，这两条通路是导致血小板活化的主要途径。然而，仍需开展创新性研究，以寻找能够理想平衡抗血栓效果与出血风险的新靶点。
自20世纪60年代5至今，比浊聚集测定法在研究中发挥了关键作用，不仅加深了我们对血小板反应性的理解，也广泛用于监测抗血栓药物在人体内的效力。最初，该方法应用于从血液样本中提取的富血小板血浆（PRP）。事实上，使用含柠檬酸盐的试管采集血液，可快速大量制备PRP，且不会影响血小板的完整性和功能。然而，PRP稳定性较差（约3小时），且残留的血浆酶（如凝血酶）以及低钙浓度可能导致聚集曲线出现人为假象，这些因素严重限制了PRP的应用。一个重要的进展是开发出一种包含额外离心和洗涤步骤的血小板分离方法6。简而言之，从酸-柠檬酸盐-葡萄糖（ACD）抗凝的全血中分离PRP，随后通过连续离心步骤分离血小板，再将其重悬于含有葡萄糖、人血清白蛋白和二价阳离子（Ca2+和Mg2+）的等渗磷酸盐缓冲液（Tyrode缓冲液）中。为避免血小板反应性改变，Tyrode缓冲液的pH值严格维持在7.35–7.4。此外，在某些离心步骤前加入前列环素（PGI2）可防止血小板发生非预期激活。最后，加入腺苷酸水解酶（apyrase）可防止洗涤后的血小板对ATP/ADP的作用产生抵抗。所得的血小板悬液不含凝血因子，其稳定性相比PRP溶液至少提高两倍。此外，血小板处于非激活但完整状态，这保证了比浊法测量结果的可重复性，并为研究血小板聚集的激动剂或拮抗剂作用提供了理想条件。
通过该方法，我们最近的一项研究表明，采用基因手段（敲除小鼠）抑制Panx1通道的形成，或通过药理学手段降低Panx1通道活性，均可减轻胶原诱导的血小板聚集7。Panx1可形成ATP释放通道，在包括人血小板在内的多种细胞类型中广泛表达7,8。事实上，我们通过人洗涤血小板的浊度测定法证实，在加入不同激动剂前，预先用一系列特异性程度不等的化学阻断剂（丙磺舒、甲氟喹和10Panx1肽）孵育7分钟，可特异性抑制胶原诱导的血小板聚集，而对花生四烯酸（AA）和二磷酸腺苷（ADP）诱导的血小板反应无影响。我们证明，ATP通过Panx1通道释放可特异性干扰GPVI信号通路，从而影响胶原诱导的聚集。有趣的是，多种已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于其他疾病的药物（如丙磺舒、甲氟喹）可影响血小板中Panx1通道的活性。一方面，这为选择性调节血小板反应性提供了新的治疗前景；另一方面，也应考虑这些化合物可能产生的继发性效应。在此背景下，被广泛用于多种糖果和能量饮料中的安全食用色素亮蓝FCF，已被报道为Panx1的特异性抑制剂9。本文描述了一种分离人洗涤血小板并采用浊度法测定血小板聚集的实验方案，适用于研究亮蓝FCF染料作为血小板聚集拮抗剂的作用。
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方案
招募了五名无亲缘关系的健康志愿者，采集血液样本用于血小板分离和聚集试验。已获得书面知情同意，且该研究方案经日内瓦大学医院中央伦理委员会批准。所有志愿者均确认身体健康，且在实验前至少10天内未服用任何影响血小板功能的药物。
1. 人血采集与洗涤血小板分离的缓冲液制备
- 通过将1.4 g柠檬酸一水合物（C6H8O7•H2O，66.6 mM）、2.5 g枸橼酸钠二水合物（Na3C6H5O7•2 H2O，85 mM）和2 g无水D(+)-葡萄糖溶解于水中，配制100 mL的酸性枸橼酸葡萄糖（ACD）溶液。该溶液的pH约为4.5。
- 按以下方法配制台氏液（Tyrode's buffer）的储备液
- 将80 g NaCl、2 g KCl、10 g NaHCO3和0.58 g NaH2PO4*H2O溶解于500 mL蒸馏H2O中，配制储备液1。各成分的终浓度分别为2.73 M、53.6 mM、238 mM和8.4 mM。将溶液保存于4 °C。
- 将10.15 g MgCl2*6 H2O（100 mM）溶解于500 mL蒸馏H2O中，配制储备液2。将溶液保存于4 °C。
- 将10.95 g CaCl2*6 H2O（100 mM）溶解于500 mL蒸馏H2O中，配制储备液3。将溶液保存于4 °C。
- 取2.5 mL储备液1，用蒸馏H2O定容至50 mL，配制台氏液。该溶液中各成分的终浓度为：136.5 mM NaCl、2.68 mM KCl、11.9 mM NaHCO3和0.42 mM NaH2PO4*H2O。用0.22-μm滤器过滤除菌，并将pH调节至7.35。
- 通过将5 mL储备液1、1 mL储备液2、2 mL储备液3、0.5 mL 1 M HEPES、1.8 mL 200 g/L人血清白蛋白和0.1 g无水D(+)-葡萄糖加入蒸馏H2O中并定容至100 mL，配制含0.35%白蛋白的台氏液（TA缓冲液7）。
- 用1 N HCl将pH调节至7.35，并通过加入蒸馏H2O（总体积的10%）将渗透压调节至295 mOsm/L。该溶液中各成分的终浓度为：124 mM NaCl、2.44 mM KCl、10.82 mM NaHCO3、0.38 mM NaH2PO4*H2O、0.91 mM MgCl2*6 H2O、1.82 mM CaCl2*6 H2O。整个实验过程中将TA缓冲液保持在37 °C。
2. 血液采集
- 使用19 G针头，从肘前静脉采集45-50 mL静脉血，注入含ACD抗凝剂的50 mL管中（每6份血液加入1份ACD抗凝剂）。弃去最初1-2 mL血液，以避免凝血酶和组织因子的存在。
- 采集后，通过轻轻倒置试管将血液与ACD混合。将样本在37 °C孵育10分钟。
3. 人洗涤血小板的制备
- 将离心机预热至 37 °C。以下所有离心步骤均在此温度下进行。
- 将采集的血液分装至15 mL离心管中（每管5 mL），于250 × g离心13分钟，以获得富血小板血浆（PRP）。
注意：此离心步骤会导致样品中形成三层：1）上层，由血浆、血小板及少量白细胞组成；2）中间层，富含白细胞；3）底层，主要由红细胞组成。 - 用移液管小心吸取上层液至新的15 mL离心管中以收集PRP，尽量避免红细胞和白细胞的污染，并在37 °C孵育10分钟。
- 将PRP在2,200 × g条件下离心12分钟（适用于5 mL PRP）。
注意：此离心步骤应以低刹车或无刹车模式进行。 - 去除上清液（血小板贫乏血浆），并用含有 2 µL/mL 肝素（5,000 U/mL）和 2.5 µL/mL 25 μM PGI 的 10 mL TA 缓冲液小心重悬沉淀。2 使用塑料巴斯德吸管。在37 °C下孵育10分钟。
- 加入2.5 µL/mL的25 μM PGI2 离心8分钟，1,900 x g（低刹车或无刹车）。
- 去除上清液，用 5 mL 含有 2.5 µL/mL 25 μM PGI 的 TA 缓冲液重悬沉淀2 使用塑料巴斯德吸管。在37 °C下孵育10分钟。
- 孵育期间，用移液器将150 µL血小板悬液转移至1.5 mL离心管中，使用自动化细胞计数仪（通过测量直流电阻变化来检测血细胞大小）进行血小板计数。
- 孵育10分钟后，加入2.5 µL/mL的25 μM PGI2 向血小板悬液中加入并立即在1,900 × g离心8分钟。
- 移除上清液，并用适量 TA 缓冲液将沉淀重悬至浓度为 250,000 血小板/µL（即 若细胞浓度为每微升500,000个，则重悬于含apyrase（终浓度0.32 U/mL，即每毫升TA缓冲液中加入0.01 U/mL的apyrase 32 µL）的10 mL TA缓冲液中。
注意：使用高浓度的apyrase以避免由ATP自发分泌引起的P2X1受体脱敏10,11 在缺乏激动剂的情况下。这一点非常重要，因为胶原诱导的反应是由活化血小板释放的ATP快速通过旁分泌/自分泌方式激活P2X1受体所介导的。如果血小板信号通路并非严格依赖P2X1功能的维持，则可使用0.02 U/mL腺苷三磷酸双磷酸酶（apyrase）。多项研究（详见Mahaut-Smith综述） 等.10) 证明0.02 U/mL的apyrase可避免ADP受体P2Y1脱敏，同时P2X1反应可忽略不计。 - 在进行聚集度测量前，将细胞悬液于37 °C孵育至少30分钟。该制备物在5至8小时内保持稳定。
4. 聚集试验
- 在Tyrode缓冲液中配制纤维蛋白原（56 mg/mL）。
- 将260 µL血小板悬液移液至玻璃比色皿中（图1A；左侧比色皿）中加入10 µL纤维蛋白原（56 mg/mL）和一根磁力搅拌棒，然后将悬浮液置于聚集仪的孵育孔中，在37 °C孵育2–3分钟图1B 和 1C).
- 用Panx1抑制剂亮蓝FCF预孵育，分别加入10 µL的2.8 mM或28 mM储存液（终浓度分别为100 μM和1 mM），在37 °C孵育7分钟。
- 使用不含血小板的TA缓冲液，加入10 µL纤维蛋白原（56 mg/mL）和10 µL亮蓝FCF（2.8 mM或28 mM），测定该比色皿的光密度，以此设定聚集仪的假设100%聚集值进行校准。
- 将比色皿放入聚集反应孔中，在自动搅拌条件下，按下与聚集仪相连的计算机键盘上的相应按钮即 如果使用聚集孔1，请按F1。
注意：以下所述实验包含亮蓝FCF。用于校准的化合物必须根据实验条件进行调整。
- 将比色皿放入聚集反应孔中，在自动搅拌条件下，按下与聚集仪相连的计算机键盘上的相应按钮即 如果使用聚集孔1，请按F1。
- 使用将用于实验的相同血小板样本，在自动搅拌条件下对聚集仪进行校准，设定其假定的0%聚集值。
- 将比色皿放入聚集反应孔中，按下连接至聚集仪的计算机键盘上的相应按钮。等待约20-30秒后再进行下一步操作。此延迟步骤旨在确保在加入激动剂前不会发生聚集反应。
注意：由于血小板数量的任何差异都可能影响测得的OD值，因此每次单独测量均需重复0%校准步骤。
- 将比色皿放入聚集反应孔中，按下连接至聚集仪的计算机键盘上的相应按钮。等待约20-30秒后再进行下一步操作。此延迟步骤旨在确保在加入激动剂前不会发生聚集反应。
- 向比色杯中加入20 µL所需激动剂，例如15 µg/mL胶原蛋白（终浓度1 µg/mL）或1.125 mM花生四烯酸（终浓度75 µM）。立即按下连接聚集仪的计算机键盘上的相应按钮，启动记录，并同时开启持续自动搅拌。
注意：加入激动剂可诱导血小板活化。实验结束时，可在玻璃比色皿中清晰观察到血小板聚集体。图1A；右侧比色皿）。 - 6分钟后记录自动停止。此时，点击计算机上的保存图标以保存数据。
注意：聚集速率的计算由计算机完成，计算机将聚集过程的最终结果以百分比形式表示。 - 分析数据。
- 有关制备洗涤血小板悬液及比浊法测定血小板聚集的详细实验方案，可参考该领域专家撰写的其他文献12,13.
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结果
血小板聚集仪软件会自动生成聚集曲线，并提供以百分比表示的最大聚集率数值。这些数值可复制到数据分析软件中，用于统计分析，并以柱状图形式展示最大聚集率。此外，也可选择将聚集曲线上各个数据点依次导出至电子表格软件，再导入统计软件中进行分析。例如 使用 GraphPad 绘制曲线图以直观显示曲线。一些研究者利用聚集曲线的最大斜率来计算反应速度，并通过计算曲线下面积来评估血小板活性。延迟时间（lag time）和形态变化也可通过图形直观呈现。
在对照条件下洗涤后人血小板聚集曲线的典型示例（H2O）如图所示 图2A加入激动剂（胶原）后，血小板发生形态改变，导致聚集曲线出现短暂延迟后的下降。随后，聚集百分比随时间逐渐上升，约在3-4分钟时达到最大值。在6分钟记录的末期，聚集百分比略有下降，反映了部分解聚现象。如图所示 图2A-B预先将人洗涤血小板与Panx1通...
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讨论
人们迫切希望找到能够调节血小板功能的新药物，以在不增加出血风险的前提下预防血栓形成。为此， 体外 可靠且可重复地监测人血小板聚集反应的实验室检测方法至关重要。比浊聚集测定法操作简便，但在实施过程中需注意若干事项。检测必须在持续搅拌条件下进行，因为聚集过程在很大程度上依赖于搅拌。同时，必须将血小板维持在37 °C的生理温度，以避免任何形式的过早活化。血小板的预活化也可能发生在血液采集和洗涤血小板制备过程中，导致自发性聚集。因此，在血小板制备的整个过程中应采取谨慎措施。
比浊法基于测定血小板悬液的光密度（OD）。由于全血中存在红细胞，该技术不适用于全血中的聚集测定。因此，比浊法仅可用于富血小板血浆（PRP）或从PRP中分离的洗涤血小板。尽管比浊法操作简便且成本较低，但已被认为对微聚集体的存在不敏感14,15。当微聚集体被认为具有关键重要性时，阻抗聚集测定法更为适用，该方法通过测量血小板黏附于浸入枸橼酸抗凝全血样本中的电极时电阻力的变化来进行检测
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了瑞士国家科学基金会（资助号：310030_162579/1，授予Brenda Renata Kwak；资助号：320030_144150，授予Pierre Fontana）以及瑞士心脏基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 柠檬酸一水合物（C6H8O7*H2O） | Roth | 5949-29-1 | 对眼睛有损伤/刺激危险 |
| 三水合柠檬酸钠（Na3C6H5O7*2H2O） | Sigma-Aldrich | S1804 | - |
| D(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S9888 | - |
| 氯化钾（KCl） | Sigma-Aldrich | P9541 | - |
| 碳酸氢钠（NaHCO3） | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
| 一水合磷酸二氢钠（NaH2PO4*H2O） | Sigma-Aldrich | S9638 | - |
| 六水合氯化镁（MgCl2*6H2O） | Sigma-Aldrich | M9272 | - |
| 六水合氯化钙（CaCl2*6H2O） | Sigma-Aldrich | 442909 | 对眼睛有损伤/刺激危险 |
| N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（Hepes） | ThermoFisher Scientific | 15630 | - |
| 人血清白蛋白 | CSL Behring | 00257/374 | - |
| 盐酸 | Sigma-Aldrich | 320331 | 对呼吸系统具有腐蚀性和刺激性。可导致严重的皮肤和眼睛损伤。 |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
| 肝素 | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| 前列环素 I2（PGI2） | Cayman | 18220 | - |
| 马铃薯来源的腺苷酸酶（apyrase） | Sigma-Aldrich | A6535 | - |
| 纤维蛋白原（Haemocomplettan） | CSL Behring | HS 73466011 | - |
| 血小板聚集仪 SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | - |
| 亮蓝FCF（赤藓蓝二钠盐） | Sigma-Aldrich | 80717 | 对水生生物有害并具有长期持续影响（避免释放到环境中） |
| 胶原蛋白 | Horm, Nycomed | - | |
| 花生四烯酸 | Bio/Data corporation | C/N 101297 | - |
| 血细胞计数仪 Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | - |
| 玻璃比色皿 | SD-Innovation | THCV1000 | - |
| 磁力搅拌器 | SD-Innovation | THA100 | - |
参考文献
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E. Platelet aggregation: turbidimetric measurements. Methods Mol Biol. 272, 65-76 (2004).
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L. 3rd, et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ? FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
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