适用于下一代测序的植物细胞器DNA富集方法的优化与比较分析

Marisa E. Miller; Katie L. Liberatore; Shahryar F. Kianian

doi:10.3791/55528

方法文章

适用于下一代测序的植物细胞器DNA富集方法的优化与比较分析

DOI：

10.3791/55528

⸱

2017年7月28日

Marisa E. Miller^*¹^,² , Katie L. Liberatore^*¹^,³ , Shahryar F. Kianian¹^,³

¹Cereal Disease Laboratory, United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service, ²Department of Horticultural Science, University of Minnesota, ³Department of Plant Pathology, University of Minnesota

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了两种植物细胞器DNA富集方法的比较与优化：传统的差速离心法，以及基于甲基化状态对总基因组DNA进行分馏的方法。我们评估了所获得DNA的数量和质量，展示了其在短读长的下一代测序中的表现，并讨论了其在长读长单分子测序中的应用潜力。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

植物细胞器基因组包含大量重复元件，这些元件可能发生配对或重组，形成复杂的结构和/或亚基因组片段。细胞器基因组在同一细胞或组织类型中也以混合形式存在（异质性），且在发育过程或受到胁迫时，不同亚型的丰度可能发生改变（亚化学计量漂移）。要深入理解细胞器基因组的结构与功能，需要借助新一代测序（NGS）技术。传统的测序研究采用多种方法获取细胞器DNA：（1）若使用大量起始组织，则将其均质化后进行差速离心和/或梯度纯化；（2）若使用较少组织量（即，若种子、材料或空间有限，则采用与（1）相同的方法，随后进行全基因组扩增以获得足够的DNA。（3）可利用生物信息学分析对总基因组DNA进行测序，并分离出细胞器来源的读段。上述所有方法均存在固有的挑战与权衡。在方法（1）中，可能难以获取足量的起始组织；在方法（2）中，全基因组扩增可能引入测序偏差；而在方法（3）中，核基因组与细胞器基因组之间的同源性可能干扰序列组装与分析。在核基因组较大的植物中，富集细胞器DNA有助于降低测序成本，并减少生物信息学分析中的序列复杂性。本文比较了一种传统的差速离心法与第四种方法——改良的CpG甲基化富集法，用于将总基因组DNA分离为核与细胞器组分。两种方法均可获得适用于下一代测序（NGS）的DNA，且所得DNA均高度富集细胞器序列，但在线粒体与叶绿体间的富集比例有所不同。本文展示了这两种方法在小麦叶片组织中的优化过程，并结合样本投入量、操作难易程度及下游应用等方面，讨论了各自的主要优缺点。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基因组测序是解析重要植物性状遗传基础的有力工具。大多数基因组测序研究集中于细胞核基因组，因为大部分基因位于细胞核内。然而，细胞器基因组，包括线粒体（存在于真核生物中）和质体（存在于植物中；其特化形式叶绿体参与光合作用），也提供了对生物体发育、应激反应及整体适应性至关重要的遗传信息¹细胞器基因组通常包含在旨在进行核基因组测序的总DNA提取物中，尽管也有在DNA提取前采用减少细胞器数量的方法。²许多研究利用全基因组DNA提取物的测序结果来组装细胞器基因组³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷然而，当研究目标聚焦于细胞器基因组时，使用总基因组DNA会增加测序成本，因为会产生大量非目标区域的读长 "丢失" 与核DNA序列相比，尤其在核基因组较大的植物中，由于细胞器序列在核基因组中的复制和插入，以及细胞器之间的序列转移，将测序读长准确比对到正确的基因组位置在生物信息学分析上具有挑战性。²^,⁸将细胞器基因组从核基因组中纯化是减少这些问题的一种策略。此外，可采用进一步的生物信息学方法来区分比对到线粒体与叶绿体同源区域的测序读段。

尽管许多植物物种的细胞器基因组已被测序，但关于野生种群或栽培育种群体中细胞器基因组多样性的广度仍知之甚少。细胞器基因组也被认为是动态分子，会因重复序列之间的重组而发生显著的结构重排⁹。此外，每个细胞器中含有多个细胞器基因组拷贝，而每个细胞中又含有多个细胞器。这些基因组拷贝并非完全相同，这种现象被称为异质性（heteroplasmy）。与传统的“主环”（"master circles"）模型不同，目前越来越多的证据支持细胞器基因组结构具有更复杂的形态，包括亚基因组环状结构、线性染色体、线性串联多聚体以及分支结构¹⁰。植物细胞器基因组的组装还因其相对较大的基因组尺寸以及大量存在的反向重复和正向重复序列而变得更加复杂。

传统的细胞器分离、DNA纯化及后续基因组测序方案通常繁琐且需要大量起始组织，往往需要数克乃至数百克的幼嫩叶片组织作为起始材料¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷。这使得在组织样本有限的情况下难以开展细胞器基因组测序。在某些情况下，种子数量有限，例如需要按世代进行测序，或必须通过杂交维持的雄性不育系。在这些情况下，可对细胞器DNA进行纯化后再进行全基因组扩增。然而，全基因组扩增可能引入显著的测序偏差，这在评估结构变异、亚基因组结构以及异质性水平时尤为突出¹⁸。近年来，短读长测序技术的文库制备方法取得了进展，已克服了低起始量的限制，从而避免了全基因组扩增。例如，Illumina Nextera XT文库制备试剂盒仅需低至1 ng的DNA即可作为起始材料¹⁹。然而，针对PacBio或Oxford Nanopore等长读长测序技术的标准文库制备方法仍需要相对较高的DNA起始量，这对细胞器基因组测序构成了挑战。近期，研究人员开发出新的自制长读长测序方案，以降低起始量需求，有助于在难以获得微克级DNA的样本中实现基因组测序²⁰^,²¹。然而，获得高分子量且纯净的细胞器组分以用于这些文库制备仍是当前面临的主要难题。

我们旨在比较并优化适用于下一代测序（NGS）的细胞器DNA富集与分离方法，且无需进行全基因组扩增。具体而言，我们的目标是确定从有限起始材料（例如叶片的子样本）中富集高分子量细胞器DNA的最佳实验方案。本研究对两种细胞器DNA富集方法进行了比较分析：（1）一种改良的传统差速离心法，与（2）基于 commercially available DNA CpG-甲基结合结构域蛋白下拉技术的DNA组分分离法²²，后者应用于植物组织²³。我们推荐了从小麦叶片组织中分离细胞器DNA的最佳实践方案，该方案可便捷地推广至其他植物及组织类型。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 器官分离和DNA提取用植物材料的制备

小麦幼苗的标准培养
1. 将种子种植于蛭石中，使用小型方形容器，每个角落播种4 - 6粒。转移至温室或人工气候室，设置16小时光照周期，白天温度23 ºC，夜间18 ºC。
2. 每天浇水一次。在种子萌发时及萌发后7天，每盆施用¼茶匙颗粒状20-20-20 N-P-K肥料。
小麦幼苗的替代性黄化培养
1. 按照步骤1.1操作，但将花盆置于黑暗的人工气候室中，23 °C维持16小时，18 ºC维持8小时。或者，将温室中的植株遮光处理（例如，使用储物箱覆盖；但必须保持适当通风）。
植株培养与组织采集
1. 培养植株12 - 14天。对于大多数小麦基因型，75 - 100株幼苗可获得约10 - 12 g组织，足以进行两次采用差速离心法的细胞器提取（第2节）；若采用基于DNA CpG甲基化的下拉法分离细胞器DNA与核DNA（第3节），则仅需一株植物即可。
2. 若采用差速离心法，应采集新鲜组织并立即进入样品处理流程，具体操作见第2节。
3. 若采用CpG甲基化下拉法，将20 mg幼叶组织切段收集至微量离心管中（可使用标准培养或黄化处理的组织，参见代表性结果）。用液氮速冻后于-80 ºC保存直至使用。随后按照第3节所述进行DNA的下拉分离。

2. 方法一：使用差速离心法（DC）提取DNA

注意：差速离心方案经修改自两篇文献，这些文献优化了条件以分离两种细胞器但富集线粒体¹⁷^,²⁴。改进后的方案比之前的方法耗时更短，且使用的有毒化学试剂更少。具体而言，我们对缓冲液和洗涤步骤进行了修改，包括在STE提取缓冲液中添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP），并取消了含氟化钠（NaF）的NETF缓冲液的最后洗涤步骤。

注意：由于STE缓冲液含有2-巯基乙醇（BME），其配制和使用应在化学通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。

开始前的准备工作
1. 确保所有设备极为洁净，并对可高压灭菌的设备进行高压灭菌处理（例如， 研磨管、高速离心管 等等。).
  注意：所有需要移液的操作步骤均建议使用滤芯吸头，以避免交叉污染。
2. 参见所需仪器和试剂清单，并为方法#1准备所需的缓冲液和工作液表1将冷冻研磨块冷却至 -20 ºC，转子和缓冲液置于 4 ºC，设置微量离心机温度为 4 ºC，并开启 37 ºC 水浴。
细胞器的分离
1. 在冰上预冷的烧杯中，用冰冷的无菌水冲洗5 g新鲜组织。
  注意：所有操作及在离心机、通风橱之间的样品转移过程中，务必始终将样品置于冰上。 等等。 或者，如果有足够的空间和设备，可在低温室中操作。
2. 使用剪刀将叶片组织直接剪成约1 cm的碎片，放入含有两个陶瓷研磨珠的50 mL离心管中。
  注意：在处理不同样本之间应清洁或更换剪刀，以避免交叉污染。
3. 若无组织匀浆器，可使用研钵和研杵，并按以下步骤替换步骤 2.2.4 - 2.2.9。
  1. 将叶片组织在冰上置于预冷的研钵中切碎。在通风橱中，加入15 mL STE缓冲液，研磨样品2–3分钟。
  2. 通过装有一层预湿润的无菌过滤布（孔径约22–25 µm；详见主方案）的漏斗，将缓冲液倒入另一支50 mL离心管中（组织留在研钵中）。向研钵中再加入10 mL STE溶液，再次进行匀浆。
  3. 将匀浆后的组织和缓冲液倒入同一个漏斗中。用10 mL STE冲洗研钵和研杵，并将冲洗液倒入漏斗中。挤压并拧干滤布，使液体尽可能全部进入漏斗中。
    注意：在处理不同样本之间需更换手套，以避免交叉污染。继续执行步骤 2.2.10 的实验方案。
4. 在通风橱中，向每个50 mL离心管中加入20 mL STE。
5. 将样品放入组织研磨仪中预冷的低温研磨块内，在1,750 rpm条件下研磨2次，每次30秒。每次研磨之间旋转样品位置，并将样品置于冰上约1分钟。
  注意：此步骤可使用研钵和研杵、匀浆机或其他组织研磨/均质化设备。然而，不同方法对所得 DNA 质量的影响程度不同，因此在进行后续实验前，应评估 DNA 长度和质量。
6. 将一个漏斗插入置于冰上的洁净50 mL离心管中。在漏斗中放入一层滤布，并用5 mL STE溶液预润湿。不要丢弃滤过液。
7. 将匀浆后的组织倒入漏斗中。用15 mL STE缓冲液冲洗研磨管，盖上盖子后倒置试管以冲洗管壁和管盖，然后倒入漏斗中。
8. 小心取出陶瓷石，然后将过滤布在漏斗中挤干并拧干。
  注意：在处理不同样品之间应更换手套，以避免交叉污染。
9. 用封口膜包裹管盖以防止泄漏。在4 ºC条件下以2,000 x g离心10分钟。
10. 使用血清移液管小心吸出上清液（避免扰动沉淀），转移至50 mL高速离心管中（若离心管无紧密密封垫圈，需用Parafilm封口膜包裹管盖以防泄漏）。弃去沉淀。
11. 使用STE将离心管平衡至0.1 g以内，然后在4 ºC、18,000 x g条件下离心所得上清液20分钟。为平衡离心管，可将装有冰块的小烧杯置于天平上，归零后在冰上称量样品以保持低温；或者，在低温室内使用天平和通风橱进行操作。
12. 弃去上清液。向沉淀中加入1 mL ST，用软毛刷轻轻重悬。再加入24 mL ST（终体积为25 mL），混匀或轻轻摇晃。即，将画笔在管壁上轻压，以去除所有液体。
13. 使用ST平衡试管，使重量差异在0.1 g以内。在4 ºC、18,000 x g条件下离心20分钟。同时，配制DNase I溶液（见表1 用于储备液和工作液的配制）。每个样品在1.5 mL离心管中分装成一份200 µL的等分试样。
14. 弃去上清液，用吸水纸轻拍管壁，然后使用软毛刷将沉淀（仍位于高速离心管中）重悬于 300 µL ST 溶液中。将毛刷放入先前准备好的含有 200 µL DNaseI 溶液的 1.5 mL 离心管中，轻轻旋转毛刷以去除刷毛上残留的沉淀。用移液器将 DNaseI 溶液吸回高速离心管中，轻轻旋转混匀。
15. 37 °C 水浴中孵育 30 分钟（用封口膜包裹管口顶部，防止冷凝水渗入管盖）。孵育期间轻柔振荡混匀 2 次。
16. 使用带有宽口的移液枪头，轻轻将沉淀混合物从管中移出，放入一个1.5 mL低吸附离心管中。向高速离心管中加入500 µL 400 mM EDTA（pH 8.0），轻轻吹打以充分回收残留沉淀。将EDTA溶液转移至含有沉淀混合物的同一1.5 mL低吸附离心管中，轻轻颠倒混匀。
17. 在 4 ºC 条件下以 18,000 x g 离心 20 分钟。弃去上清液，吸干管壁，立即用于 DNA 提取。如有必要，可将沉淀在 -20 ºC 冻存，但若未立即处理，残留的 DNaseI 可能降解样品 DNA，导致得率降低。
使用商业柱式方法从分离的细胞器中提取DNA
注意：完整实验步骤请参见试剂盒手册²⁵，并参见下文的修改建议。建议直接从细胞器分离步骤进入DNA提取步骤。反复冻融会减小DNA片段大小，并因残留的DNase I导致DNA降解。避免剧烈涡旋或用力移液，以免剪切DNA。推荐使用低吸附微量离心管，以最大化DNA回收率。
1. DNA 提取步骤
  注意：请阅读详细的商业试剂盒说明书²⁵ 在开始之前，确保缓冲液已正确配制和保存，并且已理解离心柱操作步骤。
  1. 将180 µL缓冲液ATL直接加入含有沉淀的离心管中（若此前冷冻保存，需先解冻并在室温下平衡）。
  2. 继续进行方案中的第 3 步 "组织中的DNA纯化" 根据试剂盒说明书进行操作，但作以下修改：第3步裂解时间为30分钟，包含可选的RNase A消化步骤，并用3次200 µL AE缓冲液洗脱（每次洗脱至独立离心管中，随后合并洗脱液）。
  3. 保存一份等分试样（至少 20 µL）用于 qPCR（见步骤 4.1）。若需在浓缩前进行定量，额外保存 1 µL 用于高灵敏度定量。
  4. 如有需要，可进行样品浓缩。
使用商用滤膜装置进行样品浓缩
注意：参见商业试剂盒说明书²⁶ 有关更多详细信息。根据后续应用，可能无需进行样品浓缩（例如， 用于终点PCR和qPCR应用）。然而，对于NGS文库构建，可能需要浓缩DNA提取后获得的稀释的细胞器DNA。
1. 浓缩柱操作步骤
  1. 仔细预称重（参见表2将空的滤器单元（不带管）置于数字分析天平上一张洁净的称量纸上，记录重量。
  2. 将合并的洗脱液用移液器转移至滤膜装置中，再次仔细称重。
    注意：商业手动操作²⁶ 说明书指出滤过单元的最大容积为500 µL，但一次性加入多达575 µL液体亦不会发生溢出。
  3. 将装有样品的滤过装置小心放入随柱提供的离心管中。在500 × g离心指定时间，以获得所需的浓缩体积。对于约575 µL的样品体积，通常离心20分钟可得到15–30 µL的浓缩体积。
  4. 从离心管中取出滤膜单元并再次称重。根据表格判断是否已达到目标浓缩体积。若未达到，以500 × g再次离心较短时间后称重；重复此步骤直至达到目标浓缩体积。
  5. 将一个新离心管（随柱提供）置于滤器单元顶部并倒置。在1,000 × g条件下离心3分钟，以将浓缩液转移至离心管中。
  6. 确定回收体积。由于滤膜滞留作用，回收体积通常比计算体积少约 3 - 5 µL。若浓度过高，可用无菌水或 TE 缓冲液稀释至目标体积。
  7. 使用高灵敏度定量法（按照制造商说明书）对DNA进行定量。

3. 方法二：甲基化分馏（MF）法从总基因组DNA中富集细胞器DNA

注意：本方案改编自一种用户开发的植物与真菌基因组提取试剂盒 DNA 提取方案²⁷，以及商用微生物组 DNA 富集试剂盒方案²⁸。理论上，任何能够获得高分子量 DNA 的 DNA 分离方案均可用于下拉实验。对于短读长测序，提取产物中主要含有 >15 kb 的片段即可满足下拉实验需求。而对于长读长测序，则可能需要更大的片段。因此，我们对该方案进行了优化，以获得高分子量 DNA。

总DNA的提取
注意：请参阅所需设备和试剂清单，并为方法#2（表1）配制所需的缓冲液和工作液。向裂解缓冲液母液中加入溶菌酶，配制成裂解缓冲液工作液。打开恒温混匀仪并设定温度为37 °C。打开水浴锅并设定温度为50 °C，将QF缓冲液放入水浴中。将70%乙醇放入冰箱冷冻室预冷，并将微量离心机设定为4 °C。
1. 使用商业化DNA提取柱进行总DNA提取
  注意：开始前，请阅读商业试剂盒说明书²⁹，了解重力流阴离子交换柱使用的详细信息。可使用专用支架安装柱子，或利用提供的塑料环将柱子置于收集管上方。所有步骤（包括基因组DNA结合步骤）均应依靠重力自然流过，切勿强行压出残留液体。
  1. 使用专为2 mL管设计的手持研磨杵，在2 mL低吸附离心管中将20 mg冷冻组织于液氮中充分研磨。
  2. 加入2 mL裂解缓冲液工作液（此时管内液体接近满容积）。
  3. 在恒温混匀仪中37 °C孵育1小时，同时以300 rpm轻柔振荡。若无恒温混匀仪，可将样品置于加热金属块上，每15分钟轻轻弹动混匀一次，作为替代方案。
  4. 加入4 µL RNase A（100 mg/mL，终浓度为200 µg/mL），颠倒混匀后，在恒温混匀仪中37 °C孵育30分钟，同时以300 rpm轻柔振荡。
  5. 加入80 µL蛋白酶K（20 mg/mL，终浓度为0.8 mg/mL），颠倒混匀后，在恒温混匀仪中50 °C孵育2小时，同时以300 rpm轻柔振荡。
  6. 在4 °C、15,000 x g条件下离心20分钟，沉淀不溶性残渣。
  7. 在样品离心过程中，用1 mL Buffer QBT对提取柱进行平衡处理，并让液体自然流尽。
  8. 使用宽口移液枪头迅速将上清液（避免吸取沉淀）转移至已平衡的提取柱中，使其完全流过柱体。若样品变浑浊，应在上柱前重新过滤或再次离心（详见商业试剂盒说明书²⁹）。
  9. 待样品完全进入树脂后，用4 × 1 mL Buffer QC洗涤柱子。
  10. 将柱子置于洁净的2 mL低吸附微量离心管上方。用0.8 mL预热至50 °C的Buffer QF洗脱基因组DNA。
  11. 向洗脱液中加入0.56 mL（相当于洗脱缓冲液体积的0.7倍）室温异丙醇，沉淀DNA。
  12. 颠倒混匀（10次），立即在4 °C、15,000 x g条件下离心20分钟。小心移除上清液，避免扰动玻璃状且松散附着的DNA沉淀。
  13. 用1 mL预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀。在4 °C、15,000 x g条件下离心10分钟。
  14. 小心移除上清液（此步骤也需谨慎操作），避免扰动沉淀。室温下空气干燥5–10分钟，然后将DNA重悬于0.1 mL洗脱缓冲液（EB）中。在室温下过夜溶解DNA。避免使用移液操作，以防剪切DNA。
  15. 使用高灵敏度DNA定量检测方法（按照制造商说明书）对样品进行定量。
基于磁珠的甲基化与非甲基化DNA分馏
注意：最近一项研究报道，利用一种市售试剂盒²⁸，通过CpG位点特异性的甲基结合结构域蛋白（MBD2-Fc蛋白）与人IgG Fc片段融合的下拉技术，可实现植物细胞器基因组（非甲基化）与核基因组（高度甲基化）的分离²³。此前尚未在小麦样品中测试该商业化MF试剂盒²⁸的分馏效率。
1. 实验开始前的准备工作
  1. 新鲜配制80%乙醇（每反应至少800 µL）。将5×结合/洗涤缓冲液置于冰上解冻，并为每个样品准备5 mL的1×缓冲液（用无菌、无核酸酶的水稀释5×缓冲液，并在实验过程中保持冰上放置）。
2. 制备MBD2-Fc蛋白结合的磁珠
  1. 根据需要准备相应数量的磁珠。每个反应使用1–2 µg总输入DNA，对应需使用160–320 µL磁珠。注意：以下反应体系基于1 µg总输入DNA设计，因此需要160 µL磁珠。请根据实际需求按比例调整反应体系。
  2. 使用宽口枪头，轻柔地反复吹吸Protein A磁珠悬液，使其形成均匀悬浮液。或者，可在4 °C下轻轻旋转磁珠管15分钟。
    注意：切勿涡旋震荡磁珠。
  3. 按照制造商说明书²⁸进行后续操作。
3. 捕获甲基化的核DNA
  1. 对每个样品，向含有160 µL MBD2-Fc结合磁珠的离心管中加入1 µg输入DNA。
  2. 根据输入DNA体积，加入适量5×结合/洗涤缓冲液，使终浓度为1×（需加入的5×缓冲液体积（µL）= 输入DNA体积（µL）/ 4）。使用宽口枪头上下吹吸数次以充分混匀。
  3. 室温下旋转孵育15分钟。孵育过程中，使用宽口枪头轻柔吹吸样品，并弹动管体2–3次，防止磁珠聚集。
    注意：吹吸和弹动操作对于确保甲基化DNA的有效下拉至关重要。
4. 收集富集的非甲基化细胞器DNA
  1. 短暂离心含有DNA与MBD2-Fc结合磁珠混合物的离心管。将管子置于磁力架上至少5分钟，使磁珠吸附至管壁一侧。此时上清液应变得澄清。
  2. 使用宽口枪头小心移取上清液，避免扰动磁珠。将上清液（含非甲基化、富集细胞器DNA）转移至洁净的低吸附2 mL微量离心管中。可将此样品储存于-20 °C或-80 °C，或直接进入步骤3.2.6进行纯化。
5. 从MBD2-Fc结合磁珠中洗脱捕获的核DNA
  1. 若也需要获取核组分，请参照制造商说明书²⁸，从MBD2-Fc结合磁珠中洗脱核DNA，并按步骤3.2.7所述进行纯化。
6. 基于磁珠的核酸纯化
  1. 确保纯化磁珠处于室温且已充分混匀。按照MF试剂盒说明书²⁸中的操作流程进行。
    注意：该样品现可用于NGS文库构建或其他下游分析。

4. 样品定量与质量控制

通过qPCR检测评估细胞器富集程度
注意：此处列出的qPCR反应和检测参数是为Roche LightCycler 480设计的，若使用不同的仪器或试剂，可能需要进行调整。如果无法进行qPCR，可采用终点PCR结合琼脂糖凝胶电泳进行定性评估样本纯度，引物及反应条件与本文所述相同。所有引物组的扩增产物大小均约为150 bp。参见表3 引物序列及配对信息。
1. qPCR 反应体系配制
  1. 配置单个20 µL qPCR反应体系时，小心吸取以下组分加入96孔qPCR板的一个孔中：10 µL 2x SYBR Green I Master；2 µL 10 µM正向和反向引物混合液（终浓度为0.5 µM）；2 µL模板（在标准曲线范围内）；以及6 µL无菌、无核酸酶的H₂O。₂O. 为减少移液误差，建议配制包含除模板外所有反应组分的预混液。将预混液加入qPCR板后，再向各孔中加入相应的模板。每个样本应设置三个技术重复，以尽量降低移液误差的影响。
    注意：最终将比较样品间核基因与细胞器基因定量循环次数的比值，因此浓度上的微小差异可以接受。但DNA浓度应大致处于相近范围内。
  2. 使用高质量的qPCR封板膜密封板孔。轻轻涡旋混匀样品，注意避免产生气泡。在4 °C下短暂离心2分钟，以收集样品并消除任何微小气泡。
  3. 将酶标板放入仪器中，按照下方列出的指南运行qPCR程序。
2. qPCR 反应参数
  注意：除扩增阶段的退火循环参数外，以上均为默认参数。若所用引物与本方案中提供的引物不同，需调整该设置以适应特定引物。
  1. 95 °C 预孵育 5 分钟，升降温速率为 4.4 °C/s。
  2. 进行45个扩增循环：（1）95 °C 变性10 s，升降温速率为4.4 °C/s；（2）60 °C 退火20 s，升降温速率为2.2 °C/s；（3）72 °C 延伸10 s，升降温速率为4.4 °C/s（数据在步骤（3）期间采集）。
  3. 使用可选的熔解曲线程序：95 °C 保持 5 s，升温速率为 4.4 °C/s；65 °C 保持 1 min，升温速率为 2.2 °C/s；然后升至 97 °C，采用连续采集模式。
  4. 使用40 °C、30秒的降温循环，升温速率为1.5 °C/s。
3. 检测参数
  1. 选择SYBR模板。通过“实验”按钮检查程序参数。加载反应板后即可开始检测，且可在检测运行过程中调整设置。
  2. 使用样本编辑器分配样本。选择“绝对定量”作为工作流程，并将样本指定为未知样本、标准品或阴性对照。指定重复组，并填写每组重复中第一个样本的名称。为标准品添加浓度及单位。
  3. 设置用于分析的子集；这些子集在子集编辑器中进行分配。
  4. 用于分析时，选择“绝对定量/二阶导数最大值” "创建新分析" 列表。导入外部保存的标准曲线（如适用），然后点击计算；报告将包含所选信息。
  5. 为了准确进行绝对定量以确定拷贝数或浓度，应使用能够代表待测样本的标准曲线（例如， 细胞器DNA（通过上述方法分离得到）。由于制备标准曲线所需的线粒体DNA量远超合理组织用量所能获得的数量，因此不应采用软件提供的拷贝数计算结果，而应通过分析交叉点（Cp）值来确定样本中细胞器DNA相对于核DNA的富集程度。将这些相对含量与总基因组DNA的结果进行比较（参见 代表性结果）。在完全光照条件下生长的两周大小麦幼苗的总基因组DNA的五个1:10梯度稀释样本上检测引物效率（代表性效率数据见图注图2).
脉冲场凝胶电泳（PFGE）
注意：本方案基于制造商指南，用于进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）以分离高分子量DNA。参见 材料表
1. 制备凝胶和样品
  1. 根据现有系统，遵循凝胶和样品制备的指导原则并进行相应调整。
2. 运行参数
  1. 按照电泳系统的设置指南操作，并使用以下参数：初始切换时间为 2 s，最终切换时间为 13 s，运行时间为 15 小时 16 分钟，电压为 6 V/cm，夹角为 120°。
3. 染色并成像凝胶
  1. 使用选择的染料对凝胶进行染色（例如， 溴化乙锭或合适的替代染料染色，并使用合适的凝胶成像系统进行成像。
NGS 及分析
1. 按照制造商说明书，使用1 ng DNA作为DNA文库制备试剂盒的起始量。
2. 条形码标记样本并将样本混合，于单次运行中进行测序。依照制造商指南执行测序。
  注意：合并样本和测序参数可根据目标物种、所需的覆盖深度以及用于测序文库的测序平台进行调整。例如，HiSeq 测序通道的产出远高于 MiSeq 测序通道，因此可实现更多样本的多重测序。建议先对少量样本进行测序，以评估细胞器基因组的覆盖深度是否足以满足后续分析需求。
3. 使用 FastQC 检查读段质量³¹ 以确定数据所需的修剪和过滤程度。
4. 使用 Trimmomatic 对原始测序数据进行修剪和过滤³² 或其它类似程序。使用以下参数：ILLUMINACLIP 2:30:10（用于去除接头序列），LEADING 3，TRAILING 3，SLIDINGWINDOW 4:10，以及 MINLEN 100。
5. 将经过质量过滤和接头修剪的成对末端（PE）序列比对至中国春线粒体基因组（NCBI参考序列 NC_007579.1）³³），叶绿体（NCBI 参考序列 NC_002762.1）³⁴，以及细胞核³⁵ 使用Bowtie2比对参考基因组³⁶，设置如下：-I 0 -X 800 --sensitive。
6. 将 sam 比对文件转换为 bam 格式（samtools），并对 bam 文件进行排序。利用 bam 文件通过 bedtools 计算全基因组覆盖度及每个碱基的覆盖度。使用 R 语言的绘图函数对结果进行可视化。

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结果

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本文所述方案介绍了两种从植物组织中富集细胞器DNA的不同方法。此处提供的条件是针对小麦组织优化的结果。图1描述了两种方案中关键步骤、所需起始组织量及DNA产出量的比较。我们测试的差速离心（DC）方案步骤与先前报道的方法类似（图1A）。采集的组织必须新鲜处理，并通过差速离心和/或密度梯度法分离完整的细胞器。在裂解细胞器之前，先去除核DNA，最后提取DNA并用于下游应用。相比之下，在甲基化过滤（MF）方案中，植物组织可在采集后储存再使用，且无需获得完整细胞器。该方法基于DNA的甲基化状态，从总基因组DNA中分离核DNA与细胞器DNA。两种方案获得的细胞器DNA总量大致相当（图1C）。就单位组织输入所获得的总细胞器DNA产量而言，当组织样本有限时，MF方案更具优势，因其可仅使用单株植物的小量样品，同时允许该植株继续生长以供后续分析。通常情况下，DC方案需要多株幼苗的全部地上部分组织，且这些植株在取样后...

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讨论

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迄今为止，大多数细胞器测序研究都集中在传统的差速离心（DC）方法上，以富集特定DNA。已有多种用于从不同植物中分离细胞器的方法被报道，包括苔藓⁴⁰；单子叶植物如小麦¹⁵和燕麦¹¹；以及双子叶植物如拟南芥¹¹、向日葵¹⁷和油菜¹⁴。大多数实验方案主要针对叶片组织¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷，其中一些方法已被适配用于多种组织类型，包括种子¹¹。从原生质体中分离细胞器的方法也已有报道

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披露

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作者声明不存在任何竞争利益。

本出版物中提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之目的，并不意味着美国农业部的推荐或认可。美国农业部为平等机会提供者和雇主。

致谢

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我们感谢美国农业部农业研究局和美国国家科学基金会（IOS 1025881 和 IOS 1361554）提供的经费支持。感谢 R. Caspers 在温室维护和植物养护方面的工作。同时感谢明尼苏达大学基因组中心，Illumina 文库构建和测序工作在该中心完成。我们还感谢期刊编辑和四位匿名审稿人提出的宝贵意见，这些意见进一步完善了我们的稿件。此外，我们感谢经济合作与发展组织（OECD）为 SK 提供的奖学金，以支持其将这些实验方案应用于与日本同事的协作项目中。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇（β-巯基乙醇；BME）	Sigma Aldrich	M3148-100ml
2-丙醇（异丙醇），生物级试剂	Sigma Aldrich	I9516
琼脂糖，Bio-Rad 认证 Megabase 琼脂糖	Bio-Rad	1613108
分析天平	Mettler Toledo	AB54-S
天平	Mettler Toledo	PB1502-S
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma Aldrich	B4287-25G
陶瓷研磨柱，3/8 英寸 × 7/8 英寸	SPEX SamplePrep	2183
适用于组织匀浆器的低温块，用于固定 50 mL 管	SPEX SamplePrep	2664
DNase I	Sigma	DN25
无水乙醇	Decon Laboratories	2716
乙二胺四乙酸（EDTA），0.5 M 溶液，pH 8.0	Fisher	BP2482-500
凝胶成像系统
凝胶染色剂			例如 GelRed 或溴化乙锭
研磨杵，适用于 2 mL 圆底管的宽头型号
盐酸胍，8 M 溶液	ThermoFisher	24115
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001
液氮
来自哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的溶壁酶	Sigma	L1412
氯化镁	G Bioscience	24115
磁力架	ThermoFisher	A13346
微量离心管，LoBind 1.5 mL	Eppendorf	22431021
微量离心管，标准无核酸酶 1.5 mL	Eppendorf
制冷微量离心机	Sorvall	Legend X1R	或同等产品，必须能够达到至少 18,000 × g 的离心力，并配备适用于 50 mL 管、Oak Ridge 管和 1.5 mL 管的转子
常温微量离心机	Eppendorf	5424	或同等产品，必须能够达到至少 18,000 × g 的离心力，并配备适用于 1.5 mL 和 2 mL 微量离心管的转子
Microcon DNA 快速流速离心过滤装置	EMD Millipore	MRCFOR100
Miracloth，每个样品使用 1 块，裁剪至适合漏斗大小	EMD Millipore	475855
NEBNext 微生物组 DNA 富集试剂盒	New England Biolabs	E2612L
封口膜（Parafilm）	Parafilm M	PM992
塑料花盆和托盘
聚乙烯吡咯烷酮（PVP）	Fisher	BP431-100
蛋白酶 K	Qiagen	19131
脉冲场凝胶电泳装置（例如 CHEF DR III）	Bio-Rad	1703697
纯化磁珠，Agencourt AMpureXP 磁珠	Beckman Coulter	A63881
QIAamp DNA Mini 试剂盒	Qiagen	51304
Qiagen 20/g 基因组 DNA 提取柱试剂盒	Qiagen	10223
Qiagen Buffer EB（洗脱缓冲液）	Qiagen	19086
Qiagen DNA 提取缓冲液套装	Qiagen	19060
QiaRack	Qiagen	19015
qPCR 仪（例如 Roche Light Cycler 480）	Roche
qPCR 板密封膜	Roche	4729757001
qPCR 板，96 孔板	Roche	4729692001
Qubit 检测管	Life Technologies	Q32856
Qubit 宽谱检测试剂盒	Life Technologies	Q32850
Qubit 高灵敏度检测试剂盒	Life Technologies	Q32851
RNase A	Qiagen	19101
血清移液管（20 mL）及移液辅助器	Fisher	13-678-11
小漏斗，每个样品 1 个
氯化钠	Ambion	AM9759
软毛画笔，每个样品 2 支
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder 或其他类型的组织匀浆器	SPEX SamplePrep		或使用其他性能相当的组织匀浆器。若无组织匀浆器，可使用预冷的研钵和研杵进行研磨（详见实验方案）。然而，使用匀浆器可获得更一致的结果，且总匀浆时间更短。
蔗糖	Omnipure	8550
TBE
恒温混匀仪
Tris	Sigma	T2819-100ml
Triton X-100	Promega	H5142
管式旋转仪
离心管，50 mL 聚丙烯圆底管	Corning	352070
离心管，50 mL 高速聚丙烯管	ThermoScientific/Nalgene	3119-0050	例如 Nalgene Oakridge 管或同等产品
蛭石
水浴锅
水，无菌且经认证的无核酸酶水	Fisher	1481
水，无菌 milliQ 水

参考文献

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Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier--A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
Wicke, S., Schneeweiss, G. M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. Hörandl, E., Appelhans, M. , Koeltz Scientific Books. (2015).
Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the 'master circle' model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes--though this be madness, yet there's method in't. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291(2014).
Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948(2016).
Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096(2013).
Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
Qiagen. QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook. , 5th ed, Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016).
E.M. Corporation. User Guide: Microcon Centrifugal Filter Devices. , Available from: http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Microcon-DNA-Fast-Flow-Centrifugal-Filter-Unit-with-Ultracel-membrane,MM_NF-MRCF0R100 (2013).
Qiagen. User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip - (EN). , Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001).
New England BioLabs, Inc.. NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit: Instruction Manual Version 4.0. , Available from: http://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Products/371BCB5A557C462D95D1E45E15BBFEA3/Datacards or Manuals/E2612Manual.pdf (2015).
Qiagen. QIAGEN Genomic DNA Handbook. , Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012).
PacificBiosciences. Guidelines for Using the BIO-RAD® CHEF Mapper® XA Pulsed Field Electrophoresis System. , Available from: http://www.pacb.com/wp-content/uploads/Unsupported-Guidelines-Using-BIO-RAD-CHEFMapper-XA-Pulsed-Field-Electrophoresis.pdf (2016).
Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2016).
Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome? Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).
PacificBiosciences. Procedure & Checklist - 10 kb to 20 kb Template Preparation and Sequencing with Low (100 ng) Input DNA. , Available from: http://www.pacb.com/wp-content/uploads/Procedure-Checklist-10-20kb-Template-Preparation-and-Sequencing-with-Low-Input-DNA.pdf (2015).
PacificBiosciences. Template Preparation and Sequencing Guide. , Available from: http://www.pacb.com/wp-content/uploads/2015/09/Guide-Pacific-Biosciences-Template-Preparation-and-Sequencing.pdf (2014).

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