方法文章

体外成像和荧光标记的GnRH类似物的药物靶向性的定量分析

DOI：

10.3791/55529

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2017年3月21日

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1MTA-SE Pathobiochemistry Research Group, Semmelweis University, 2Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, 3MTA-ELTE Research Group of Peptide Chemistry, Eötvös Loránd University

本文内容

摘要

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选择性标记的荧光的GnRH-I，-II和-III衍生物对于跟踪可靠的工具和量化它们的细胞摄取。这个手稿介绍实验来可视化，量化和比较在各种细胞系这些GnRH的缀合物的吸收效率。

摘要

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GnRH类似物是有效的靶向部分和能够提供抗癌剂选择性为恶性肿瘤细胞，其高表达的GnRH受体。然而，GnRH类似物'细胞摄取的定量分析以及基于GnRH的药物递送系统的研究的细胞类型，目前的限制。以前介绍过，选择性荧光标记的GnRH I，-II和-III衍生产品提供了很大的可探测性，和他们有重复性的和健壮的实验合适的化学性质。我们还发现，适当的向上的最新方法与这些标记GnRH类似物能够提供有关基于促性腺激素释放激素的药物递送系统的新信息。该原稿介绍关于[D-赖氨酸6（FITC）]的细胞摄取了一些简单的和快速的实验-促性腺激素释放激素I，D-赖氨酸6（FITC）〕 -的GnRH-II和[赖氨酸8（FITC）〕 -的GnRH -III在EBC-1（肺），在中BxPC-3（胰腺）和底特律-562-（咽）恶性Ťumor细胞。在与这些的GnRH-FITC缀合物平行，促性腺激素释放激素-1受体的细胞表面水平也之前和促性腺激素释放激素治疗通过共聚焦激光扫描显微镜后检查了这些细胞系。的GnRH-FITC缀合物的细胞摄取是通过荧光激活细胞分选进行定量。在这些实验中观察到GnRH类似物和细胞类型之间的主要区别之间的微小差别。其中细胞系的显著差异有其独特的细胞表面的GnRH-I受体水平相关。引入的实验包含实用的方法来可视化，量化和在各种粘附细胞培养以时间和浓度依赖的方式进行比较的GnRH-FITC缀合物的吸收效率。这些结果可以预测在给定的细胞培养物的GnRH偶联物的药物靶向效率，并提供用于在基于促性腺激素释放激素的药物递送系统的检查的进一步实验的良好基础。

引言

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基于肽靶向给药系统已成为癌症治疗中一个快速显影和希望的领域，在过去几年中1,2。人促性腺激素释放激素受体I型（GnRH的-IR）是主要位于脑垂体，但也存在于其他几个它们负责自我繁殖3的组织。的GnRH-IR也表示在许多癌组织中，相关或无关的生殖系统4,5。促性腺激素释放激素-IR的几种恶性肿瘤细胞高表达与正常组织相比，提供了有针对性的治疗5,6的机会。

许多促性腺激素释放激素（GnRH）类似物已在过去的几十年中，它可以用来作为靶向部分开发F"> 7，8，9，这些肽是能够提供以高选择性抗癌剂为恶性肿瘤细胞，其过量表达的GnRH-IR 6。几种的GnRH偶联的抗肿瘤药物具有更高的选择性和更高的效率比相应的未缀合游离药物已经报道了

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方案

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1.细胞培养和试剂的制备

  1. 保持在制造商推荐的培养基中的细胞培养物，补充有10％（体积/体积）胎牛血清和抗生素（称为完全培养基）。保持细胞培养烧瓶在湿润的5％CO 2气氛中培养器在37℃。按照倒置显微镜下细胞的增殖和汇合（使用10X相衬物镜）。
  2. 当细胞达到足够汇合，取出培养基，并用2-3毫升，无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤培养物。移除PBS并加入0.5毫升，无菌0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液向细胞培养，并在37℃下孵育直至细胞分离（约10分钟）。
  3. 暂停细胞3-4毫升无菌完全培养基停止胰蛋白酶和他们转移到无菌离心管中。离心细胞，在150×g离心，在室温（RT）下4分钟。小心弃上清，并暂停在pellet在2-3毫升无菌完全培养基。
  4. 取出100μL的细胞悬浮液，并用100微升0.4％（M / V）台盼蓝溶液混合，以染色死细胞。负载10微升该混合物成血球和确定存活细胞倒置显微镜的数量。
  5. 稀释细胞悬浮液，在步骤1.3制得10毫升的无菌的完全培养基的所需量，含有4×10 4个细胞/毫升。
  6. 加入每孔细胞悬液（步骤1.5准备）的250微升（10 4个细胞/孔）到七口井第一玻璃底部的8孔显微镜载玻片的。在使用促性腺激素释放激素摄入法这张幻灯片。
  7. 添加每孔的细胞悬浮液（在步骤1.5中制备）的250微升（10 4个细....

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结果

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激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）获得的图像提供有关的GnRH-FITC结合物在给定的细胞培养的时间和浓度依赖性摄取壮观信息。在与这些的GnRH-FITC缀合物的同时，促性腺激素释放激素-1R的细胞表面上的存在也由CLSM实验验证。另外，通过使用一远红DNA染色荧光探针，能够为了对细胞的细胞核以外的GnRH和GnRH的-1R。然而，虽然共焦图像不是量化的，简单的"GnRH的摄入法"可以容易地估计所测试的细胞是否含有较高或较低量的GnRH-FITC缀合物。所施加的GnRH-FITC缀合物，它们的浓度和处理的时间是可变的在该方法中，根据需要。正如图1所示不同的癌细胞含有以浓度依赖性的方式不同级别的GnRH-FITC的。

先进"的GnRH-IR的表达方法"描述了细胞表面的GnRH-IR的可视化免疫细胞化学，前后的GnRH-FITC治疗。在此方法（GnRH的FITC处理前）的第一部分中，我们通过免疫细胞化学形象化的GnRH-IR，而不的GnRH-FITC治疗。在此方法（GnRH的FITC处理之后）的第二部分，我们把细胞与10μM的GnRH的.......

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讨论

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本文所述实验中使用的选择性标记GnRH类似物进行筛选粘附 细胞培养体外 。共聚焦显微镜和流式细胞仪方法适合于跟踪和量化以时间和浓度依赖的方式，这些的GnRH-FITC缀合物的细胞摄取。这些实验有以下关键步骤:1）保持无菌的，健康的细胞培养物; 2）的GnRH肽必须是高质量的; 3）合理的浓度和孵育时间必须遵循; 4）一种治疗和洗涤步骤; 5）以及调整仪器设置。

细胞保持在（V / V）胎牛血清和抗生素（完全培养基）补充有10％的生产商推荐的介质。细胞应保持并在无菌环境中进行处理，直到处理步骤（与的GnRH-FITC缀合物）。实验前，检查使用倒置显微镜细胞。他们应该是健康的，连接必须达到规定的数量。

使用的GnRH肽以高品质和纯度是重要的。我们合成这些肽纯化他们超过98％的18岁 。所述肽可以储存在-25℃冰箱中作为冻干粉末。在10毫的GnRH-FITC储液在DMSO应保持在室温下暗处和几周内用完。我们研究了这些缀合物的稳定性，发现它们是稳定的在.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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该项目得到了国家研究基金 OTKA （K 104045） 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EBC-1JCRB 细胞库JCRB0820人肺鳞状细胞癌
BxPC-3ATCCCRL-1687人胰腺癌
Detroit-562ATCCCCL-138人咽癌
含 L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基LonzaBE12-702FBxPC-3 细胞
Eagle's Minimum Essential 培养基培养基LonzaBE12-611FEBC-1 细胞的培养基，并辅以 0.1% 丙酮酸钠的 Detroit-562 细胞
胎牛血清Euro CloneECS0180L补充培养基
MycoZap Plus-CL LonzaVZA-2012补充培养基（抗生素）
标准系细胞培养瓶VWR10062-872为细胞提供一致、无菌的生长环境
胰蛋白酶-EDTA 混合物 LonzaBE17-161E去除附着的细胞
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）LonzaBE17-516F溶剂
二甲基亚砜Sigma-AldrichD8418-100ML溶剂
盼蓝溶液，0.4%Thermo Fisher Scientific15250061用于细胞计数
[D-Lys6（FITC）]-GnRH-I由我们制造-纯度 >98% （HPLC）
[D-Lys6（FITC）]-GnRH-II由我们制造-纯度和ge;98% （HPLC）
[Lys8（FITC）]-GnRH-III由我们制造-纯度和ge;98% （HPLC）
玻璃底 8 孔显微镜载玻片Ibidi80826用于 CLSM 实验
康宁 Costar 细胞培养板，12 孔Sigma-AldrichCLS3513-50EA用于 FACS 实验
固定液（10% 中性缓冲福尔马林）Bio-Optica01V60P固定贴壁细胞
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906-10G防止抗体的非特异性结合
GnRHR 抗体Proteintech19950-1-AP免疫细胞化学试剂，与人 I 型 GnRH 受体结合
二抗，Alexa Fluor 546 偶联物Thermo Fisher ScientificA11035免疫细胞化学试剂，与一抗结合
荧光探针溶液 （Draq5）Thermo Fisher Scientific62254复染细胞核
荧光安装剂 水性封片剂Sigma-AldrichF4680-25ML用于 CLSM 实验，保留荧光
倒置显微镜Elektro-Optika Ltd. Alpha XDS-2T检查细胞培养物的表型和汇合度
倒置共聚焦激光扫描显微镜蔡司LSM-710在 CLSM 实验中的应用
式细胞仪BD BiosciencesBD FACSCalibur在 FACS 实验中的应用
培养基 用于 台流

参考文献

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  1. Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11(2016).
  2. Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
  3. Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K.

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GnRH AnaloguesFluorescent LabelingConfocal MicroscopyFlow CytometryCellular UptakeCancer Cell LinesGnRH ReceptorsDrug TargetingFluorescence QuantificationTime Concentration Dependent

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