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方法文章

体外成像与荧光标记GnRH类似物药物靶向效率的定量分析

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DOI：

10.3791/55529

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2017年3月21日

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1MTA-SE Pathobiochemistry Research Group, Semmelweis University, 2Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, 3MTA-ELTE Research Group of Peptide Chemistry, Eötvös Loránd University

本文内容

摘要

选择性标记的荧光GnRH-I、-II和-III衍生物是追踪和定量其细胞摄取的可靠工具。 本文介绍了在多种细胞系中可视化、定量和比较这些GnRH偶联物摄取效率的实验方法。

摘要

GnRH类似物是有效的靶向基团，能够将抗癌药物选择性地递送至高表达GnRH受体的恶性肿瘤细胞。然而，目前针对GnRH类似物的细胞摄取定量分析及其在基于GnRH的药物递送系统中所研究的细胞类型仍较为有限。此前已报道的选择性标记的荧光GnRH I、-II和-III衍生物具有良好的可检测性，并具备适合进行可重复且稳健实验的化学特性。我们还发现，采用这些标记的GnRH类似物结合适当的现代方法，可为基于GnRH的药物递送系统提供新的信息。本文介绍了一些简单且快速的实验方法，用于研究[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I、[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II和[Lys8(FITC)]-GnRH-III在EBC-1（肺）、BxPC-3（胰腺）和Detroit-562（咽）恶性肿瘤细胞中的细胞摄取情况。同时，利用共聚焦激光扫描显微镜，在GnRH处理前后检测了这些细胞系表面GnRH-I受体的表达水平。GnRH-FITC偶联物的细胞摄取通过荧光激活细胞分选进行定量。实验结果显示，不同GnRH类似物之间的差异较小，而不同细胞类型之间的差异显著。细胞系间的显著差异与其细胞表面GnRH-I受体表达水平的不同密切相关。所介绍的实验提供了实用的方法，可在多种贴壁细胞培养体系中以时间和浓度依赖的方式可视化、定量并比较GnRH-FITC偶联物的摄取效率。这些结果可预测GnRH偶联物在特定细胞培养体系中的药物靶向效率，并为进一步研究基于GnRH的药物递送系统提供良好的基础。

引言

近年来，基于肽的靶向药物递送系统已成为癌症治疗领域发展迅速且极具前景的研究方向1,2。人类促性腺激素释放激素受体I型（GnRH-I-R）主要位于垂体，但也存在于其他多种与自身繁殖相关的组织中3。GnRH-I-R在多种癌症组织中均有表达，无论其是否与生殖系统相关4,5。相较于正常组织，多种恶性肿瘤细胞表面GnRH-I-R的高表达为靶向治疗提供了可行机会5,6。

近几十年来，已开发出多种促性腺激素释放激素（GnRH）类似物，可用作靶向基团7,8,9。这些肽类能够将抗癌药物高选择性地递送至过表达GnRH-I-R的恶性肿瘤细胞6。已有多个报道显示，与相应的未偶联游离药物相比，GnRH偶联的抗肿瘤药物具有更高的选择性和更好的疗效7,8,9。

关于GnRH肽及其受体的既往研究报道指出，GnRH-I-R可呈现多种构象，对不同的GnRH类似物具有不同的选择性10。 高度可变的GnRH-I-R具有复杂且多样的信号通路，对天然及人工配体表现出不同的活性11。这些特性使得基于GnRH的系统研究具有挑战性。另一方面，它们也具有良好的治疗潜力。此前已有若干使用放射性标记GnRH肽的实验报道12,13,14,15，但使用荧光标记GnRH类似物的实验仍较为有限。尽管放射性标记具有高灵敏度，荧光标记仍具备多项优势，例如操作更简便，以及可与不同荧光染料进行复染。三种常用于药物递送的GnRH类似物为[D-Lys6]-GnRH-I、[D-Lys6]-GnRH-II和GnRH-III，但这些肽段作为靶向基团的有效性很少被直接比较16,17。另一方面，使用不同癌细胞和不同GnRH类似物的独立实验所得结果差异较大。

基于上述考虑，我们聚焦于这些促性腺激素释放激素（GnRH）肽的肿瘤靶向和药物递送潜力，从而合成并表征了[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I、[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II和[Lys8(FITC)]-GnRH-III肽偶联物18。这些类似物在Lys或D-Lys侧链上选择性地标记了FITC（每种偶联物中肽与FITC的比例为1:1）。其设想是，这种选择性荧光标记可为这些肽提供新的信息，并使其能够被有效追踪和可靠定量。这些偶联物具有安全的操作性和可靠的可检测性，便于比较它们的肿瘤靶向效率，并用于多种恶性肿瘤细胞的筛选。我们希望，利用这些肽偶联物开展的最新实验能够促进新型靶向癌症的GnRH-药物偶联物的开发，并有助于发现新的治疗靶点。

本文展示了若干可高度重复且快速的GnRH-FITC偶联物实验。GnRH受体（GnRH-R）在细胞表面的表达是影响GnRH摄取的关键条件，因此我们同时检测了各实验细胞系中GnRH-I-R在细胞表面的表达水平。我们通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对GnRH-I-R和GnRH-FITC偶联物进行可视化，并利用荧光激活细胞分选技术（FACS）对细胞摄取GnRH-FITC偶联物的情况进行定量分析。

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方案

1. 细胞培养物与试剂的准备

  1. 按照制造商推荐的培养基培养细胞，并添加10%（v/v）胎牛血清和抗生素（称为完全培养基）。将细胞培养瓶置于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中培养。使用倒置显微镜（配备10倍相差物镜）观察细胞增殖和汇合情况。
  2. 当细胞达到适当汇合度时，吸除培养基，用2–3 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。吸除PBS后，向培养瓶中加入0.5 mL无菌的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育至细胞脱落（约10分钟）。
  3. 用3–4 mL无菌完全培养基重悬细胞以终止胰蛋白酶作用，并将细胞悬液转移至无菌离心管中。在室温（RT）下以150 × g离心4分钟。小心弃去上清液，将沉淀用2–3 mL无菌完全培养基重悬。
  4. 取100 µL细胞悬液与100 µL 0.4%（m/V）台盼蓝溶液混合，以染色死细胞。取10 µL该混合液加入血细胞计数板，使用倒置显微镜计数活细胞数量。
  5. 将步骤1.3制备的细胞悬液用无菌完全培养基稀释至10 mL，调整浓度为4 × 104 个细胞/mL。
  6. 将步骤1.5制备的细胞悬液每孔250 µL（每孔104 个细胞）加入第一张玻璃底8孔载玻片的七个孔中。该载玻片用于促性腺激素释放激素（GnRH）摄取实验。
  7. 将步骤1.5制备的细胞悬液每孔250 µL（每孔104 个细胞）加入第二张8孔载玻片的五个孔中。该载玻片用于GnRH-I-R表达实验。
  8. 将步骤1.5制备的细胞悬液每孔1 mL（每孔4 × 104 个细胞）加入12孔板的七个孔中。该板用于GnRH定量实验。
  9. 让细胞在两张载玻片和12孔板中贴壁。将它们置于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中孵育48小时。
  10. 孵育结束后，使用倒置显微镜（配备10倍相差物镜）检查细胞状态。若细胞生长良好且已贴壁，则继续后续操作。
  11. 使用二甲基亚砜（DMSO）配制三种偶联物的10 mM GnRH-FITC储备液18。（使用以下稀释浓度：16.43 µg/µL [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I、16.97 µg/µL [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II 和 16.47 µg/µL [Lys8(FITC)]-GnRH-III）。将这些储备液避光保存于室温，并在数周内使用完毕。
  12. 分别取三种10 mM GnRH-FITC储备液各1.7 µL，加入1.7 mL完全培养基中稀释。充分震荡混匀（此为10 µM GnRH-FITC处理液）。再分别取三种10 µM GnRH-FITC处理液各150 µL，加入1.35 mL完全培养基中稀释，同样震荡混匀（此为1 µM GnRH-FITC处理液）。
    注意：所有含GnRH-FITC的处理液均需避光，且在数小时内使用完毕。
  13. 将步骤1.12制备的六种GnRH-FITC处理液以及4 mL完全培养基预热至37 °C。
  14. 将5 mM荧光探针溶液（材料列表中提及的核复染试剂）3 µL加入3 mL PBS中稀释至5 µM。该溶液需避光，室温保存，并在数小时内使用完毕。

2. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）

  1. GnRH 摄取方法
    1. 取步骤 1.6 中制备的第一张显微镜载玻片，用移液器吸出每个孔中的完全培养基。向第一个孔中加入 250 µL 预热的完全培养基，作为阴性对照。向接下来的六个孔中（三个孔加 1 µM，三个孔加 10 µM）各加入 250 µL 预热的 GnRH-FITC 处理培养基（来自步骤 1.13）。将载玻片置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育 5 小时。
    2. 用移液器吸出各孔中的培养基，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 µL 固定液（10% 中性缓冲福尔马林），将载玻片在室温下孵育 10 分钟。
    3. 用移液器吸出各孔中的固定液，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 µL 含有步骤 1.14 中配制的 5 µM 荧光探针溶液的 PBS，在室温下孵育 10 分钟。
    4. 用移液器吸出各孔中的荧光探针溶液，并小心地用 250 µL PBS 洗涤细胞两次。最后向每个孔中加入 3–4 滴封片液。将载玻片置于暗处室温保存，直至成像。
  2. GnRH-I-R 表达检测方法
    1. 取步骤 1.7 中制备的第二张 8 孔显微镜载玻片，用移液器吸出五个孔中的完全培养基。
    2. 向第一个孔中加入 250 µL 预热的完全培养基，作为阴性对照。向第二个孔中也加入 250 µL 预热的完全培养基，用于检测 GnRH 处理前的 GnRH-I-R 表达水平。
    3. 向接下来的三个孔中各加入 250 µL 预热的 10 µM GnRH-FITC 处理培养基。利用这三个孔在检测 GnRH-I-R 表达前对细胞进行 GnRH-FITC 共轭物预处理。将载玻片置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育 1 小时。
    4. 用移液器吸出将用于检测 GnRH 处理后 GnRH-I-R 表达的三个孔中的处理培养基，并用 250 µL 预热的完全培养基洗涤这些孔。向这三个孔中各加入 250 µL 预热的完全培养基。将载玻片置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中再孵育 1 小时。
    5. 用移液器吸出五个孔中的培养基，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 µL 固定液，在室温下孵育 10 分钟。
    6. 用移液器吸出各孔中的固定液，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 µL 含有 5% 牛血清白蛋白（BSA）封闭液的 PBS，在室温下孵育 1 小时。
    7. 将 10 µL GnRH-I-R 一抗用 1 mL PBS 稀释（1:100 比例）。置于室温保存，并在数小时内使用完毕。
    8. 除阴性对照孔（第一个孔）外，用移液器吸出其余各孔中的 BSA 封闭液，并用 250 µL PBS 洗涤细胞（阴性对照孔除外）。向各孔（阴性对照孔除外）中加入 250 µL 含步骤 2.2.7 中配制的 GnRH-I-R 一抗的 PBS。将载玻片置于暗处室温孵育 1 小时。
    9. 将 2.5 µL Alexa 546 标记的二抗用 1.25 mL PBS 稀释（1:500 比例）。
      注意：该溶液需避光保存，置于室温，并在数小时内使用完毕。
    10. 用移液器吸出五个孔中的溶液，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 µL 含步骤 2.2.9 中配制的 AF 546 标记二抗的 PBS。将载玻片置于暗处室温孵育 1 小时。
    11. 用移液器吸出各孔中的溶液，并用 250 µL PBS 洗涤细胞。向每个孔中加入 250 µL 含步骤 1.14 中配制的 5 µM 荧光探针溶液的 PBS，在室温下孵育 10 分钟。
    12. 用移液器吸出各孔中的荧光探针溶液，并小心地用 250 µL PBS 洗涤细胞两次。随后向每个孔中加入 3–4 滴封片液。将载玻片置于暗处室温保存，直至显微成像。
  3. 成像
    1. 使用倒置共聚焦激光扫描显微镜（采用 63X 油镜）对细胞进行成像
      1. 使用以下激发/发射波长：GnRH 共轭物：488/514 nm；Alexa 546 标记抗体：488/546 nm（仅用于 GnRH-I-R 表达检测方法）；Draq5 荧光探针：633/680 nm。
      2. 使用阴性对照细胞设定成像参数，并用这些参数对处理组细胞进行成像（图 3）。每次分析开始时，需在每张显微镜载玻片上重新调整成像参数。必要时使用设备制造商提供的软件对图像进行微调并导出。

3. 荧光激活细胞分选（FACS）

  1. GnRH 定量方法
    1. 取步骤 1.8 中制备的培养板，用移液器吸出七个孔中的全部培养基。向第一个孔中加入 1 mL 预热的完全培养基，作为阴性对照。向接下来的六个孔中分别加入 1 mL 预热的处理培养基（三个孔加入 1 µM，另三个孔加入 10 µM）。将培养板置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润化培养箱中孵育 5 小时。
    2. 用移液器吸出各孔中的培养基。用 2 mL PBS 小心清洗细胞两次。向每个孔中加入 500 µL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。将培养板在 37 °C 孵育，直至细胞脱落（约 10 分钟）。
    3. 向每个孔中加入 1 mL 完全培养基以终止胰蛋白酶作用。轻轻摇动培养板。用移液器轻柔地重悬细胞，并将每个孔中的细胞悬液转移至流式管中。在 4 °C 条件下，以 150 × g 离心 4 分钟。
    4. 小心一次性倾倒上清液。向每根流式管中加入 500 µL 冰冷的 PBS，并轻柔地重悬细胞。将流式管置于冰上，直至实验结束。
  2. 分析与计算
    1. 通过流式细胞术分析细胞。激发波长使用 488 nm 氩激光，检测波长使用 530 nm。先运行阴性对照细胞以设定流式细胞仪参数，并使用该参数分析处理组细胞（图 4A）。使用仪器厂商提供的软件分析数据，确定中位荧光强度（MFI）值，并计算相对 MFI 值。

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结果

通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）获得的图像能够以时间和浓度依赖的方式，直观展示特定细胞培养体系中GnRH-FITC偶联物的摄取情况。与此同时，该CLSM实验也可验证细胞表面是否存在GnRH-I-R。此外，通过使用远红光DNA染色荧光探针，可在观察GnRH及GnRH-I-R的同时对细胞核进行共染色。然而，尽管共聚焦图像本身难以进行定量分析，但采用简单的“GnRH摄取法”即可快速评估待测细胞中GnRH-FITC偶联物含量的高低。本方法中所使用的GnRH-FITC偶联物种类、浓度及处理时间均可根据实验需求灵活调整。如图1所示，不同类型的癌细胞在浓度依赖条件下对GnRH-FITC的摄取水平存在差异。

先进的“GnRH-I-R表达方法”描述了在GnRH-FITC处理前后，通过免疫细胞化学法对细胞表面GnRH-I-R进行可视化。该方法的第一部分（GnRH-FITC处理前）是指在未进行GnRH-FITC处理的情况下，通过免疫细胞...

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讨论

本文所述实验采用选择性标记的GnRH类似物筛选贴壁细胞 细胞培养 体外共聚焦显微镜和流式细胞术可用于以时间和浓度依赖的方式追踪并定量这些GnRH-FITC偶联物的细胞摄取。这些实验包含以下关键步骤：1）维持无菌且健康的细胞培养环境；2）GnRH肽必须具有高纯度；3）采用合理的浓度和孵育时间；4）处理与洗涤步骤；5）仪器参数需经过良好优化。

细胞在制造商推荐的培养基中培养，培养基中添加10%（V/V）胎牛血清和抗生素（完全培养基）。在处理步骤（使用GnRH-FITC偶联物）之前，细胞应始终保持并操作于无菌环境中。实验前，使用倒置显微镜检查细胞，细胞应状态良好、贴壁生长，并达到所需的数量。

使用高纯度和高质量的促性腺激素释放激素（GnRH）肽至关重要。我们合成了这些肽，并将其纯化至纯度超过98%18。肽可作为冻干粉末在-25 °C冰箱中保存。DMSO中的10 mM GnRH-FITC储备溶液应避光、室温保存，并在数周内使用完毕。我们研究了这些偶联物...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

该项目由国家研究基金OTKA（K 104045）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EBC-1JCRB 细胞库JCRB0820人肺鳞状细胞癌
BxPC-3ATCCCRL-1687人胰腺腺癌
Detroit-562ATCCCCL-138人咽癌
RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺）LonzaBE12-702FBxPC-3 细胞培养用培养基
伊格尔最低必需培养基LonzaBE12-611FEBC-1 细胞培养用培养基，Detroit-562 细胞培养时补充 0.1% 丙酮酸钠
胎牛血清Euro CloneECS0180L补充培养基
MycoZap Plus-CL LonzaVZA-2012补充培养基（抗生素）
标准细胞培养瓶VWR10062-872为细胞提供稳定、无菌的生长环境
胰蛋白酶-EDTA 混合液 LonzaBE17-161E消化贴壁细胞
磷酸盐缓冲液（PBS）LonzaBE17-516F溶剂
二甲基亚砜Sigma-AldrichD8418-100ML溶剂
台盼蓝溶液，0.4%Thermo Fisher Scientific15250061用于细胞计数
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I自制-纯度 ≥98%（HPLC）
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II自制-纯度 ≥98%（HPLC）
[Lys8(FITC)]-GnRH-III自制-纯度 ≥98%（HPLC）
玻璃底 8 孔显微镜载片Ibidi80826用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）实验
Corning Costar 细胞培养板，12 孔Sigma-AldrichCLS3513-50EA用于流式细胞术（FACS）实验
固定液（10% 中性缓冲福尔马林）Bio-Optica01V60P固定贴壁细胞
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906-10G防止抗体非特异性结合
GnRHR 抗体Proteintech19950-1-AP免疫细胞化学试剂，结合人 I 型 GnRH 受体
二抗，Alexa Fluor 546 标记Thermo Fisher ScientificA11035免疫细胞化学试剂，结合一抗
荧光探针溶液（Draq5）Thermo Fisher Scientific62254细胞核复染
Fluoromount 水性封片介质Sigma-AldrichF4680-25ML用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）实验，保持荧光信号
倒置显微镜Elektro-Optika Ltd. Alpha XDS-2T观察细胞形态及汇合度
倒置共聚焦激光扫描显微镜ZeissLSM-710用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）实验
流式细胞仪BD BiosciencesBD FACSCalibur用于流式细胞术（FACS）实验

参考文献

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