体外成像与荧光标记GnRH类似物药物靶向效率的定量分析

摘要

选择性标记的荧光GnRH-I、-II和-III衍生物是追踪和定量其细胞摄取的可靠工具。 本文介绍了在多种细胞系中可视化、定量和比较这些GnRH偶联物摄取效率的实验方法。

摘要

GnRH类似物是有效的靶向基团，能够将抗癌药物选择性地递送至高表达GnRH受体的恶性肿瘤细胞。然而，目前针对GnRH类似物的细胞摄取定量分析及其在基于GnRH的药物递送系统中所研究的细胞类型仍较为有限。此前已报道的选择性标记的荧光GnRH I、-II和-III衍生物具有良好的可检测性，并具备适合进行可重复且稳健实验的化学特性。我们还发现，采用这些标记的GnRH类似物结合适当的现代方法，可为基于GnRH的药物递送系统提供新的信息。本文介绍了一些简单且快速的实验方法，用于研究[D-Lys⁶(FITC)]-GnRH-I、[D-Lys⁶(FITC)]-GnRH-II和[Lys⁸(FITC)]-GnRH-III在EBC-1（肺）、BxPC-3（胰腺）和Detroit-562（咽）恶性肿瘤细胞中的细胞摄取情况。同时，利用共聚焦激光扫描显微镜，在GnRH处理前后检测了这些细胞系表面GnRH-I受体的表达水平。GnRH-FITC偶联物的细胞摄取通过荧光激活细胞分选进行定量。实验结果显示，不同GnRH类似物之间的差异较小，而不同细胞类型之间的差异显著。细胞系间的显著差异与其细胞表面GnRH-I受体表达水平的不同密切相关。所介绍的实验提供了实用的方法，可在多种贴壁细胞培养体系中以时间和浓度依赖的方式可视化、定量并比较GnRH-FITC偶联物的摄取效率。这些结果可预测GnRH偶联物在特定细胞培养体系中的药物靶向效率，并为进一步研究基于GnRH的药物递送系统提供良好的基础。

引言

近年来，基于肽的靶向药物递送系统已成为癌症治疗领域发展迅速且极具前景的研究方向^1,2。人类促性腺激素释放激素受体I型（GnRH-I-R）主要位于垂体，但也存在于其他多种与自身繁殖相关的组织中³。GnRH-I-R在多种癌症组织中均有表达，无论其是否与生殖系统相关^4,5。相较于正常组织，多种恶性肿瘤细胞表面GnRH-I-R的高表达为靶向治疗提供了可行机会^5,6。

近几十年来，已开发出多种促性腺激素释放激素（GnRH）类似物，可用作靶向基团^7,8,9。这些肽类能够将抗癌药物高选择性地递送至过表达GnRH-I-R的恶性肿瘤细胞⁶。已有多个报道显示，与相应的未偶联游离药物相比，GnRH偶联的抗肿瘤药物具有更高的选择性和更好的疗效

方案

1. 细胞培养物与试剂的准备

1. 按照制造商推荐的培养基培养细胞，并添加10%（v/v）胎牛血清和抗生素（称为完全培养基）。将细胞培养瓶置于37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中培养。使用倒置显微镜（配备10倍相差物镜）观察细胞增殖和汇合情况。
2. 当细胞达到适当汇合度时，吸除培养基，用2–3 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。吸除PBS后，向培养瓶中加入0.5 mL无菌的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育至细胞脱落（约10分钟）。
3. 用3–4 mL无菌完全培养基重悬细胞以终止胰蛋白酶作用，并将细胞悬液转移至无菌离心管中。在室温（RT）下以150 × g离心4分钟。小心弃去上清液，将沉淀用2–3 mL无菌完全培养基重悬。
4. 取100 µL细胞悬液与100 µL 0.4%（m/V）台盼蓝溶液混合，以染色死细胞。取10 µL该混合液加入血细胞计数板，使用倒置显微镜计数活细胞数量。
5. 将步骤1.3制备的细胞悬液用无菌完全培养基稀释至10 mL，调整浓度为4 × 10⁴ 个细胞/mL。
6. 将步骤1.5制备的细胞悬液每孔250 µL（每孔10⁴ 个细胞）加入第一张玻璃底8孔载玻片的七个孔中。该载玻片用于促性腺激素释放激素（GnRH）摄取实验。
7. 将步骤1.5制备的细胞悬液每孔250 µL（每孔10⁴ 个细胞....

结果

通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）获得的图像能够以时间和浓度依赖的方式，直观展示特定细胞培养体系中GnRH-FITC偶联物的摄取情况。与此同时，该CLSM实验也可验证细胞表面是否存在GnRH-I-R。此外，通过使用远红光DNA染色荧光探针，可在观察GnRH及GnRH-I-R的同时对细胞核进行共染色。然而，尽管共聚焦图像本身难以进行定量分析，但采用简单的“GnRH摄取法”即可快速评估待测细胞中GnRH-FITC偶联物含量的高低。本方法中所使用的GnRH-FITC偶联物种类、浓度及处理时间均可根据实验需求灵活调整。如图1所示，不同类型的癌细胞在浓度依赖条件下对GnRH-FITC的摄取水平存在差异。

先进的“GnRH-I-R表达方法”描述了在GnRH-FITC处理前后，通过免疫细胞化学法对细胞表面GnRH-I-R进行可视化。该方法的第一部分（GnRH-FITC处理前）是指在未进行GnRH-FITC处理的情况下，通过免疫细胞.......

讨论

本文所述实验采用选择性标记的GnRH类似物筛选贴壁细胞 细胞培养 体外共聚焦显微镜和流式细胞术可用于以时间和浓度依赖的方式追踪并定量这些GnRH-FITC偶联物的细胞摄取。这些实验包含以下关键步骤：1）维持无菌且健康的细胞培养环境；2）GnRH肽必须具有高纯度；3）采用合理的浓度和孵育时间；4）处理与洗涤步骤；5）仪器参数需经过良好优化。

细胞在制造商推荐的培养基中培养，培养基中添加10%（V/V）胎牛血清和抗生素（完全培养基）。在处理步骤（使用GnRH-FITC偶联物）之前，细胞应始终保持并操作于无菌环境中。实验前，使用倒置显微镜检查细胞，细胞应状态良好、贴壁生长，并达到所需的数量。

使用高纯度和高质量的促性腺激素释放激素（GnRH）肽至关重要。我们合成了这些肽，并将其纯化至纯度超过98%¹⁸。肽可作为冻干粉末在-25 °C冰箱中保存。DMSO中的10 mM GnRH-FITC储备溶液应避光、室温保存，并在数周内使用完毕。我们研究了这些偶联物.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EBC-1	JCRB 细胞库	JCRB0820	人肺鳞状细胞癌
BxPC-3	ATCC	CRL-1687	人胰腺腺癌
Detroit-562	ATCC	CCL-138	人咽癌
RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺）	Lonza	BE12-702F	BxPC-3 细胞培养用培养基
伊格尔最低必需培养基	Lonza	BE12-611F	EBC-1 细胞培养用培养基，Detroit-562 细胞培养时补充 0.1% 丙酮酸钠
胎牛血清	Euro Clone	ECS0180L	补充培养基
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2012	补充培养基（抗生素）
标准细胞培养瓶	VWR	10062-872	为细胞提供稳定、无菌的生长环境
胰蛋白酶-EDTA 混合液	Lonza	BE17-161E	消化贴壁细胞
磷酸盐缓冲液（PBS）	Lonza	BE17-516F	溶剂
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	溶剂
台盼蓝溶液，0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	用于细胞计数
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I	自制	-	纯度 ≥98%（HPLC）
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II	自制	-	纯度 ≥98%（HPLC）
[Lys8(FITC)]-GnRH-III	自制	-	纯度 ≥98%（HPLC）
玻璃底 8 孔显微镜载片	Ibidi	80826	用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）实验
Corning Costar 细胞培养板，12 孔	Sigma-Aldrich	CLS3513-50EA	用于流式细胞术（FACS）实验
固定液（10% 中性缓冲福尔马林）	Bio-Optica	01V60P	固定贴壁细胞
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906-10G	防止抗体非特异性结合
GnRHR 抗体	Proteintech	19950-1-AP	免疫细胞化学试剂，结合人 I 型 GnRH 受体
二抗，Alexa Fluor 546 标记	Thermo Fisher Scientific	A11035	免疫细胞化学试剂，结合一抗
荧光探针溶液（Draq5）	Thermo Fisher Scientific	62254	细胞核复染
Fluoromount 水性封片介质	Sigma-Aldrich	F4680-25ML	用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）实验，保持荧光信号
倒置显微镜	Elektro-Optika Ltd.	Alpha XDS-2T	观察细胞形态及汇合度
倒置共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss	LSM-710	用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）实验
流式细胞仪	BD Biosciences	BD FACSCalibur	用于流式细胞术（FACS）实验