方法文章

体外成像和荧光标记的GnRH类似物的药物靶向性的定量分析

DOI：

10.3791/55529

⸱

2017年3月21日

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1MTA-SE Pathobiochemistry Research Group, Semmelweis University, 2Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, 3MTA-ELTE Research Group of Peptide Chemistry, Eötvös Loránd University

本文内容

摘要

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选择性标记的荧光的GnRH-I，-II和-III衍生物对于跟踪可靠的工具和量化它们的细胞摄取。这个手稿介绍实验来可视化，量化和比较在各种细胞系这些GnRH的缀合物的吸收效率。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GnRH类似物是有效的靶向部分和能够提供抗癌剂选择性为恶性肿瘤细胞，其高表达的GnRH受体。然而，GnRH类似物'细胞摄取的定量分析以及基于GnRH的药物递送系统的研究的细胞类型，目前的限制。以前介绍过，选择性荧光标记的GnRH I，-II和-III衍生产品提供了很大的可探测性，和他们有重复性的和健壮的实验合适的化学性质。我们还发现，适当的向上的最新方法与这些标记GnRH类似物能够提供有关基于促性腺激素释放激素的药物递送系统的新信息。该原稿介绍关于[D-赖氨酸6（FITC）]的细胞摄取了一些简单的和快速的实验-促性腺激素释放激素I，D-赖氨酸6（FITC）〕 -的GnRH-II和[赖氨酸8（FITC）〕 -的GnRH -III在EBC-1（肺），在中BxPC-3（胰腺）和底特律-562-（咽）恶性Ťumor细胞。在与这些的GnRH-FITC缀合物平行，促性腺激素释放激素-1受体的细胞表面水平也之前和促性腺激素释放激素治疗通过共聚焦激光扫描显微镜后检查了这些细胞系。的GnRH-FITC缀合物的细胞摄取是通过荧光激活细胞分选进行定量。在这些实验中观察到GnRH类似物和细胞类型之间的主要区别之间的微小差别。其中细胞系的显著差异有其独特的细胞表面的GnRH-I受体水平相关。引入的实验包含实用的方法来可视化，量化和在各种粘附细胞培养以时间和浓度依赖的方式进行比较的GnRH-FITC缀合物的吸收效率。这些结果可以预测在给定的细胞培养物的GnRH偶联物的药物靶向效率，并提供用于在基于促性腺激素释放激素的药物递送系统的检查的进一步实验的良好基础。

引言

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基于肽靶向给药系统已成为癌症治疗中一个快速显影和希望的领域，在过去几年中1,2。人促性腺激素释放激素受体I型（GnRH的-IR）是主要位于脑垂体，但也存在于其他几个它们负责自我繁殖3的组织。的GnRH-IR也表示在许多癌组织中，相关或无关的生殖系统4,5。促性腺激素释放激素-IR的几种恶性肿瘤细胞高表达与正常组织相比，提供了有针对性的治疗5,6的机会。

许多促性腺激素释放激素（GnRH）类似物已在过去的几十年中，它可以用来作为靶向部分开发F"> 7，8，9，这些肽是能够提供以高选择性抗癌剂为恶性肿瘤细胞，其过量表达的GnRH-IR 6。几种的GnRH偶联的抗肿瘤药物具有更高的选择性和更高的效率比相应的未缀合游离药物已经报道了7，8，9。

有关的GnRH肽及其受体以前的出版物报道，GnRH的红外可以假设具有不同的选择性GnRH类似物10的各种构象。高度可变的GnRH-IR已复杂和各种信号通路被赋予了对他们的自然和人工配体11个不同的活动。这些事实使得基于促性腺激素释放激素系统的调查具有挑战性。另一方面，在 Ÿ具有前途的治疗潜力。用放射性标记的GnRH肽几个实验以前报道12， 第13， 第 14，第 15，但实验，其中使用荧光标记的GnRH类似物仍然有限。而放射性标记具有高灵敏度，荧光标记有几个其他的优点，例如容易处理，并用不同的荧光团给染液的能力。已成功地被用于药物递送三种常见GnRH类似物是[D-赖氨酸6] -GnRH-I，D-赖氨酸6] -GnRH-II和GnRH的-Ⅲ，但这些肽的作为靶向部分的有效性是很少相比16，17。另一方面，在其中不同的癌细胞和GnRH类似物被用于从不同的实验结果是多样的。

ntent">基于这些考虑，我们集中在肿瘤靶向和药物递送的潜在这些的GnRH肽的，并且由此合成和表征的[D-赖氨酸6（FITC）〕 -的GnRH-I，D-赖氨酸6（FITC ）〕 -的GnRH-II和[赖氨酸8（FITC）〕 -的GnRH-III肽缀合物18这些类似物有选择地与FITC标记上的他们的赖氨酸或D-赖氨酸（肽-FITC比率侧链1:1每个。缀合物），其思想是，选择性荧光标记可以提供有关这些肽新颖的信息，并允许他们的良好的跟踪和可靠的定量。这些结合物具有安全处理和可靠探测，这使得它更容易比较他们的肿瘤靶向效率，并且许多类型的恶性肿瘤细胞的筛选，我们希望达至最新的实验与这些肽偶联物可能有助于新型癌症的靶向发展促性腺激素释放激素药物结合物，并有助于发现新的治疗焦油得到为好。

本手稿演示用的GnRH-FITC结合物以及一些重复性好，快速实验。的GnRH-R的细胞表面表达是关于GnRH的摄取决定性条件，因此我们同时研究了所测试的细胞系中的GnRH-1R的细胞表面水平。我们可视通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）GnRH的IR和GnRH的-FITC缀合物和使用荧光激活细胞分选（FACS）定量的GnRH-FITC缀合物的细胞摄取。

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方案

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1.细胞培养和试剂的制备

  1. 保持在制造商推荐的培养基中的细胞培养物，补充有10％（体积/体积）胎牛血清和抗生素（称为完全培养基）。保持细胞培养烧瓶在湿润的5％CO 2气氛中培养器在37℃。按照倒置显微镜下细胞的增殖和汇合（使用10X相衬物镜）。
  2. 当细胞达到足够汇合，取出培养基，并用2-3毫升，无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤培养物。移除PBS并加入0.5毫升，无菌0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液向细胞培养，并在37℃下孵育直至细胞分离（约10分钟）。
  3. 暂停细胞3-4毫升无菌完全培养基停止胰蛋白酶和他们转移到无菌离心管中。离心细胞，在150×g离心，在室温（RT）下4分钟。小心弃上清，并暂停在pellet在2-3毫升无菌完全培养基。
  4. 取出100μL的细胞悬浮液，并用100微升0.4％（M / V）台盼蓝溶液混合，以染色死细胞。负载10微升该混合物成血球和确定存活细胞倒置显微镜的数量。
  5. 稀释细胞悬浮液，在步骤1.3制得10毫升的无菌的完全培养基的所需量，含有4×10 4个细胞/毫升。
  6. 加入每孔细胞悬液（步骤1.5准备）的250微升（10 4个细胞/孔）到七口井第一玻璃底部的8孔显微镜载玻片的。在使用促性腺激素释放激素摄入法这张幻灯片。
  7. 添加每孔的细胞悬浮液（在步骤1.5中制备）的250微升（10 4个细胞/孔）到第二8孔显微镜载玻片的五井。这种滑动将在的GnRH-IR表达的方法中使用。
  8. 加1，每孔的细胞悬浮液（在步骤1.5中制备）中的溶液（4×10 4个细胞/孔）成七个逢一个12孔板的LS。该板将在GnRH的量化方法中。
  9. 让细胞附着在两个显微镜载玻片和板。孵育他们在湿润，5％的CO 2气氛中培养器在37℃下48小时。
  10. 孵化后检查倒置显微镜下细胞（使用10X相衬物镜）。如果细胞是健康和连接，请继续下面的步骤。
  11. 准备从每三个偶联物18的在二甲亚砜（DMSO）的10mM的GnRH-FITC储液。 （使用这些稀释浓度:16.43微克/μL[D-赖氨酸6（FITC） -的GnRH-I，16.97微克/μL[D-赖氨酸6（FITC） -的GnRH-II和16.47微克/μL[赖氨酸8（ FITC）〕 - 的GnRH-III）中保持这些储备溶液在暗处在室温下并在几周内使用它们。
  12. 稀释每三个10毫米的GnRH-FITC股票解决方案1.7毫升完全培养基1.7微升。撼动这些解决方案。 （帖e为10μM的GnRH-FITC处理介质。）稀释每三个10μM的GnRH-FITC处理介质的150微升1.35中完全溶液中。摇这些解决方案，以及（这些是1μM的GnRH-FITC处理介质）。
    注:含有处理介质的所有的GnRH-FITC应避光和几个小时内用完。
  13. 预热的六个的GnRH-FITC处理介质（在步骤1.12的方法制备）和4毫升完全培养基中至37℃。
  14. 稀的5mM的荧光探针溶液3微升在3毫升PBS中（在材料清单中提到核染剂）至5微米。该溶液应避光，其保持在RT，并在几个小时内使用完。

2.激光共聚焦显微镜（CLSM）

  1. 促性腺激素释放激素摄入法
    1. 采取步骤准备1.6的第一个显微镜载玻片，并吸取了来自各的七的完全培养基。加入预热完整的中介的250微升微米到第一井。使用此作为阴性对照。添加预热的GnRH-FITC的250微升处理介质（从1.13）到每个未来六井（3个孔用1μM和3与10μM）。孵育在湿润，5％的CO 2气氛中培养器滑动，在37℃5小时。
    2. 吸取出从每个孔的培养基，并用250微升PBS洗涤该细胞。加定影溶液（10％中性缓冲福尔马林）的250微升每孔，并培育在RT滑动，10分钟。
    3. 吸取出从每个孔定影液，并用250微升PBS洗涤该细胞。添加250微升含在步骤1.14制备成​​每孔5微米的荧光探针溶液的PBS并孵育在RT滑动，10分钟。
    4. 吸取了从每个荧光探针解决好，并用250微升PBS仔细清洗细胞两次。添加安装介质3-4滴到每口井，终于。保持室温在黑暗的幻灯片，直到成像。
  2. 促性腺激素释放激素-IR表达法
    1. 取在步骤1.7制得的第二8孔显微镜载玻片和吸取出从各五个井的完全培养基。
    2. 添加预热的完全培养基的250微升到第一井，用此作为阴性对照。加入预热的完全培养基250μL进入第二也很好，并使用此GnRH的治疗前检查的GnRH-IR表达。
    3. 加入这三个预热10μM的GnRH-FITC处理介质的250微升到下一个三口井。使用这些井检查的GnRH-IR表达之前，用预处理的GnRH-FITC结合物的细胞。孵育在湿润，5％的CO 2气氛中培养器滑动，在37℃1小时。
    4. 吸取出从每个将被用于检查的GnRH处理后的GnRH-IR表达并用预热完全培养基250μL的洗涤这些孔中的三个孔的处理介质。加入250μL的预热完全培养基到每个三口井的。孵育在湿润，5％的CO 2气氛中培养器滑动，在37℃1小时。
    5. 吸取出从每五个孔的培养基，并用250微升PBS洗涤该细胞。添加250微升定影溶液导入各孔中，并孵育在RT滑动，10分钟。
    6. 吸取出从每个孔定影液并用PBS 250微升洗细胞。添加的PBS 250微升含5％牛血清白蛋白（BSA）封闭溶液导入各孔中，并孵育在RT滑动，1小时。
    7. 稀的GnRH-IR初级抗体的10μL的1毫升PBS中（1:100的比例）。将其保持在RT，并在几个小时内使用完。
    8. 吸取出从每个孔除外阴性对照（第一阱）的BSA封闭溶液。洗净用250微升PBS细胞（除阴性对照好）。加入250包含步骤2.2.7制备成EAC的GnRH-IR一抗的PBS微升ħ井（除了阴性对照）。孵育所述滑动在RT，1小时，在黑暗的地方。
    9. 稀释的Alexa 546标记的第二抗体的2.5微升在1.25毫升的PBS（1:500的比例）。
      注意:此溶液应该避光，其保持在RT，并在几个小时内使用完。
    10. 吸取出从每五个井的解决方案，并用250微升PBS洗涤该细胞。添加的PBS 250微升含在步骤2.2.9制备成每个孔的AF 546标记的第二抗体。孵育所述滑动在RT，在黑暗1小时。
    11. 吸取出从每个孔中的溶液，并用250微升PBS洗涤该细胞。添加包含在步骤1.14制备成​​每孔5微米的荧光探针溶液的PBS 250微升，孵育滑动10分钟，在RT。
    12. 吸取出从每个孔的荧光探针溶液，并用250微升的PBS小心洗细胞两次。添加安装介质3-4滴进每口井，后来。避光幻灯片在室温下，直到显微成像。
  3. 成像
    1. 图像的单元倒置共聚焦激光扫描显微镜（使用63X油浸物镜）
      1. 使用下面的激发/发射波长。 GnRH的结合物:五百十四分之四百八十八纳米，Alexa的546标记的抗体:五百四十六分之四百八十八纳米（仅使用促性腺激素释放激素-IR表达法），DRAQ5荧光探针:680分之633纳米。
      2. 设置使用阴性对照细胞中的摄像参数。使用这些参数来图像处理的细胞（ 图3）。重新调整上在分析的开始每个显微镜载玻片成像参数。微调和出口的图像与在必要时由制造商提供的软件。

3.荧光激活细胞分选（FACS）

  1. GnRH的定量方法
    1. 采取步骤准备1.8板，并吸取了来自EA的完全培养基七口井的通道。添加1毫升预热的完全培养基到第一井。使用此作为阴性对照。加入1毫升每个预热六个处理介质（3口井1μM和3口井，10μM）进入下一个六口井的。孵育在湿润，5％的CO 2气氛中孵化该板在37℃5小时。
    2. 吸取出从每个孔的介质。用2毫升的PBS仔细清洗细胞两次。加的胰蛋白酶-EDTA溶液500微升到每个孔中。在37℃孵育板，直至细胞分离（约10分钟）。
    3. 加入1毫升完全培养基到每口井停止胰蛋白酶。摇板。轻轻悬浮细胞用吸管，并从各孔转移悬浮液到FACS管。离心管，在150×g离心4分钟，在4℃。
    4. 小心倒出上清液，用一招。添加冰冷的PBS 500微升到每个FACS管中，轻轻地重新悬浮细胞。保持冰管，直到结束的实验。
  2. 分析计算
    1. 分析通过流式细胞术细胞。激发，使用488nm的氩激光器波长和用于检测使用530nm的波长。通过运行阴性对照细胞建立细胞仪参数的流动。使用这些参数来分析处理的细胞（ 图4A）。用制造商的软件对数据进行评估，确定平均荧光强度（MFI）值，并且计算相对的MFI值。

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结果

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激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）获得的图像提供有关的GnRH-FITC结合物在给定的细胞培养的时间和浓度依赖性摄取壮观信息。在与这些的GnRH-FITC缀合物的同时，促性腺激素释放激素-1R的细胞表面上的存在也由CLSM实验验证。另外，通过使用一远红DNA染色荧光探针，能够为了对细胞的细胞核以外的GnRH和GnRH的-1R。然而，虽然共焦图像不是量化的，简单的"GnRH的摄入法"可以容易地估计所测试的细胞是否含有较高或较低量的GnRH-FITC缀合物。所施加的GnRH-FITC缀合物，它们的浓度和处理的时间是可变的在该方法中，根据需要。正如图1所示不同的癌细胞含有以浓度依赖性的方式不同级别的GnRH-FITC的。

先进"的GnRH-IR的表达方法"描述了细胞表面的GnRH-IR的可视化免疫细胞化学，前后的GnRH-FITC治疗。在此方法（GnRH的FITC处理前）的第一部分中，我们通过免疫细胞化学形象化的GnRH-IR，而不的GnRH-FITC治疗。在此方法（GnRH的FITC处理之后）的第二部分，我们把细胞与10μM的GnRH的...

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讨论

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本文所述实验中使用的选择性标记GnRH类似物进行筛选粘附 细胞培养体外 。共聚焦显微镜和流式细胞仪方法适合于跟踪和量化以时间和浓度依赖的方式，这些的GnRH-FITC缀合物的细胞摄取。这些实验有以下关键步骤:1）保持无菌的，健康的细胞培养物; 2）的GnRH肽必须是高质量的; 3）合理的浓度和孵育时间必须遵循; 4）一种治疗和洗涤步骤; 5）以及调整仪器设置。

细胞保持在（V / V）胎牛血清和抗生素（完全培养基）补充有10％的生产商推荐的介质。细胞应保持并在无菌环境中进行处理，直到处理步骤（与的GnRH-FITC缀合物）。实验前，检查使用倒置显微镜细胞。他们应该是健康的，连接必须达到规定的数量。

使用的GnRH肽以高品质和纯度是重要的。我们合成这些肽纯化他们超过98％的18岁 。所述肽可以储存在-25℃冰箱中作为冻干粉末。在10毫的GnRH-FITC储液在DMSO应保持在室温下暗处和几周内用完。我们研究了这些缀合物的稳定性，发现它们是稳定的在...

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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该项目得到了国家研究基金 OTKA （K 104045） 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EBC-1JCRB 细胞库JCRB0820人肺鳞状细胞癌
BxPC-3ATCCCRL-1687人胰腺癌
Detroit-562ATCCCCL-138人咽癌
含 L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基LonzaBE12-702FBxPC-3 细胞
Eagle's Minimum Essential 培养基培养基LonzaBE12-611FEBC-1 细胞的培养基，并辅以 0.1% 丙酮酸钠的 Detroit-562 细胞
胎牛血清Euro CloneECS0180L补充培养基
MycoZap Plus-CL LonzaVZA-2012补充培养基（抗生素）
标准系细胞培养瓶VWR10062-872为细胞提供一致、无菌的生长环境
胰蛋白酶-EDTA 混合物 LonzaBE17-161E去除附着的细胞
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）LonzaBE17-516F溶剂
二甲基亚砜Sigma-AldrichD8418-100ML溶剂
盼蓝溶液，0.4%Thermo Fisher Scientific15250061用于细胞计数
[D-Lys6（FITC）]-GnRH-I由我们制造-纯度 >98% （HPLC）
[D-Lys6（FITC）]-GnRH-II由我们制造-纯度和ge;98% （HPLC）
[Lys8（FITC）]-GnRH-III由我们制造-纯度和ge;98% （HPLC）
玻璃底 8 孔显微镜载玻片Ibidi80826用于 CLSM 实验
康宁 Costar 细胞培养板，12 孔Sigma-AldrichCLS3513-50EA用于 FACS 实验
固定液（10% 中性缓冲福尔马林）Bio-Optica01V60P固定贴壁细胞
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906-10G防止抗体的非特异性结合
GnRHR 抗体Proteintech19950-1-AP免疫细胞化学试剂，与人 I 型 GnRH 受体结合
二抗，Alexa Fluor 546 偶联物Thermo Fisher ScientificA11035免疫细胞化学试剂，与一抗结合
荧光探针溶液 （Draq5）Thermo Fisher Scientific62254复染细胞核
荧光安装剂 水性封片剂Sigma-AldrichF4680-25ML用于 CLSM 实验，保留荧光
倒置显微镜Elektro-Optika Ltd. Alpha XDS-2T检查细胞培养物的表型和汇合度
倒置共聚焦激光扫描显微镜蔡司LSM-710在 CLSM 实验中的应用
式细胞仪BD BiosciencesBD FACSCalibur在 FACS 实验中的应用
培养基 用于 台流

参考文献

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