囊性纤维化（CF）患者的气道被黏液堵塞，为微生物病原体的生长提供了理想的环境。本文描述了一种研究CF肺部微生物组的新方法，该方法在模拟病原体致病环境的条件下进行，并可探究化学条件的改变如何驱动微生物群落的动态变化。
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摘要
摘要
许多慢性气道疾病会导致气道被黏液堵塞。囊性纤维化患者的肺部就是一个典型例子，其被黏液堵塞的细支气管为微生物定植提供了有利环境。多种病原体在这一环境中相互作用并蓬勃生长，导致囊性纤维化（CF）相关疾病的诸多症状。与任何微生物群落一样，其栖息地的化学条件对群落结构和动态具有显著影响。例如，不同微生物在氧气或其他溶质浓度不同的条件下生长状况各异。在囊性纤维化患者的肺部也是如此，氧气浓度被认为驱动着微生物群落的生理特性和结构组成。本文所述方法旨在模拟肺部环境，以更接近病原体致病时的自然状态来培养这些病原体。通过调控这些微生物所处的化学环境，可研究肺部感染的化学特性如何调控其微生物生态。该方法称为WinCF系统，基于人工痰液培养基和细毛细管，旨在建立类似于黏液堵塞细支气管中存在的氧气梯度。通过调节化学条件，如痰液培养基的pH值或抗生素压力，可利用显色指示剂、观察气体或生物膜的产生，或提取并测序各样本中的核酸成分，从而可视化不同样本间的微生物学差异。
引言
本文所述方法称为WinCF系统1。WinCF的总体目标是提供一种能够模拟充满黏液的肺细支气管环境的实验装置。这将建立一个可操作的系统，用于研究具有黏液过度分泌表型的肺部疾病中的微生物病原体，包括囊性纤维化（CF）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘及其他相关疾病。该实验流程最初专为CF研究而设计，CF的特征是基因突变导致肺部分泌物变厚且难以清除，最终使细支气管和其他小气道被黏液充满2。肺部此类阻塞会抑制气体交换，因为吸入的空气无法再到达许多肺泡，同时也为细菌定植提供了生存环境3,4。由于无法抑制过量肺黏液中的微生物生长，最终导致呼吸道形成复杂的慢性感染。这些微生物群落包含多种生物体，包括病毒、真菌以及如Pseudomonas aeruginosa等细菌，它们之间相互作用5,6,7,8。CF患者肺部微生物组的活动被认为与症状急性加重（称为肺部急性加重）有关1,
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方案
1. 人工痰培养基储备液的制备
- 配制5%的黏蛋白溶液。将1.0 g脱水猪胃黏蛋白加入20 mL去离子水中。对所得溶液进行高压灭菌。
注意：黏蛋白的灭菌会破坏其固有结构；其他对干燥形式黏蛋白进行灭菌的方法包括紫外线灭菌和辐照灭菌。然而，这些方法在WinCF系统中尚未被广泛使用。 - 将2.2 g KCl加入50 mL去离子水中，搅拌至溶解。将5.0 g NaCl加入50 mL去离子水中，搅拌至溶解。对这两种溶液进行高压灭菌。
- 将100 mg鲑鱼精子DNA加入10 mL无菌去离子水中。将该溶液加热至约 85 °C 在水浴中放置数小时以确保溶解。
- 将5.0 mg的铁蛋白加入5.0 mL无菌去离子水中。
2. 人工痰液培养基的制备
- 混合以下组分：16 mL 黏蛋白储备液、2.0 mL KCl 储备液、2.0 mL NaCl 储备液， 200 µL 卵黄乳剂，5.6 mL DNA 储存液 120 µL 5.78 mL 基本氨基酸溶液、5.78 mL 非必需氨基酸溶液和 2.44 mL 无菌水。
- 若出现少量沉淀，轻轻振荡混匀。
- 将5.0 mL培养基移液至八个无菌的15 mL离心管中。
注意：可根据需要调整每个试管的化学条件。例如，可向各试管中添加缓冲溶液和 pH 指示剂，以比较微生物在不同 pH 水平下的....
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结果
在不同样本所诱导的化学条件下，微生物的生长情况在某些情况下差异极为显著，在其他情况下则变化较为细微。许多活性变化在性质上是可视的，在培养期结束后立即明显可见。以pH值调控为例，经过培养后，pH谱系中各样本在多个指标上表现出显著差异。当未向培养基中添加痰液样本时，经过48小时培养后，pH谱系中唯一观察到的变化是由于轻微蒸发导致的培养基体积略微减少（图9）。而接种后的毛细管则表现出体积变化、气泡生成、颜色改变以及出现不透明沉淀物（图10）。
图9： pH梯度示例，对照运行，孵.......
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讨论
囊性纤维化（CF）患者肺部的微生物组成包含多种多样的生物体，但肺内环境条件可能对哪些类型的微生物能够存活和增殖具有显著影响13,15。目前，这些条件发生变化的具体机制及其对肺部微生物组的确切影响尚不明确。在本实验方法中，我们基于模拟肺细支气管中人为调控的化学条件，对微生物学变化进行了分析。
该实验方案中有一些关键步骤。在添加痰液样本之前，保持人工痰液培养基的无菌状态至关重要，尤其是在考虑所分析环境的微生物组时。外源微生物可能会改变条件，干扰细支气管模拟的准确性，还可能在使用的痰液样本中与目标病原体竞争，从而影响孵育后变化的任何分析结果。毛细管必须水平孵育，这一点至关重要。因为水平放置有助于观察气体的产生。如果将毛细管垂直孵育，所产生的气体可能会上升并逸出培养基，导致看似完全没有气体产生。封闭两端可促进更多气体生成并防止气体逸失，但这会破坏所需的氧气梯度。
该方案可根据多种因素进行修改，从培养基的化学成分到接种样.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢Vertex Pharmaceuticals和囊性纤维化研究创新奖对R. Quinn的资助，以及美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）提供的资助项目1 U01 AI124316-01，该项目采用系统生物学方法治疗多重耐药病原体。我们还要感谢加州大学圣地亚哥分校（UCSD）机械与航空航天工程系的本科机械工程高年级设计课程，为本研究在工程方面的合作提供了支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 彩色编码毛细管 | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal 管封合剂 | Kimble-Chase | 43510 | |
| 猪胃黏蛋白 | Sigma | M1778 | |
| 阳离子化马脾铁蛋白 | Sigma | F7879 | |
| 鲑鱼精DNA钠盐（超声处理） | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM非必需氨基酸 | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM氨基酸 | Cellgro | 25-030-CI | |
| 蛋黄乳剂，50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| 氯化钾 | Fisher Scientific | P2157500 | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15 mL 带刻度和平盖的离心管 | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL 带刻度和平盖的离心管 | VWR | 89039-656 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0 mL 微量离心管 | Corning | MCT-200-C |
参考文献
- Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secreti....
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