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诱导与定量细胞衰老的技术

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DOI：

10.3791/55533

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2017年5月1日

 , 
1Laboratory of Epidemiology and Population Science, National Institute on Aging, National Institutes of Health

本文内容

摘要

细胞衰老是一种不可逆的细胞周期停滞状态，可由多种细胞应激因素诱导。本文描述了诱导细胞衰老的实验方案以及检测衰老标志物的方法。

摘要

在细胞应激或损伤的条件下，增殖中的细胞可启动一种特定程序，引发长期的细胞周期停滞状态，称为细胞衰老。衰老细胞在机体衰老过程中以及持续培养条件下会逐渐积累。 体外衰老细胞影响多种生物学过程，包括胚胎发育、组织修复与再生、肿瘤抑制以及衰老。衰老细胞的特征包括但不限于衰老相关β-半乳糖苷酶活性升高（SA-β-gal）；p16INK4Ap53 和 p21 水平升高；DNA 损伤水平增加，包括 γ-H2AX；衰老相关异染色质灶（SAHF）的形成；以及获得衰老相关分泌表型（SASP），后者特征为分泌多种促炎性细胞因子和信号分子。本文中，我们描述了在培养细胞中诱导复制性衰老和DNA损伤诱导性衰老的实验方案。此外，我们介绍了利用多种衰老相关标志物监测衰老表型的技术，包括SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、γ-H2AX 和 SAHF 染色，以及细胞周期调控因子和 SASP 因子的蛋白和 mRNA 水平的定量方法。这些方法可应用于不同模型和组织中衰老状态的评估。

引言

半个多世纪前，Hayflick 及其同事描述了未转化细胞在培养中只能进行有限时间的增殖1。长期培养人成纤维细胞会导致细胞停止增殖，但这些细胞仍具有代谢活性，这种现象被称为细胞衰老。衰老在抑制肿瘤发生方面可能具有有益作用，但也可能带来不利影响，因为它被认为会促进随年龄增长而出现的再生能力下降2,3。研究表明，随着人类年龄增长，衰老细胞会在组织中积累4，并被发现参与多种生物学过程，包括胚胎发育、伤口愈合、组织修复以及与年龄相关的炎症反应2。

细胞在培养过程中持续传代会诱导复制性衰老，这种现象与端粒缩短和基因组不稳定性相关。多种细胞应激因素，包括DNA损伤和癌基因，也可导致细胞衰老3。由端粒缩短以外因素引起的衰老通常被称为应激诱导性衰老或早衰，通常依赖于p16INK4A/Rb信号通路5。尽管增殖中的未转化细胞通常呈梭形，衰老细胞则具有一些特定特征，例如扁平且体积增大的形态，以及升高的衰老相关β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）（图1 & 2）。衰老细胞还会积累DNA损伤标志物，如γ-H2AX（图3）6，以及可能存在的衰老相关异染色质灶（SAHF）（图4）7。衰老细胞中细胞周期调控因子的水平升高，包括p16（p16INK4A）和/或p21及p53（图5）8,9。此外，最新研究表明，衰老细胞可通过分泌多种促炎性细胞因子和趋化因子（称为衰老相关分泌表型，SASP）产生非自主性效应10。尽管这种SASP现象在不同细胞类型之间可能存在差异，但通常表现为白细胞介素-6（IL-6）、IL-8、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、生长调节癌基因α（GRO-α）和GRO-β等因子的增加（图6）。诱导衰老的特定应激或损伤类型也可能影响其分泌表型11,12,13。SASP可通过ELISA或细胞因子/蛋白质芯片检测分泌蛋白的水平来评估10,14。尽管转录后机制可调控SASP蛋白水平11,15,16,17，但在许多情况下也可检测到mRNA水平的变化。这些变化通常比蛋白质水平的检测更为敏感且易于定量。其他衰老标志物也可进行评估，包括持续存在的DNA损伤灶，即染色质改变强化衰老的DNA片段（DNA-SCARS）18，以及其他多种标志物3,19,20。

本文介绍了在体外培养细胞中诱导细胞衰老的常用技术，以及检测多种衰老标志物的方法，包括SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）、γ-H2AX、衰老相关异染色质灶（SAHF），以及衰老相关分子的蛋白质和mRNA。

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方案

1. 诱导复制性衰老

  1. 解冻低传代人二倍体成纤维细胞（例如， WI-38 和 IMR-90）或其他细胞系。
    注意：此处使用了人二倍体成纤维细胞，但这些方案也可用于评估其他细胞类型的衰老，例如内皮细胞、上皮细胞或间充质干细胞。由于不同细胞类型的增殖速率或生长条件存在差异，培养条件可能需要针对具体细胞类型进行优化。
    注意：细胞应处于增殖状态，并呈现纺锤形形态（参见 图1 示意图及 图2 例如）。理想情况下，细胞的群体倍增水平（PDL）应为 <实验开始时使用第30代细胞，以避免可能存在的复制性衰老细胞。
    1. 使用以下公式计算细胞的群体倍增水平（PDL）：PDL = log(Nf/N0)/log₂，其中 Nf 是最终的细胞数量 N0 是接种细胞的初始数量21.
  2. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、1%非必需氨基酸和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养WI-38细胞。
  3. 在添加了10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养IMR-90细胞。
  4. 所有细胞均在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养2. 持续培养细胞，当细胞融合度达到约70–80%时，每2–4天传代一次。使用光学显微镜监测细胞融合度。避免细胞融合度过高，因为接触抑制可能影响细胞生长。
  5. 在光学显微镜下观察细胞，检测衰老细胞的形态学特征（参见 图1 & 2以及当连续传代之间群体倍增水平（PDL）无变化时。

2. DNA损伤诱导的衰老

  1. 接种细胞（例如， WI-38、IMR-90 或其他细胞类型）以低密度接种（即 ~300,000 个细胞/6 cm 培养皿）置于适合分析类型的培养皿中（即 6 厘米培养皿用于蛋白/RNA 标志物检测，或 6 孔板用于 SA-β-gal 染色）。使用早期传代、年轻且处于增殖状态的细胞（<30 PDL）并接种，使细胞在次日融合度约为50–60%。
  2. 使用连接真空泵的玻璃移液管吸除培养基，加入1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。重复此步骤，共洗涤两次。在6 cm培养皿中加入一层薄PBS（约750 µL），用于后续操作 "对照" 经处理和经电离辐射（IR）处理的条件。
  3. 使用γ射线辐照仪对细胞进行单次10 Gy的电离辐射处理；该剂量适用于大多数细胞系。在生物安全柜中移除PBS，并更换为生长培养基。或者，用20 µg/mL博来霉素处理细胞2小时。
  4. 每 48–72 小时更换一次细胞培养基，必要时进行细胞传代。
  5. 在光学显微镜下观察细胞的形态学变化（参见 图1 示意图及 图2 用于获取代表性细胞图像，并在电离辐射处理后7-10天检测衰老标志物。
    注意：本方案描述的是由电离辐射（IR）诱导的衰老。衰老也可由其他应激因素诱导，包括博来霉素（诱导条件见上文）、H2O222,23，化疗药物24，香烟烟雾25转化生长因子（TGF）-β126,27以及其他方法21,28,29.

3. 衰老相关β-半乳糖苷酶染色细胞

  1. 染色前，在光学显微镜下观察细胞，以监测形态学变化。
    注意：衰老细胞通常体积增大且呈扁平状，而增殖细胞则具有梭形形态（参见 图1 示意图及 图2 用于代表性结果）。增殖中的细胞可用作阴性对照，经电离辐射（IR）或其他DNA损伤剂处理的细胞（见第2节）可用作阳性对照。
  2. 使用商业试剂盒中的试剂定量检测SA-β-gal活性（参见 材料表将所有试剂解冻，并在37 °C下升温至室温。
    1. 计算所需的染色液和固定液的用量。
      注意：通常情况下，1 mL 体积足以用于 6 孔板中的一个孔。可使用不同规格的培养板，但 6 孔板的尺寸非常适合为每种条件设置三个重复孔进行实验。该密度通常可在每个视野中提供足够数量的细胞用于计数，同时避免使用过多的细胞。
    2. 用蒸馏水将染色液按1:10比例稀释。
    3. 用蒸馏水将固定液按1:10比例稀释。
    4. 配制 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷）的 20 倍储存液，溶剂为 N,N-二甲基甲酰胺（DMF； 例如， 20 mg X-gal 溶于 1 mL DMF 中。为最大限度利用试剂盒，可根据每次实验所需量称取 X-gal，再加入计算好的 DMF 体积进行溶解。或者，将储备液置于避光的离心管中，于 -20 °C 保存一个月。稀释和储存 X-gal 溶液时，仅使用聚丙烯（不透明）离心管。
    5. 配制β-半乳糖苷酶染色液：取930 µL 1x染色液、10 µL 染色增强剂A、10 µL 染色增强剂B，以及50 µL DMF溶解的20 mg/mL X-gal溶液。根据需要染色的孔数配制相应体积的总混合液。
  3. 使用移液管或同等工具小心地从细胞中移除培养基。
  4. 用室温的1× PBS轻轻洗涤细胞一次。
  5. 向每个孔中加入1 mL 1×固定液，室温孵育10–15分钟。
  6. 用移液管移除固定液。
    注意：固定液（1x）含有2%甲醛和0.2%戊二醛，应根据实验室安全办公室的建议作为危险废物处理。
  7. 用1×PBS轻轻洗涤细胞两次。
  8. 完全吸除 PBS，向孔中加入 1× β-gal 染色液（每孔 1 mL，适用于 6 孔板）。用铝箔完全包裹培养板，于 37 °C 培养箱中孵育 24–48 小时（最好在无 CO₂ 条件下）2，因为这会降低缓冲液的pH值并影响染色效果。
    1. 24小时后观察细胞染色情况，若染色过浅，继续孵育24小时。
  9. 孵育结束后，吸除β-gal溶液，加入1x PBS替代。
    注意：此步骤可在成像时减少部分背景颜色，同时防止X-gal溶液发生危险溢出。
    注意：请根据实验室安全办公室的建议，妥善处理 β-gal 溶液。
  10. 使用带有摄像头的光学显微镜，采用10倍或更高倍数的物镜观察细胞；SA-β-gal阳性细胞呈蓝色。根据实验需求采集相应数量的图像。若需统计SA-β-gal阳性细胞百分比，则应采集足够数量的图像>5) 每孔定量分析时，确保各孔内不同视野的图像互不重叠。
  11. 计数SA-β-gal阳性（蓝色）细胞数量与总细胞数量，计算SA-β-gal阳性细胞所占百分比。计数 >每种条件下100个细胞。
    注意：代表性图片也可用于配图。若需进行细胞计数，应注意细胞汇合度至关重要，细胞过多将难以区分单个细胞，而过少则可能无法提供足够的细胞数量用于定量分析和统计。用于发表的图片应以最高分辨率保存为 .tiff 文件格式，尽管 .jpeg 文件格式也可接受。彩色图像的分辨率应为 300 dpi。

4. γ-H2AX 细胞染色

  1. 将第1或第2部分的细胞接种于24孔板中的玻璃盖玻片上。
  2. 次日，用1× PBS洗涤细胞。冲洗时需小心，因为衰老细胞与盖玻片的黏附性较差，容易在洗涤过程中脱落。也可选择不洗涤，直接固定细胞。
  3. 吸除PBS，加入新配制的含3.7%甲醛的PBS溶液，室温固定10分钟。
  4. 吸除溶液，用含0.2% Triton X-100的PBS溶液室温透化10分钟。
  5. 吸除溶液，用含5% FBS的PBS溶液室温封闭2小时。
  6. 在含5% FBS的PBS溶液中加入抗-phospho γ-H2AX（Ser139）抗体及其FITC偶联物，37 °C孵育2小时，或4 °C过夜孵育。避光操作。
  7. 用37 °C的PBS洗涤3–6次 ，总洗涤时间30–60分钟。
  8. 用DAPI（以PBS稀释1:15,000）室温染色10分钟。
  9. 用PBS洗涤3次。
  10. 快速用去离子水漂洗以去除盐分，然后取3–5 µL抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固于载玻片上。也可使用含DAPI的封片液。
  11. 室温避光干燥过夜，使用63倍或更高倍数的物镜在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察染色细胞。
  12. 采用以下两种方法之一对γ-H2AX焦点进行定量。可通过荧光显微镜目视评分；理想情况下建议使用共聚焦显微镜。采集Z轴层扫图像并合并为单一平面，以观察所有可检测到的焦点（增殖细胞与衰老细胞中γ-H2AX染色的代表性图像见图3）。使用成像软件人工计数焦点数量；通常计数约100–200个细胞核即可。
    1. 为定量具有γ-H2AX阳性焦点的细胞百分比，统计至少含有一个可见焦点的细胞数，并除以DAPI染色的总细胞核数。
    2. 为定量γ-H2AX焦点数量，统计每个细胞内的γ-H2AX焦点数目。
      注意：γ-H2AX水平可能因诱导衰老的具体应激源或损伤类型而异。

5. 对SAHF标志物进行细胞染色

注意：人类衰老细胞的细胞核中常出现浓缩的 DNA/染色质区域。在衰老细胞中，这些异染色质区域被认为可抑制增殖促进基因（如 E2F 家族成员）的表达。SAHF 可通过 DAPI 的重新分布、异染色质相关组蛋白修饰标志（包括组蛋白 H3 第 9 位赖氨酸的二甲基化和三甲基化，即 H3K9Me2 和 H3K9Me3）以及染色质重排蛋白（如 HP-1 异染色质蛋白 1（HP1）、HIRA（组蛋白抑制因子 A）和 ASF1a（抗沉默功能蛋白 1a））在染色质上的富集来观察30。我们选择使用癌基因诱导的衰老模型（OIS），因为 SAHF 在 OIS 模型中更为显著30。IDH4 细胞在地塞米松存在下因表达 SV40 大 T 抗原而持续增殖，但在培养基中去除地塞米松后会进入衰老状态31。SAHF 可通过 DAPI 染色以及针对上述特异性标志物的抗体染色进行检测。本文中，我们描述了使用 DAPI 和 H3K9Me2 染色来观察细胞中 SAHF 的方法28。

  1. 在添加了10% FBS、1%青霉素/链霉素和1 µg/mL地塞米松的DMEM培养基中培养IDH4细胞。为诱导细胞衰老，去除地塞米松，并更换含有活性炭处理FBS的培养基；在此新培养基中培养约10天后，IDH4细胞进入衰老状态。31.
  2. 将上述第1或第2部分所述的IDH4细胞或细胞接种于24孔板中的玻璃盖玻片上。
  3. 第二天，用1×PBS洗涤细胞。冲洗时需小心，因为衰老细胞与盖玻片的黏附性较差，容易在洗涤过程中脱落。或者，也可不进行洗涤，直接固定细胞。
  4. 吸除 PBS，加入新配制的含 3.7% 甲醛的 PBS 溶液，室温固定细胞 10 分钟。
  5. 用1×PBS洗涤细胞3次。
  6. 吸除溶液，加入含0.2% Triton X-100的PBS溶液孵育5分钟以透化细胞。
  7. 用1×PBS洗涤细胞。移除PBS后，加入含3% BSA（w/v）的PBS封闭液，在室温下封闭5分钟。含有BSA的溶液在使用前应始终过滤，以去除颗粒物。
  8. 除去封闭缓冲液，加入针对SAHF标志物的一抗（如抗H3KMe2抗体）孵育细胞图4；参见 材料表 详细信息参见相关说明）。用封闭缓冲液稀释抗体，在室温下孵育1–2小时。
  9. 移除一抗溶液，用含1% (v/v) Triton X-100的PBS洗涤盖玻片3次。
  10. 用封闭缓冲液稀释二抗（材料表）室温孵育1小时，避光。
  11. 用1×PBS洗涤细胞两次。用DAPI（以PBS按1:15,000稀释；参见 材料表室温下孵育10分钟。
  12. 用1×PBS洗涤盖玻片3次。
    1. 用清水快速洗涤以去除盐分，然后将每张盖玻片用 3–5 µL 抗荧光淬灭试剂封固在载玻片上。或者，可使用含 DAPI 的封片液。
    2. 过夜干燥，并使用63倍或更高倍数的物镜在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察染色后的细胞（参见代表性结果部分）。 图 4）。按照第4节所述方法对SAHF进行定量分析。
      注意：同型对照一抗或不加一抗（即 仅使用二抗作为免疫荧光染色的阴性对照。

6. 通过免疫印迹分析衰老相关蛋白

注意：衰老表型的特征是细胞周期调控因子的上调，包括 p16INK4A、p21 和 p53。本方案将描述如何在细胞裂解液中定量这些蛋白的表达水平。这些技术可用于评估通过多种方法诱导的细胞衰老21,28,29。

  1. 按照第1和第2节所述方法或采用其他方法诱导细胞衰老21,28,29为分析细胞衰老标志物，将细胞接种于6 cm培养皿中，并同时分析蛋白质和RNA（RNA提取步骤详见第7节）。
  2. 移除细胞培养基，将细胞置于冰盘上。
    1. 用预冷的1×PBS洗涤细胞2次。倾斜培养皿，确保吸净所有PBS，以保证操作中所用体积的准确性。
    2. 吸尽最后一次 PBS 洗涤液后，向培养皿中加入 200 µL 冷的 1x PBS（适用于 6 cm 培养皿）。使用细胞刮刀刮取细胞。
    3. 将细胞/PBS 混合液用移液器转移至无RNase的离心管中用于RNA提取。取约150 µL该混合液，用移液器转入新离心管中。此分装样品将用于蛋白质分析，因此务必从每管中移取相同体积的混合液。
  3. 通过加入75–100 µL改良的2倍Laemmli上样缓冲液（含60 mM Tris-HCl pH 6.8、12.5%甘油、2% SDS、5% β-巯基乙醇（BME）和溴酚蓝；可大量配制，分装后于-20 °C保存备用）或其他等效的上样缓冲液裂解细胞。
    1. 或者，用75–100 µL裂解缓冲液裂解细胞，在4 °C下以15,000 × g离心10分钟以去除细胞碎片。收集上清液并用移液器转移至洁净离心管中。可对裂解液进行Bradford蛋白定量检测或其他等效的蛋白定量检测，以确保蛋白上样量均等。
      注意：使用上样缓冲液裂解的样品不能用于蛋白质检测。
    2. 取出约 25 µL 裂解液，加入 15 µL 2x 上样缓冲液中。用移液器在上样缓冲液中上下吹打，以充分裂解细胞。
      注意：裂解缓冲液或上样缓冲液的体积可根据细胞融合度进行调整。如果样品为 "黏稠的" 由于细胞核裂解，需加入更多上样缓冲液或PBS进行稀释。样品可于-20 °C保存，直至使用。
  4. 将样品在95 °C的加热块（或等效设备）上煮沸5分钟，并将约40 µL裂解后的样品加入上样缓冲液中，上样至18% Tris-甘氨酸凝胶。
    注意：梯度胶（4-15%）或14% Tris-甘氨酸胶也适用于低分子量蛋白的检测。也可使用其他类型的丙烯酰胺凝胶，但需确保所用凝胶及系统适合低分子量蛋白的检测。
    1. 使用1×电泳缓冲液，先以恒定100 V电压运行20分钟（通过浓缩胶），随后以约180 V电压继续运行约60分钟。密切观察电泳过程，使染料前沿刚好到达凝胶底部或即将跑出凝胶，以防止低分子量蛋白逸出凝胶。
  5. 将丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜（预先用100%甲醇浸泡以活化）。若采用湿转法，转移时间仅需1小时（相较于常规的约1.75小时）。应根据所使用的适当转移系统进行相应调整；使用预染蛋白分子量标记物有助于评估转移效率。
  6. 用清水洗涤膜。使用丽春红染色以监测样品上样量是否均一。用清水洗去丽春红染色。
    1. 在含5%脱脂奶粉的TBST（50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，0.1% Tween-20）中室温孵育1小时或4℃过夜封闭膜 在 4 °C 下振荡孵育。
  7. 用TBST洗涤印迹膜一次，然后在5%脱脂牛奶TBST溶液中加入一抗进行孵育（参见 材料表 在室温下孵育1小时（具体稀释比例和抗体推荐用量见相关说明）。
  8. 用 TBST 快速洗涤两次，然后在摇床上洗涤两次，每次约 15 分钟，共约 30 分钟。
  9. 室温下用二抗孵育40分钟。重复步骤6.10。
  10. 加入新鲜配制的Western blot底物孵育，显影胶片或使用化学发光检测仪读取结果。
  11. 用p16探针进行免疫印迹杂交INK4A 抗体优先图5）将膜依次置于水中孵育15分钟，0.2 N NaOH中孵育15分钟，再于水中孵育15分钟，进行膜剥离。随后使用抗p21抗体继续进行步骤6.9。
  12. 使用含有 300 µL 新鲜添加的 BME（每 50 mL 剥脱液）的 62.5 mM Tris-HCl（pH 6.8）和 2% SDS 溶液进行膜剥离。
  13. 在50 °C孵育30分钟，用TBS充分洗涤，随后用TBST洗涤。使用抗肌动蛋白（anti-actin）或抗GAPDH抗体进行探针杂交，作为蛋白上样量对照（图5 显示代表性结果。
    注意：p53 水平也可在同一膜上进行检测。但由于 p53 分子量较大，在较低浓度的凝胶中分离效果更佳（例如， 10% Tris-甘氨酸凝胶或梯度凝胶（4–15%）。也可通过免疫印迹法检测其他衰老标志物的蛋白水平，包括γ-H2AX和SAHF标志物。

7. 分析衰老标志物的 mRNA 水平

注意：在分离RNA时，应确保工作表面已使用RNase去除溶液或等效试剂清洁，并且所有材料均为无RNase的。

  1. 使用步骤 4.2 中的细胞/PBS 混合液，加入 1 mL RNA 提取液并涡旋振荡 30 秒（不应有可见的团块或细胞碎片）。
  2. 加入 200 µL 氯仿，剧烈震荡 15 秒。
  3. 在 4 °C 条件下以最大速度（>15,000 × g）离心 15 分钟。
  4. 吸取约 400 µL 上层 RNA 水相层，并将其转移至新的微量离心管中。
  5. 向 RNA 层中加入 400 µL 异丙醇（与上一步转移的水相层总体积 1:1）和 4 µL 沉淀剂。
  6. 在 4 °C 条件下以最大速度（>15,000 × g）离心 15–30 分钟，使 RNA 沉淀成团。
  7. 弃去上清液，加入 1 mL 75% 冰乙醇。
  8. 在 4 °C 条件下以最大速度（>15,000 × g）离心 1 分钟。
  9. 弃去上清液，在 4 °C 条件下以最大速度（>15,000 × g）再离心 1 分钟。
  10. 尽可能吸出残留液体，并在空气中干燥 2 分钟。
  11. 用 10 µL 10× DNase 缓冲液、85 µL H2O 和 5 µL DNase 1 重悬 RNA 沉淀。
  12. 在 37 °C 下孵育 30 分钟。
  13. 加入 200 µL NT2 缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM MgCl2，0.05% Nonidet P-40），再加入 300 µL 酸性酚-CHCl3 的下层液体。
  14. 涡旋振荡 1 分钟，在室温下以最大速度（>15,000 × g）离心 5 分钟。
  15. 收集 250 µL 上层 RNA 液相（分两次，每次 125 µL），加入 25 µL 3 M 醋酸钠（pH 5.2）、625 µL 100% 冰乙醇和 5 µL 沉淀剂。充分混匀后，在 -20 °C 下过夜沉淀。
  16. 次日，混匀后在 4 °C 条件下以最大速度（>15,000 × g）离心 30 分钟，弃去上清液。
  17. 重复步骤 6.8–6.11。
  18. 将 RNA 沉淀重悬于 12 µL 无核酸酶水中，置于 -80 °C 保存备用。
    注：也可使用其他 RNA 提取方法或试剂盒。
  19. 按照制造商说明书，使用随机六聚体引物和 SSII 逆转录酶进行逆转录反应。
    注：由于从衰老细胞中提取的 RNA 量较低，建议将全部 RNA（12 µL）用于逆转录合成。或者，也可使用分光光度计对 RNA 进行定量，并使用等量 RNA 进行逆转录。
  20. 使用实时定量 qPCR（RT-qPCR）扩增结合 SYBR Green PCR 主混合液及基因特异性引物分析 mRNA 水平。
    1. 按照常规 RT-qPCR 反应操作，将 cDNA 稀释 30 倍（使用无 RNase/DNase 水），取 3 µL 加入实时定量 PCR 96 孔板中以提高移液准确性。配制反应主混合液：基因特异性正向与反向引物（终浓度 2.5 µM，每反应加 5 µL）、SYBR Green PCR 混合液（每反应 6.25 µL；用量低于制造商推荐值）以及 5.75 µL 无 RNase/DNase 水，最终反应体积为 20 µL（含 17 µL 引物/SYBR Green/水和 3 µL cDNA）。
    2. 使用实时定量 PCR 仪进行 RT-qPCR 扩增，操作遵循制造商说明书。
      注：经验证的人源正向与反向实时引物列表见表 1。这些基因包括 SASP 蛋白及其他衰老相关标志物和/或基因。IR 诱导衰老的代表性结果见图 6。

8. SASP 蛋白质水平的定量

  1. 使用第1节、第2节所述方法或其他方法诱导细胞衰老。将细胞接种于6孔板中 或10 cm培养皿，具体如上所述（约250,000个细胞/6 cm培养皿或约650,000个细胞/10 cm培养皿）。
  2. 使用IR处理后10天的细胞或复制性衰老细胞（及相应的对照细胞），用1×PBS洗涤细胞3次，加入含抗生素的无血清培养基，体积较小（6 cm培养皿加2.5 mL，10 cm培养皿加5 mL）。
  3. 37 °C、5% CO₂条件下过夜培养2 在组织培养孵育箱中. 第二天，收集培养基并将其放入冰上的锥形管中。
  4. 用 PBS 洗涤细胞 2 次，然后加入 1 mL 胰蛋白酶（适用于 6 cm 培养皿）。使用血细胞计数板对细胞进行计数，以便后续根据细胞数量调整浓度。
  5. 以 300 × g 离心培养基 5 分钟。
  6. 使用 0.45-µm 注射器滤器过滤培养基。
  7. 分装培养基，于 -80 °C 冻存，直至使用；或直接采用 ELISA 或等效方法进行检测。
  8. 通过将细胞总数除以收集的培养基体积，计算每毫升的细胞浓度。
  9. 根据制造商说明书进行适当的酶联免疫吸附测定（ELISA）。参见 材料表 有关检测IL-6、IL-8、GROα及其他细胞因子/趋化因子的推荐ELISA试剂盒（图6B).
  10. 为确保所检测因子处于ELISA试剂盒的线性范围内，需将衰老细胞培养基相对于增殖细胞培养基进行稀释。在计算IL-6含量时，需考虑这些稀释倍数及体积。为获得每细胞每天分泌的IL-6量，将试剂盒测得的IL-6值（单位为pg）除以稀释后的细胞浓度（来自步骤7.8，单位为每毫升细胞数）。
    注意：其他方法（如细胞因子阵列）可用于检测SASP蛋白水平，可能适用于高通量筛选大量SASP因子。SASP因子的蛋白水平可能因衰老诱导后的时间、细胞类型或所诱导的衰老类型而有所不同。

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结果

图2 - 6 展示SA-的代表性结果β-gal 染色；染色检测 γ-γH2AX 和 SAHF；p16 蛋白水平的检测INK4A、p21和p53；以及衰老相关分子的mRNA和蛋白质水平。升高的SA-β-gal染色可检测复制性衰老和DNA损伤诱导的衰老。同时观察衰老过程中出现的形态学变化：与增殖状态下的成纤维细胞呈梭形相比，衰老细胞体积增大、形态变扁平。在本实验范式中，细胞于电离辐射（IR）暴露后7天进行染色，并提取RNA和蛋白质。若在IR暴露后延长等待时间，可能获得更显著的结果即 10天）。每种条件和实验设置均需确定最佳实验条件。这些结果具有代表性，当使用其他方法诱导衰老时，也可检测到这些标志物。

对于图6，所列出的基因名称对应于CXCL1 （GROα）、CXCL2（GRO...

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讨论

在此，我们描述了利用人二倍体成纤维细胞进行复制性衰老和DNA损伤诱导衰老的方法。此外，还包括多种衰老相关蛋白的蛋白质和mRNA水平的定量技术，以及SA-β-半乳糖苷酶染色和DNA损伤标志物γ-H2AX的免疫染色。这些实验方案可广泛用于评估衰老表型 体外 和 体内，尽管在鉴定衰老特征时存在诸多注意事项 体内20其他细胞可能表达衰老标志物，即使它们并非真正的衰老细胞。例如，破骨细胞和巨噬细胞就具有较高的β-半乳糖苷酶活性32,33此外，许多癌细胞中p16表达上调INK4A 34细胞也可能积累DNA损伤（例如， γ-H2AX 焦点），且不应处于衰老状态。SASP 因子也可能在多种正常的生理或病理条件下被上调，而这些条件可能涉及也可能不涉及衰老细胞。因此，在评估细胞衰老时，应联合使用多种衰老标志物 体内.

尽管在20...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院衰老研究所的院内研究计划资助。作者谨此感谢 Myriam Gorospe 和 Kotb Abdelmohsen 就细胞衰老问题提出的诸多有益讨论，并感谢 Kotb Abdelmohsen 对手稿的审阅。我们同时感谢实验室成员，特别是 Douglas Dluzen 对手稿的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% Tris-甘氨酸凝胶InvitrogenXP00160BOX
酸-苯酚 ChCl3AmbionAM9720
Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠抗体InvitrogenA110311:300 稀释度
细胞刮刀康宁公司3008细胞刮刀
ECL 抗小鼠 HRP 标记抗体AmershamNA931V
ECL Plus 蛋白质印迹底物皮尔斯32132ECL
DAPI分子探针MP01306储存液：5 mg/mL，溶于 dH₂O2O
GAPDH 抗体圣克鲁斯sc-322331:1,000 - 5,000 稀释度
GlycoBlueAmbionAM9515
组蛋白H3二甲基化K9单克隆抗体Abcam12201:500 稀释度
人IL-6 Quantikine ELISA检测R&研发系统D6050
人IL-8 Quantikine ELISA检测R&D系统D8000C
人GROα Quantikine ELISA检测R&D系统DRG00
N-N-二甲基甲酰胺 SigmaD4551DMF
p16 单克隆抗体BD 生物科学51-1325gr1:500 稀释度
p21 单克隆抗体Millipore05-3451:750 稀释度
p53 单克隆抗体Santa Cruzsc-1261:500 稀释，克隆株 DO-1
磷酸化-H2AX（Ser139）FITC偶联抗体细胞信号传导97191:2,000 稀释度
功率 SYBR Green PCR 主混合液 应用生物系统公司4367659
预染蛋白质分子量标准伯乐（Bio-Rad）161-0374
ProLong Gold 抗荧光淬灭剂 InvitrogenP36930
PVDF膜 赛默飞世尔科技88518
衰老 ββ-半乳糖苷酶染色试剂盒细胞信号传导9860
TRIzolAmbion/Life Tech10296028

参考文献

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SA DNA SASP PCR ELISA

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