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哺乳动物细胞经细菌攻击后应激颗粒形成的免疫荧光分析

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DOI：

10.3791/55536

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2017年7月3日

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1Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, INSERM U786, Institut Pasteur, 2Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Laboratory of Intestinal Immunity, Institut Imagine-INSERM UMR 1163, Université Paris Descartes-Sorbonne Paris Cité

本文内容

摘要

我们描述了一种定性和定量分析哺乳动物细胞在受到细菌及多种不同应激刺激后应激颗粒形成的实验方法。该方案可用于研究多种宿主-细菌相互作用中的细胞应激颗粒反应。

摘要

对细胞组分进行荧光成像，是研究宿主-病原体相互作用的有效工具。病原体可影响感染细胞的多种特征，包括细胞器超微结构、细胞骨架网络的组织方式，以及应激颗粒（Stress Granule, SG）形成等细胞过程。阐明病原体如何干扰宿主细胞过程，是发病机制研究领域中重要且不可或缺的一部分。尽管某些表型差异可能肉眼可见，但对病原体攻击所诱导的细胞结构在定性和定量上的精确分析，对于确定实验组与对照组之间具有统计学意义的差异至关重要。应激颗粒的形成是一种进化上保守的应激反应，可引发抗病毒反应，长期以来已被用于病毒感染相关研究1。应激颗粒的形成还会影响信号转导级联反应，并可能带来其他尚未明确的生物学后果2。目前，针对病毒以外的病原体（如胞内细菌性病原体）所引发的应激颗粒反应的研究，正成为一个新兴的研究方向3。然而，即使在病毒研究体系中，对应激颗粒形成的定性与定量分析仍未被常规采用。本文介绍一种简单的方法，用于在未感染细胞以及感染了胞内细菌性病原体的细胞中诱导并表征应激颗粒的形成——该病原体可影响细胞在多种外源性应激条件下应激颗粒的生成。通过使用多种不同的应激颗粒标志物，结合 ICY（一种开源图像分析工具）中的斑点检测插件（spot detector plug-in），可实现对应激颗粒形成及其组分的分析。

引言

在细胞水平上可视化宿主与病原体的相互作用，是深入了解病原体致病策略以及识别关键细胞通路的有力方法。事实上，病原体可作为研究工具，用于定位重要的细胞靶点或结构，因为病原体在进化过程中已学会干扰核心细胞过程，以此作为自身存活或增殖的策略。通过重组表达带荧光标签的宿主蛋白，可实现对细胞组分的可视化。尽管这种方法能够实现实时分析，但构建特异性标记宿主蛋白的细胞系工作量大，且可能产生不良的副作用。更为便捷的方法是使用特异性抗体检测细胞因子，因为该方法可同时分析多个宿主因子，且不受特定细胞类型的限制。其缺点在于，免疫荧光分析需要对宿主细胞进行固定，因此仅能获得静态图像。然而，免疫荧光成像的一个重要优势在于，它易于进行定性和定量分析，进而可用于发现具有统计学显著性的差异，从而为宿主-病原体相互作用提供新的见解。

荧光图像分析程序是进行三维（3D）和四维（4D）分析的强大分析工具。然而，软件及其维护的高昂成本使得基于免费开源软件的方法更具广泛吸引力。使用生物图像分析软件进行细致的图像分析具有重要价值，因为它能够验证视觉分析结果，并在赋予统计学显著性时，提高对特定表型正确性的可信度。此前，应激颗粒（SGs）的分析依赖于免费的ImageJ软件，但该方法需要手动识别单个应激颗粒4。本文提供了一种利用免费开源生物图像分析软件ICY（http://icy.bioimageanalysis.org）在细菌感染背景下诱导并分析细胞内应激颗粒形成的实验方案。该生物图像分析软件内置了斑点检测程序，非常适用于应激颗粒分析。它允许在指定的兴趣区域（ROIs）内对自动检测过程进行精细调节，从而避免了对单个应激颗粒进行手动分析的需要，并消除了取样偏差。

许多环境应激可诱导应激颗粒（SGs）的形成，这些颗粒是细胞质中致密相态、无膜结构的聚集体，直径为 0.2 - 5 µm5,6。这种细胞应答在酵母、植物和哺乳动物中具有进化上的保守性，通常发生在全局蛋白质翻译受到抑制时。该过程涉及停滞的翻译起始复合物聚集形成SGs，SGs被认为是翻译失活mRNA的暂存场所，从而允许细胞中部分mRNA的选择性翻译。当应激去除后，SGs解体，全局蛋白质合成速率恢复。SGs的组成包括翻译起始因子、参与RNA代谢的蛋白质、RNA结合蛋白，以及支架蛋白和参与宿主细胞信号传导的因子2，尽管其确切组成可能因所施加的应激类型而异。诱导SG形成的环境因素包括氨基酸饥饿、紫外线照射、热休克、渗透压冲击、内质网应激、缺氧以及病毒感染2,7,8。目前在病毒如何诱导并干扰SG形成方面的研究已取得较大进展，而关于其他病原体（如细菌、真菌或原生动物病原体）如何影响这一细胞应激反应的研究仍较为有限1,7。

Shigella flexneri 是一种革兰氏阴性兼性胞内人类病原体，可引起严重腹泻或志贺菌病。志贺菌病是重要的公共卫生负担，每年导致5岁以下儿童约28,000例死亡9,10。S. flexneri 感染结肠上皮细胞，并通过劫持宿主细胞骨架成分实现细胞间传播11,12。上皮细胞感染支持S. flexneri在胞质内的复制，但感染的巨噬细胞会通过一种称为细胞焦亡的炎性细胞死亡过程而死亡。感染引发大量中性粒细胞募集，并导致严重炎症，伴随发热、氧化应激和组织破坏。因此，感染细胞不仅受到感染本身引起的内部应激（如高尔基体破坏、基因毒性应激和细胞骨架重排）的影响，还受到炎症过程所导致的环境应激的影响。

利用多种应激颗粒（SG）标志物对S. flexneri感染影响细胞响应环境应激能力的研究表明，感染会导致应激颗粒在组成上出现定性和定量的差异3。然而，目前对其他细菌病原体的相关研究仍十分有限。本文描述了一种实验方法，用于将胞内病原菌S. flexneri感染宿主细胞，施加不同类型的环境应激，标记应激颗粒组分，并对感染与非感染细胞中应激颗粒的形成及其组成进行定性和定量分析。该方法可广泛适用于其他细菌病原体的研究。此外，对应激颗粒形成的图像分析也可应用于病毒感染或其他病原体感染的研究，可用于分析感染过程中应激颗粒的形成，或感染对细胞响应外界应激而产生应激颗粒的影响。

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方案

1. 细菌与宿主细胞的制备

  1. 用无菌镊子将12 mm或14 mm的玻璃盖玻片分别转移至24孔板或12孔板中，每个实验条件对应一个孔。在超净台中通过紫外照射对盖玻片进行15分钟的灭菌处理。
    注意：应设置细菌攻击的对照孔以及外源性应激诱导SG形成的对照孔。
  2. 对于24孔板中直径为12 mm的盖玻片，每孔接种1 × 10⁵个细胞。5 哺乳动物细胞（例如， 将HeLa细胞接种到盖玻片上；用无菌移液器吸头轻轻按压盖玻片，使细胞贴附。于37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜，使细胞贴壁2 组织培养箱中，使用适合每种细胞类型的培养基进行培养。
    注意：接种细胞时应确保细胞在次日的融合度为40%–60%。
    1. 对于HeLa细胞，在添加非必需氨基酸（NEAA）和10%灭活胎牛血清（FCS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中孵育。将FCS置于56 °C水浴中加热30分钟以灭活补体，加热15分钟后轻柔旋转混匀一次。
  3. 用无菌移液枪头从保存在-80 °C冰箱中的细菌甘油储备液（20%甘油）中取出少量菌液，接种至标记好的平板上。用无菌接种环将细菌涂布于平板约10%的区域。取一个新的无菌接种环，穿过前一区域涂布出三条平行线，长度约为半个平板。再用新的无菌接种环依次穿过这些线，将细菌进一步划线至平板其余区域。将平板置于37 °C培养过夜（O/N）。
    1. 选择单个细菌菌落（例如，S. flexneri从新鲜划线的平板上挑取菌落。避免使用超过1周的细菌菌落。
    2. 对于 S. flexneri 菌株M90T，从新划线的胰蛋白胨大豆琼脂-0.1% 刚果红琼脂平板上挑取一个红色菌落，接种于15 mL离心管中的8 mL胰蛋白胨大豆液体培养基中；拧紧管盖，于30 °C、222 rpm振荡培养过夜。
      警告：不要使用大型白色菌落，因其已丢失毒力质粒，不具感染性。

2. 宿主细胞的细菌攻击

  1. 制备细菌以最大化其感染能力。
    1. 对于 S. flexneri，通过将150 µL过夜培养物接种至8 mL胰蛋白胨大豆琼脂中进行细菌传代培养，并在37 °C、222 rpm振荡培养至对数生长后期（约2 h），以诱导毒力基因表达并增强感染能力。
      1. 当菌液在600 nm处的光密度值介于0.6至0.9之间时，取1 mL菌液转移至1.5 mL离心管中。在8,000 x g条件下离心2分钟以收集细菌，弃上清后用感染培养基（含NEAA但不含FCS的DMEM）重悬菌体至所需OD值600 = 1。因此，如果 OD600 为0.85，重悬于850 µL中。
        注意：对于 S. flexneri 在 OD 处600 = 1 时，将有 8 × 108 每毫升培养液中的细菌数量。感染复数（MOI）为20是合适的。对于其他病原体，OD值对应的每毫升细菌数量600 并且需要通过实验确定适当的感染复数（MOI）。
    2. 为增强细菌与宿主的相互作用，用聚-L-赖氨酸（PLL）包被细菌。
      注意：PLL 处理的 S. flexneri 对SG动态无影响。其他病原体是否适用于PLL尚需进一步评估 治疗
      1. 为了用PLL包被细菌，将1 mL细菌培养物在8,000 × g下离心2分钟，然后将沉淀重悬于含10 µg/mL PLL的磷酸盐缓冲液（PBS）中，调节OD600 = 1.
      2. 将菌液加入小培养皿中，例如12孔板中的一个孔，于室温孵育 在平板摇床中轻轻振荡，室温（约 20 °C）孵育 10 分钟。
      3. 8,000 × g 离心 2 分钟收集细菌，弃去多余的 PLL。将菌体沉淀重悬于 1 mL PBS 中，重复洗涤两次。最后一次洗涤后，将菌体重悬于感染培养基中，调整至 OD600 = 1.
        注意：此处感染培养基用于 S. flexneri 含20 mM HEPES、不含FCS的宿主细胞培养基。
  2. 准备细胞以进行细菌攻击实验。
    1. 使用吸泵移除哺乳动物HeLa细胞的培养基。加入500 µL室温HeLa细胞培养基洗涤细胞，轻轻摇晃后，用吸泵移除培养基，再加入500 µL室温的适当感染培养基（例如含20 mM HEPES且不含FCS的宿主细胞培养基
    2. 注意：所有洗涤步骤均需快速操作，每次处理不超过4个盖玻片，以避免细胞干燥。
  3. 用细菌感染20%–50%的HeLa细胞。
    注意：每种细菌物种所需的合适时间和感染复数（MOI）需单独确定。通常，以 MOI 为 10 在 37 °C 下孵育 30 分钟是一个良好的起始条件。
    1. 对于 S. flexneri 使用以下两种方法之一（步骤 2.3.1.1 或 2.3.1.2）对 HeLa 细胞进行处理。
      1. 离心未用PLL处理的细菌（20 µL OD600 以每孔500 µL培养基的量，13000 × g离心10分钟，作用于细胞。
      2. 加入PLL包被的细菌（15 µL，OD600 在室温下，每24孔板孔中加入500 µL培养基，使细菌沉降到细胞上，孵育15分钟。
    2. 将已接种细菌的细胞置于37 °C的组织培养孵育箱中孵育30分钟，以允许感染发生。
      注意：对于较短的时间点，需进行同步 S. flexneri 通过将培养皿置于37 °C水浴中15分钟，而非组织培养孵育箱中，进行感染。
  4. 通过洗涤细胞来阻止感染。
    1. 为清洗细胞并去除过量细菌，使用抽吸泵吸出培养基，加入1 mL新鲜预热（37 °C）的HeLa细胞培养基（DMEM，10% FCS，NEAA）。轻轻晃动培养基后吸除，更换为新的培养基。重复此步骤两次，最后保留新鲜培养基于细胞中。
      1. 对于 S. flexneri感染HeLa细胞并洗涤后，将培养基更换为含有50 µg/mL庆大霉素的标准组织培养基，以杀灭细胞外细菌并防止进一步的细胞侵袭。
        注意：培养胞外细菌时，培养基中不要添加抗生素。
  5. 在组织培养孵箱中，将细菌与细胞共孵育所需的时间。
    注意：对于 S. flexneri感染时间可能长达6小时，具体取决于细胞类型。对于HeLa细胞，在加入外源性刺激以诱导应激颗粒（SG）形成之前，让感染持续1.5至2小时。对于Caco-2细胞感染，其中 志贺氏菌 在加入外源性应激因素之前，让细菌在细胞间扩散并感染30分钟至6小时。此时可不添加外源性应激因素而直接固定细胞，以评估细菌感染诱导的应激颗粒（SGs）形成情况（若如此，则继续进行第4部分操作）。

3. 通过添加外源性应激源诱导应激颗粒形成

  1. 使用吸泵移除感染和未感染的HeLa细胞中的培养基，更换为500 µL含或不含应激诱导物的适当培养基，然后进行培养。
    注意：应激诱导条件包括以下处理（见下文）。更多处理方法参见Kedersha et al.13。
    1. 热激处理：使用含20 mM HEPES的常规培养基，将培养板置于44 °C水浴中30分钟。
    2. 克霉唑处理（诱导线粒体应激）：使用不含FCS的常规培养基，添加20 µM克霉唑，在组织培养箱中孵育1小时。
      注意：将20 mM克霉唑的DMSO（二甲基亚砜）储存液分装成单次用量，于-20 °C保存，最长可使用4个月。对照细胞使用等量DMSO溶剂。
    3. 亚砷酸盐处理（诱导氧化应激）：使用含0.5 µM亚砷酸盐的常规培养基，在组织培养箱中孵育1小时。
      注意：将0.5 mM亚砷酸盐储存液分装成单次用量，于-20 °C保存，最长可使用6个月。
      注意：克霉唑和亚砷酸盐对人体有害且对环境危险，必须按规定妥善处置。
    4. DMDA-海兔霉素处理（抑制真核生物翻译起始）：使用含50–200 nM DMDA-海兔霉素的常规培养基，在组织培养箱中孵育1小时。
      注意：DMDA-海兔霉素应储存于-80 °C。试剂应分装成小份保存，避免反复冻融。

4. 应激颗粒形成的固定与免疫荧光分析

注意：为了防止染色差异影响后续步骤中的图像分析，应同时处理对照组和实验组的盖玻片。对照样本包括未感染且无应激颗粒诱导处理的样本，以及未感染但有应激颗粒诱导处理的样本；感染样本则包括感染后有或无应激颗粒诱导处理的样本。

  1. 使用吸泵完全移除培养基，加入0.5 mL室温的含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液固定样品，在室温下孵育30分钟。
    警告：多聚甲醛（PFA）对操作者和环境有害。操作时应采取适当防护措施，并将其作为化学废弃物妥善处理。
    注意：或者，可先固定 15 分钟，然后更换为 -20 °C 预冷的甲醇，继续固定 10 分钟，以更好地保留应激颗粒标记物的胞质定位13.
  2. 用移液器吸除PFA，并将液体弃入适当的废液容器中。用1 mL Tris缓冲盐水（TBS：25 mM Tris，pH 7.3）洗涤盖玻片。 15 mM NaCl）。将盖玻片置于平板振荡器上，轻轻振荡孵育2分钟以进行洗涤。
  3. 使用抽吸泵完全移除 TBS，加入 500 µL 含 0.3% Triton-X100 的 TBS，孵育 10 分钟以通透细胞。
  4. 用吸泵吸除破膜液，加入1 mL TBS，轻轻摇晃培养板，吸除TBS，再加入1 mL封闭液（含5% FCS的TBS），室温孵育1小时。
  5. 在 TBS 中加入 5% FCS 配制一抗溶液（1:300 稀释）。每张 12 mm 盖玻片按 50 µL 计算，配制足够所有盖玻片一次完成的用量。
    注意：常用的初级抗体靶标包括 G3BP1、eIF3b 和 TIA1。
  6. 将50 µL一抗混合液点样至塑料石蜡膜（parafilm）上 牢固地用胶带固定在实验台或培养室上。
    注意：标准 SG 标记物的列表见下文 材料表，但应激颗粒（SGs）的组成可能取决于所施加的应激类型。其他SG标志物见Kedersha 等13 多种应激颗粒标志物的预期结果 S. flexneri 感染列于 表1.
  7. 用镊子夹取盖玻片，将盖玻片边缘轻触纸巾，短暂松开镊子以去除多余液体，然后轻轻将盖玻片有样品的一面朝下覆盖在液滴上。将盖玻片置于湿盒中，室温孵育1.5小时，或4 °C过夜。
    注意：准备一个保湿室时，将预先润湿的纸巾放置在内壁贴有塑料封口膜且密封严实的容器边缘。
  8. 用镊子将每张盖玻片转移至已加入1 mL TBS的新24孔板的孔中，在平板摇床中轻轻振荡孵育5 min。使用抽吸泵吸去每孔中的TBS，更换为1 mL TBS，再次放回平板摇床振荡5 min。重复洗涤一次。
    注意：可通过纸巾擦去多余液体，并用水清洗表面来重复使用Parafilm。在用于后续染色步骤前，确保石蜡膜完全干燥。
  9. 在TBS中配制二抗溶液（稀释度 1:500 - 1:2,000）。为染色细胞核和细菌，向混合液中加入 2 µg/mL DAPI；为染色肌动蛋白，加入荧光标记的鬼笔环肽。用移液器将 50 µL 二抗混合液滴加到塑料石蜡膜上。
    注意：当使用 G3BP1（山羊抗体）进行不同应激颗粒（SG）标志物的共定位研究时，建议使用高度纯化且经过交叉吸附的驴源二抗。应选择荧光标记、光谱不重叠的二抗。eIF3b 可清晰标记细胞的细胞质，因此是用于界定细胞轮廓的良好标志物。肌动蛋白染色可进一步帮助界定细胞间接触区域及细菌入侵部位的细胞边界。
  10. 用镊子夹起盖玻片，将盖玻片边缘轻触纸巾，短暂松开镊子以去除多余液体。轻轻将盖玻片有样品的一面朝下覆盖在液滴上，于室温避光孵育1小时。
  11. 使用镊子将盖玻片放回含有1 mL新鲜PBS的24孔板中，确保盖玻片完全浸没于PBS中。用PBS洗涤细胞3次。 每次轻柔振荡5分钟。
    注意：洗涤过程中需将培养板置于遮光条件下，以避免因避光不当导致二抗的荧光基团受光降解。
  12. 将盖玻片短暂浸入去离子水中以去除盐分，用纸巾从边缘轻轻吸干，然后将其封固在载玻片上预先滴加的5 µL荧光封片剂中。成像前用指甲油密封盖玻片。载玻片短期（一周）储存置于4 °C，长期（一月）储存则置于-20 °C。
    注意：封片时应避免产生气泡，否则会影响图像质量。

5. 荧光成像

注意：显微镜设置的优化请参考其用户手册。

  1. 使用共聚焦显微镜，选择40 或63倍油镜进行成像。根据需要选择相应的荧光通道进行图像采集。当使用多个荧光通道时，应选择顺序采集模式。
    注意：应首先采集应激颗粒（SG）诱导最强的实验样本，以避免后续样本出现过度曝光。确保在整个细胞深度范围内均无过度曝光的应激颗粒。
    1. 在显微镜设置中将图像位深度设为12位或更高，以确保图像分析的准确性。
    2. 设置图像Z轴层厚以覆盖细胞的完整深度。在不同通道及针对不同应激颗粒标记物进行检查，确保包含全部范围。将Z轴堆栈的起始位置设于细胞底部，终止位置设于细胞顶部不再观察到应激颗粒标记物的高度处。
    3. 采集Z轴堆栈图像。所有图像的堆栈高度应保持一致。
      注意：用于后续比较的对照样本与实验样本之间，不得更改采集参数。

6. 图像分析

注意：此处介绍使用免费软件 ICY 对折叠堆栈进行应激颗粒（SG）分析的方法。三维重建图像的分析也可通过其他专用软件完成。SG 检测可借助为此方案建立的全自动工作流程进行（该流程可从 http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging 获取）。使用该工作流程时，需用 DNA 染料对细胞核进行染色，以便软件识别每个细胞的中心；同时需利用细胞质标记物（如 eIF3b）或肌动蛋白染色标记细胞边缘，以便软件识别细胞边界。当细胞边界被高置信度识别时，可使用自动工作流程直接进行分析，或用于验证人工获得的结果，其效果主要取决于细胞密度以及用于识别细胞边界的标记物。

  1. 使用 ImageJ 或 Fiji，合并图像堆栈（Image>堆叠>Z 投影），并保存为 .tiff 文件。
    注意：应为每幅图像创建一个新文件夹，因为图像分析软件会将其分析结果与原始图像的存储位置关联。
  2. 将对照组和实验组的 .tiff 图像加载至图像分析平台（文件>打开。转到序列窗口。在序列窗口中向下滚动 "查找表" 通道参数。
  3. 取消所有通道：单击所有通道标签的复选框以关闭各通道。单击通道0，然后通过单击上方的颜色条选择所需颜色。根据需要，通过单击并移动强度区域中的线条来增加通道强度，以便观察所有结构。对所有通道重复此操作。
    注意：为尽量减少样本分析中的偏差，请关闭特定任务中不需要的通道。
  4. 向上滚动，在画布选项卡中，通过调整缩放选项，将视野放大至每视野约10个细胞。
  5. 使用顶部工具栏中的多边形工具勾画图像中细胞的边界。利用肌动蛋白染色或细胞质标记物来界定细胞边界。例如 eIF3b
    1. 点击多边形工具 "文件 & ROI" 工具。通过单击细胞开始划定，然后在细胞边界周围重复单击以设置锚点，从而延伸线条。要完成一个感兴趣区域（ROI），再次点击多边形工具内的功能。 "文件 & ROI" 工具
      注意：鉴定所圈定细胞中被感染的亚群。样本由感染细胞和非感染细胞混合组成。为鉴定细菌，可使用DAPI染色或荧光标记的细菌（如表达GFP的细菌）。增加荧光强度以确保所有细菌均能被观察到。
    2. 为ROI命名时，前往右侧的ROI窗口，点击图像中感兴趣的细胞区域。这将高亮显示ROI标签中对应的ROI。双击ROI名称，然后修改名称（例如感染细胞#1
      注意：如果使用同一张图像分析感染细胞和非感染细胞，建议将图像分别保存在两个独立的文件夹中，并分别勾画感染细胞和非感染细胞，生成两份不同的电子表格，以便后续分析。
  6. 在斑点检测器应用程序中打开 "检测 & 追踪" 在顶部工具栏中点击“输入”（Input）选项卡。在输入选项卡中，当前图像将被自动选中，无需进行任何更改。进入“预处理”（Pre-Processing）选项卡，选择待分析的通道。
    注意：每次只能分析一个通道。如果使用经过验证可获得满意结果的全自动分析流程，可在此选择批量分析。
    1. 在“检测器”选项卡中，选择 "在暗背景下检测亮斑"然后选择合适的量程和灵敏度。通过测试不同的设置，并在对照样本和实验样本中交叉验证斑点检测结果来完成此步骤。
      注意：对于分辨率为 2,048 × 2,048 且像素大小为 0.12 µm 的图像2，通常选择灵敏度为25至100的二级阈值较为合适，但每种应激颗粒（SG）标记物均需通过实验经验确定最佳条件。设置斑点检测参数时，应确保在未处理的对照样本中不检测到斑点，而在含有应激颗粒的实验样本中，所有大小的应激颗粒均被准确计数。
    2. 在 ROI 选项卡中，选择建议的序列 ROI。在过滤选项卡中，选择无过滤。在输出选项卡中，选择适当的输出。
      注意：选择“启用特定文件”有助于保存不同的检测条件或不同通道。选择导出二值图像以及包含感兴趣区域（ROI）和检测结果的原始图像，有助于进行质量控制分析。
    3. 选择 "移除先前标记为感兴趣区域（ROI）的斑点". 单击以选择保存文件的文件夹 "未选择文件" 按钮。在“显示”选项卡中，选择所需的选项。单击 "开始检测".
      注意：将创建一个具有所选名称和位置的文件夹，其中包含导出的成像选项。每次测试新条件时，这些图像将被覆盖。为保留图像，可重命名该文件夹以创建新文件夹，或将保存文件夹中的图像转移至新文件夹。为便于图像质量控制，建议选择显示检测标记、ROI 检测数量以及 ROI 编号和名称。
  7. 使用为每张图像或测试条件生成的电子表格，整合并保存不同参数的数据。
    注意：需分析的参数包括每个 ROI 内的 SG 数量、SG 的表面积，以及 SG 的最大、平均和最小强度。
  8. 转移数据，并使用能够进行分析、绘图和确定统计显著性的分析软件进行分析。

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结果

为解释并演示本文所述方案，我们对感染或未感染胞质内病原体的 HeLa 细胞中由克霉唑诱导的应激颗粒（SGs）的图像进行了表征 S. flexneri该操作流程的概要如图所示。 图1，包括强毒株和非毒力株 S. flexneri 在刚果红平板上划线，细菌制备，感染，施加环境胁迫，样品固定与染色，样品成像与定量，以及图像分析。可采用多种不同的胁迫条件以诱导应激颗粒（SG）形成，且存在多种可用于检测的SG标记物。eIF3b 是一种经典的SG标记物，亦可清晰地标记细胞的细胞质区域，可用于识别细胞边界。G3BP1 是一种广泛使用的SG标记物，可聚集进入SG中，且无背景染色图2A，B & D). 细胞最好使用共聚焦显微镜进行成像，将覆盖整个细胞厚度的图像序列导入成像分析免费软件 ICY 中图2

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讨论

本方案描述了在存在或不存在外源性应激的条件下，非感染细胞以及细胞质病原体S. flexneri感染细胞中应激颗粒（SG）的诱导、定位和分析方法。通过使用免费的成像软件，该方案可实现对SG形成的精确定性与定量分析，从而识别特定表型差异并进行统计学评估。

在感染、应激颗粒诱导和成像步骤的实验方案中，存在若干关键环节。对于感染步骤，至关重要的是尽可能同步细菌与宿主细胞的相互作用，例如本方案中所述的细菌侵袭过程。这一点在研究细菌攻击早期感染阶段的影响时尤为关键。我们此前已证明，某些表型（例如 eIF3b 在感染后的定位） S. flexneri 感染在野生型早期即受到干扰 S. flexneri 在其他表型（如含G3BP1的应激颗粒聚集）中，较晚时间点的影响更为显著3因此，为了精确描述细菌攻击的时间效应，建议对感染过程进行同步化处理。值得注意的是，为分析应激颗粒（SG）的形成，细胞应处于对数生长期，因此施加应激时的细胞密度也是一个重要参数。这也使得SG分析仅限于非汇合状态的细胞感染模型。另...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

PS 获得了比尔和梅琳达·盖茨基金会大挑战计划基金 OPP1141322 的资助。PV 获得了瑞士国家科学基金会早期博士后流动奖学金以及Roux-Cantarini博士后奖学金的支持。PJS 获得了霍华德·休斯医学研究所（HHMI）基金和欧洲研究委员会（ERC）2013年高级资助项目339579-Decrypt的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
一抗
eIF3b (N20)，来源山羊 Santa Cruzsc-16377稳定且广泛使用的应激颗粒（SG）标志物。细胞质染色可用于细胞轮廓界定。稀释比例 1:300
eIF3b (A20)，来源山羊 Santa Cruzsc-16378靶标与 eIF3b (N20) 相同，在本实验室中表现与 eIF3b (N20) 一致。稀释比例 1:300
eIF3A (D51F4)，来源兔（MC：单克隆）Cell Signaling3411与 eIF3b 共同组成多蛋白 eIF3 复合物的一部分。稀释比例 1:800
eIF4AI，来源山羊 Santa Cruzsc-14211由参考文献 #13 推荐。稀释比例 1:200
eIF4B，来源兔Abcamab186856在本实验室中为良好的应激颗粒标志物。稀释比例 1:300
eIF4B，来源兔Cell Signaling3592由参考文献 #13 推荐。稀释比例 1:100
eIF4G，来源兔Santa Cruzsc-11373广泛使用的应激颗粒标志物。（参考文献 #13）：在小鼠细胞系中可能效果不佳。稀释比例 1:300
G3BP1，来源兔（MC：单克隆）BD Biosciences611126广泛使用的应激颗粒标志物。稀释比例 1:300
Tia-1，来源山羊 Santa Cruzsc-1751广泛使用的应激颗粒标志物。当应激颗粒存在时，也可在 P 小体中检测到（参考文献 #13）。稀释比例 1:300
Alexa 荧光标记二抗
A488 标记抗山羊抗体，来源驴Thermo FisherA-11055交叉吸附。稀释比例 1:500
A568 标记抗山羊抗体，来源驴Thermo FisherA-11057交叉吸附。稀释比例 1:500
A488 标记抗小鼠抗体，来源驴Thermo FisherA-21202稀释比例 1:500
A568 标记抗小鼠抗体，来源驴Thermo FisherA10037稀释比例 1:500
A647 标记抗小鼠抗体，来源驴Thermo FisherA31571稀释比例 1:500
A488 标记抗兔抗体，来源驴Thermo FisherA-21206稀释比例 1:500
A568 标记抗兔抗体，来源驴Thermo FisherA10042稀释比例 1:500
其他试剂
Shigella flexneri可通过申请从多个实验室获得
胰蛋白胨酪蛋白大豆（TCS）肉汤BD Biosciences211825志贺氏菌的标准生长培养基，用途：细菌培养
TCS 琼脂BD Biosciences236950志贺氏菌的标准生长琼脂，用途：细菌培养
刚果红SERVA Electrophoresis GmbH27215.01用于区分丢失毒力质粒的志贺氏菌的鉴别工具，用途：细菌培养
聚-L-赖氨酸（PLL）Sigma-AldrichP1274用于包被细菌以增强感染效率，用途：感染
庆大霉素Sigma-AldrichG1397选择性杀灭胞外细菌而保留胞内细菌，用途：感染
HEPESLife Technologies15630-056在细胞于室温孵育时用作 pH 缓冲剂，用途：细胞培养
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Life Technologies31885HeLa 细胞的标准培养基，用途：细胞培养
胎牛血清（FCS）BiowestS1810-100HeLa 细胞培养基中添加 5%，用途：细胞培养
非必需氨基酸（NEAA）Life Technologies11140HeLa 细胞培养基中按 1:100 稀释使用，用途：细胞培养
DMSOSigma-AldrichD2650试剂稀释液，用途：细胞培养
亚砷酸钠Sigma-AldrichS7400强效应激颗粒诱导剂（注意：高毒性，需特殊操作和处理），用途：应激诱导
克霉唑Sigma-AldrichC6019强效应激颗粒诱导剂（注意：健康危害，需特殊操作和处理），用途：应激诱导
多聚甲醛（PFA）Electron Microscopy Scences15714使用 4% PFA 进行细胞标准固定，用途：固定
吐温 X-100Sigma-AldrichT8787免疫荧光染色前用于宿主细胞通透处理，使用浓度为 0.03%，用途：通透
A647-鬼笔环肽Thermo FisherA22287稀释比例为 1:40，建议在二抗染色时加入，用途：染色
DAPISigma-AldrichD9542核酸染料，用于同时观察宿主细胞核和细菌，用途：染色
封口膜Sigma-AldrichBR701501适用于盖玻片免疫荧光染色的石蜡膜，用途：染色
Prolong GoldThermo Fisher36930稳定且适用于大多数荧光染料的封片剂，用途：封片
MowiolSigma-Aldrich81381经济且稳定的封片剂，适用于大多数荧光染料，用途：封片
24 孔细胞培养板Sigma-AldrichCLS3527标准组织培养板，用途：细胞培养
12 mm  玻璃盖玻片NeuVitro1001/12用于免疫荧光实验的细胞培养载体，用途：细胞支撑
镊子Sigma-Aldrich81381经济且稳定的封片剂，适用于大多数荧光染料，用途：封片
软件与设备
PrismGraphPad Software具有强大统计分析功能的数据分析与绘图软件，用途：数据分析
Leica SP5Leica Microsystems共聚焦显微镜，用途：图像采集
ImarisBitplane专业图像分析软件，用途：数据分析
ExcelMicrosoft数据分析与绘图软件，用途：数据分析

参考文献

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