我们描述了一种定性和定量分析哺乳动物细胞在受到细菌及多种不同应激刺激后应激颗粒形成的实验方法。该方案可用于研究多种宿主-细菌相互作用中的细胞应激颗粒反应。
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摘要
摘要
对细胞组分进行荧光成像，是研究宿主-病原体相互作用的有效工具。病原体可影响感染细胞的多种特征，包括细胞器超微结构、细胞骨架网络的组织方式，以及应激颗粒（Stress Granule, SG）形成等细胞过程。阐明病原体如何干扰宿主细胞过程，是发病机制研究领域中重要且不可或缺的一部分。尽管某些表型差异可能肉眼可见，但对病原体攻击所诱导的细胞结构在定性和定量上的精确分析，对于确定实验组与对照组之间具有统计学意义的差异至关重要。应激颗粒的形成是一种进化上保守的应激反应，可引发抗病毒反应，长期以来已被用于病毒感染相关研究1。应激颗粒的形成还会影响信号转导级联反应，并可能带来其他尚未明确的生物学后果2。目前，针对病毒以外的病原体（如胞内细菌性病原体）所引发的应激颗粒反应的研究，正成为一个新兴的研究方向3。然而，即使在病毒研究体系中，对应激颗粒形成的定性与定量分析仍未被常规采用。本文介绍一种简单的方法，用于在未感染细胞以及感染了胞内细菌性病原体的细胞中诱导并表征应激颗粒的形成——该病原体可影响细胞在多种外源性应激条件下应激颗粒的生成。通过使用多种不同的应激颗粒标志物，结合 ICY（一种开源图像分析工具）中的斑点检测插件（spot detector plug-in），可实现对应激颗粒形成及其组分的分析。
引言
在细胞水平上可视化宿主与病原体的相互作用，是深入了解病原体致病策略以及识别关键细胞通路的有力方法。事实上，病原体可作为研究工具，用于定位重要的细胞靶点或结构，因为病原体在进化过程中已学会干扰核心细胞过程，以此作为自身存活或增殖的策略。通过重组表达带荧光标签的宿主蛋白，可实现对细胞组分的可视化。尽管这种方法能够实现实时分析，但构建特异性标记宿主蛋白的细胞系工作量大，且可能产生不良的副作用。更为便捷的方法是使用特异性抗体检测细胞因子，因为该方法可同时分析多个宿主因子，且不受特定细胞类型的限制。其缺点在于，免疫荧光分析需要对宿主细胞进行固定，因此仅能获得静态图像。然而，免疫荧光成像的一个重要优势在于，它易于进行定性和定量分析，进而可用于发现具有统计学显著性的差异，从而为宿主-病原体相互作用提供新的见解。
荧光图像分析程序是进行三维（3D）和四维（4D）分析的强大分析工具。然而，软件及其维护的高昂成本使得基于免费开源软件的方法更具广泛吸引力。使用生物图像分析软件进行细致的图像分析具有重要价值，因为它能够验证视觉分析结果，并在赋予统计学显著性时，提高对特定表型正确性的可信度。此前，应激颗粒（SGs）的分析依赖于免费的ImageJ软件，但该方法需要手动识别单个应激颗粒4。本文提供了一种利用免费开源生物图像分析软件ICY（http://icy.bioimageanalysis.org）在细菌感染背景下诱导并分析细胞内应激颗粒形成的实验方案。该....
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方案
1. 细菌与宿主细胞的制备
- 用无菌镊子将12 mm或14 mm的玻璃盖玻片分别转移至24孔板或12孔板中，每个实验条件对应一个孔。在超净台中通过紫外照射对盖玻片进行15分钟的灭菌处理。
注意：应设置细菌攻击的对照孔以及外源性应激诱导SG形成的对照孔。 - 对于24孔板中直径为12 mm的盖玻片，每孔接种1 × 10⁵个细胞。5 哺乳动物细胞（例如， 将HeLa细胞接种到盖玻片上；用无菌移液器吸头轻轻按压盖玻片，使细胞贴附。于37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜，使细胞贴壁2 组织培养箱中，使用适合每种细胞类型的培养基进行培养。
注意：接种细胞时应确保细胞在次日的融合度为40%–60%。- 对于HeLa细胞，在添加非必需氨基酸（NEAA）和10%灭活胎牛血清（FCS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中孵育。将FCS置于56 °C水浴中加热30分钟以灭活补体，加热15分钟后轻柔旋转混匀一次。
- 用无菌移液枪头从保存在-80 °C冰箱中的细菌甘油储备液（20%甘油）中取出少量菌液，接种至标记好的平板上。用无菌接种环将细菌涂布于平板约10%的区域。取一个新的无菌接种环，穿过前一区域涂布出三条平行线，长度约为半个平板。再用新的无菌接种环依次穿过这些线，将细菌进一步划线至平板其余区域。将平板置于37 °C培养过夜（O/N）。
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结果
为解释并演示本文所述方案，我们对感染或未感染胞质内病原体的 HeLa 细胞中由克霉唑诱导的应激颗粒（SGs）的图像进行了表征 S. flexneri该操作流程的概要如图所示。 图1，包括强毒株和非毒力株 S. flexneri 在刚果红平板上划线，细菌制备，感染，施加环境胁迫，样品固定与染色，样品成像与定量，以及图像分析。可采用多种不同的胁迫条件以诱导应激颗粒（SG）形成，且存在多种可用于检测的SG标记物。eIF3b 是一种经典的SG标记物，亦可清晰地标记细胞的细胞质区域，可用于识别细胞边界。G3BP1 是一种广泛使用的SG标记物，可聚集进入SG中，且无背景染色图2A，B & D). 细胞最好使用共聚焦显微镜进行成像，将覆盖整个细胞厚度的图像序列导入成像分析免费软件 ICY 中图2
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讨论
本方案描述了在存在或不存在外源性应激的条件下，非感染细胞以及细胞质病原体S. flexneri感染细胞中应激颗粒（SG）的诱导、定位和分析方法。通过使用免费的成像软件，该方案可实现对SG形成的精确定性与定量分析，从而识别特定表型差异并进行统计学评估。
在感染、应激颗粒诱导和成像步骤的实验方案中，存在若干关键环节。对于感染步骤，至关重要的是尽可能同步细菌与宿主细胞的相互作用，例如本方案中所述的细菌侵袭过程。这一点在研究细菌攻击早期感染阶段的影响时尤为关键。我们此前已证明，某些表型（例如 eIF3b 在感染后的定位） S. flexneri 感染在野生型早期即受到干扰 S. flexneri 在其他表型（如含G3BP1的应激颗粒聚集）中，较晚时间点的影响更为显著3因此，为了精确描述细菌攻击的时间效应，建议对感染过程进行同步化处理。值得注意的是，为分析应激颗粒（SG）的形成，细胞应处于对数生长期，因此施加应激时的细胞密度也是一个重要参数。这也使得SG分析仅限于非汇合状态的细胞感染模型。另.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
PS 获得了比尔和梅琳达·盖茨基金会大挑战计划基金 OPP1141322 的资助。PV 获得了瑞士国家科学基金会早期博士后流动奖学金以及Roux-Cantarini博士后奖学金的支持。PJS 获得了霍华德·休斯医学研究所（HHMI）基金和欧洲研究委员会（ERC）2013年高级资助项目339579-Decrypt的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 一抗 | |||
| eIF3b (N20)，来源山羊 | Santa Cruz | sc-16377 | 稳定且广泛使用的应激颗粒（SG）标志物。细胞质染色可用于细胞轮廓界定。稀释比例 1:300 |
| eIF3b (A20)，来源山羊 | Santa Cruz | sc-16378 | 靶标与 eIF3b (N20) 相同，在本实验室中表现与 eIF3b (N20) 一致。稀释比例 1:300 |
| eIF3A (D51F4)，来源兔（MC：单克隆） | Cell Signaling | 3411 | 与 eIF3b 共同组成多蛋白 eIF3 复合物的一部分。稀释比例 1:800 |
| eIF4AI，来源山羊 | Santa Cruz | sc-14211 | 由参考文献 #13 推荐。稀释比例 1:200 |
| eIF4B，来源兔 | Abcam | ab186856 | 在本实验室中为良好的应激颗粒标志物。稀释比例 1:300 |
| eIF4B，来源兔 | Cell Signaling | 3592 | 由参考文献 #13 推荐。稀释比例 1:100 |
| eIF4G，来源兔 | Santa Cruz | sc-11373 | 广泛使用的应激颗粒标志物。（参考文献 #13）：在小鼠细胞系中可能效果不佳。稀释比例 1:300 |
| G3BP1，来源兔（MC：单克隆） | BD Biosciences | 611126 | 广泛使用的应激颗粒标志物。稀释比例 1:300 |
| Tia-1，来源山羊 | Santa Cruz | sc-1751 | 广泛使用的应激颗粒标志物。当应激颗粒存在时，也可在 P 小体中检测到（参考文献 #13）。稀释比例 1:300 |
| Alexa 荧光标记二抗 | |||
| A488 标记抗山羊抗体，来源驴 | Thermo Fisher | A-11055 | 交叉吸附。稀释比例 1:500 |
| A568 标记抗山羊抗体，来源驴 | Thermo Fisher | A-11057 | 交叉吸附。稀释比例 1:500 |
| A488 标记抗小鼠抗体，来源驴 | Thermo Fisher | A-21202 | 稀释比例 1:500 |
| A568 标记抗小鼠抗体，来源驴 | Thermo Fisher | A10037 | 稀释比例 1:500 |
| A647 标记抗小鼠抗体，来源驴 | Thermo Fisher | A31571 | 稀释比例 1:500 |
| A488 标记抗兔抗体，来源驴 | Thermo Fisher | A-21206 | 稀释比例 1:500 |
| A568 标记抗兔抗体，来源驴 | Thermo Fisher | A10042 | 稀释比例 1:500 |
| 其他试剂 | |||
| Shigella flexneri | 可通过申请从多个实验室获得 | ||
| 胰蛋白胨酪蛋白大豆（TCS）肉汤 | BD Biosciences | 211825 | 志贺氏菌的标准生长培养基，用途：细菌培养 |
| TCS 琼脂 | BD Biosciences | 236950 | 志贺氏菌的标准生长琼脂，用途：细菌培养 |
| 刚果红 | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | 用于区分丢失毒力质粒的志贺氏菌的鉴别工具，用途：细菌培养 |
| 聚-L-赖氨酸（PLL） | Sigma-Aldrich | P1274 | 用于包被细菌以增强感染效率，用途：感染 |
| 庆大霉素 | Sigma-Aldrich | G1397 | 选择性杀灭胞外细菌而保留胞内细菌，用途：感染 |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | 在细胞于室温孵育时用作 pH 缓冲剂，用途：细胞培养 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Life Technologies | 31885 | HeLa 细胞的标准培养基，用途：细胞培养 |
| 胎牛血清（FCS） | Biowest | S1810-100 | HeLa 细胞培养基中添加 5%，用途：细胞培养 |
| 非必需氨基酸（NEAA） | Life Technologies | 11140 | HeLa 细胞培养基中按 1:100 稀释使用，用途：细胞培养 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | 试剂稀释液，用途：细胞培养 |
| 亚砷酸钠 | Sigma-Aldrich | S7400 | 强效应激颗粒诱导剂（注意：高毒性，需特殊操作和处理），用途：应激诱导 |
| 克霉唑 | Sigma-Aldrich | C6019 | 强效应激颗粒诱导剂（注意：健康危害，需特殊操作和处理），用途：应激诱导 |
| 多聚甲醛（PFA） | Electron Microscopy Scences | 15714 | 使用 4% PFA 进行细胞标准固定，用途：固定 |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 免疫荧光染色前用于宿主细胞通透处理，使用浓度为 0.03%，用途：通透 |
| A647-鬼笔环肽 | Thermo Fisher | A22287 | 稀释比例为 1:40，建议在二抗染色时加入，用途：染色 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 核酸染料，用于同时观察宿主细胞核和细菌，用途：染色 |
| 封口膜 | Sigma-Aldrich | BR701501 | 适用于盖玻片免疫荧光染色的石蜡膜，用途：染色 |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | 稳定且适用于大多数荧光染料的封片剂，用途：封片 |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | 经济且稳定的封片剂，适用于大多数荧光染料，用途：封片 |
| 24 孔细胞培养板 | Sigma-Aldrich | CLS3527 | 标准组织培养板，用途：细胞培养 |
| 12 mm 玻璃盖玻片 | NeuVitro | 1001/12 | 用于免疫荧光实验的细胞培养载体，用途：细胞支撑 |
| 镊子 | Sigma-Aldrich | 81381 | 经济且稳定的封片剂，适用于大多数荧光染料，用途：封片 |
| 软件与设备 | |||
| Prism | GraphPad Software | 具有强大统计分析功能的数据分析与绘图软件，用途：数据分析 | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | 共聚焦显微镜，用途：图像采集 | |
| Imaris | Bitplane | 专业图像分析软件，用途：数据分析 | |
| Excel | Microsoft | 数据分析与绘图软件，用途：数据分析 |
参考文献
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38
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