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方法文章

单分子分析激光定位补骨脂素加合物

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DOI：

10.3791/55541

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2017年4月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health

本文内容

摘要

激光常用于研究细胞对DNA损伤的响应。然而，激光产生的损伤位点之间的间距、发生频率及其与复制叉的碰撞情况很少被表征。本文中，我们描述了一种利用激光定点诱导链间交联的方法，可实现对这些参数的测定。

摘要

DNA损伤应答（DDR）在活细胞中通过激光微束照射诱导的双链断裂（DSBs）研究中已被广泛表征。然而，对于引起DNA螺旋扭曲的共价修饰（包括DNA链间交联（ICLs））所引发的DDR，目前了解尚不充分。我们研究了由激光光激活免疫标记的补骨脂素在活细胞核内定位的ICL所触发的DDR。为了探讨加合物分布及复制叉遭遇ICL等基本问题，我们将激光定位技术与另外两种技术相结合。DNA纤维常用于通过短脉冲期间掺入的核苷类似物的免疫荧光来显示复制叉的进展。免疫量子点则被广泛应用于单分子成像。在这一新方法中，来自携带激光定位ICL细胞的DNA纤维被铺展在显微镜载玻片上。利用免疫量子点显示标记的ICL，并测定损伤之间的间距。复制叉与ICL的碰撞可被可视化，不同类型的遭遇模式亦可被识别并定量分析。

引言

DNA持续受到辐射、紫外线、环境毒素、燃烧产物等外源性因素的攻击。此外，氧化代谢产生的内源性自由基也会对DNA造成损伤。所有这些因素都可能在化学或物理层面上破坏DNA的完整性1。基因组的异常可激活DNA损伤应答（DDR），这是一种涉及数百乃至数千种蛋白质和微小RNA的级联反应，包括招募蛋白和翻译后修饰，参与损伤修复、细胞周期调控、凋亡、衰老以及炎症通路2。

目前我们对DNA损伤应答（DDR）的大部分认识主要来源于对双链断裂（DSB）的研究。这很大程度上得益于现有技术能够实现在活细胞基因组DNA中引入断裂，包括序列特异性的断裂3。此外，断裂位点易于募集DDR蛋白形成明显的焦点结构，可通过免疫荧光技术进行观察，这对鉴定参与应答蛋白的动力学特征和必要条件提供了极大帮助。研究DDR的一项关键技术是由Bonner及其同事所引入的，他们利用激光束在活细胞核内的"感兴趣区域"（ROI）中定向诱导产生一条带状分布的DSB4。实际上，这种方法形成了一个较长的蛋白聚集带，使得研究人员可通过免疫荧光鉴定DDR相关蛋白的定位。他们通过展示激光照射细胞中磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）形成的明显条带，验证了该方法的有效性。自此以后，激光诱导方法已被广泛应用于DSB引发的DDR研究中。尽管该技术强大且广受欢迎，并能产生极具视觉冲击力的免疫荧光图像，但需要注意的是，在大多数实验中，激光强度通常被调节至可观察到结果的水平，而并未充分考虑所产生损伤的性质、密度或间距。事实上，准确评估这些参数可能存在困难，因此在多数研究中被忽略，尽管激光会在DNA中引入多种类型的损伤5。这在一定程度上导致了当前文献中存在诸多矛盾之处6。

与DNA双链断裂（DSBs）不同，大多数DNA的化学修饰不会诱导DNA损伤应答（DDR）蛋白形成离散的焦点结构。这一点在当前对损伤频率的认识背景下尤为重要。据估计，培养中的人类细胞每个细胞周期可产生多达50个DSBs，主要发生在S期7,8,9。在非增殖细胞中，DSBs的形成数量更少。相比之下，碱基丢失或碱基修饰事件的数量则高达每个细胞每天数万次1,10。因此，我们目前对相对罕见的损伤事件所诱导的DDR了解较多，而对更为普遍的、引起DNA双螺旋结构扭曲的损伤所诱导的DDR了解却少得多。

为了研究细胞对基因组DNA共价修饰的应答机制，我们希望采用一种能够引起DNA双螺旋结构扭曲且具有内在DNA损伤应答（DDR）诱导活性的DNA加合物。此外，为了便于实验设计与结果解读，我们倾向于选择一种在时间上可精确控制其引入过程，并且易于可视化的结构。基于此，我们开发了一种以补骨脂素（psoralen）为基础的实验策略。补骨脂素是一类已被充分表征的光活性DNA嵌入剂，优先结合于5' TA:AT位点。与其他交联剂（如氮芥和丝裂霉素C（MMC））不同，补骨脂素在未暴露于长波紫外线（UVA）照射时不具备DNA反应活性。嵌入后的补骨脂素分子可与互补链上的胸腺嘧啶碱基发生反应，形成导致双螺旋结构扭曲的链间交联（ICLs）11。在本研究中所使用的三甲基补骨脂素处理下，主要产物为链间交联，单加合物生成量较少（低于10%）12，且不会在单链相邻碱基之间形成链内交联。由于这类结构能强烈阻断DNA复制和转录过程，补骨脂素及其他交联剂（如顺铂和MMC）被广泛应用于化学治疗。因此，补骨脂素不仅可用于研究由螺旋扭曲结构所激活的DNA损伤应答通路，还能为理解细胞对具有临床重要性化合物的应答提供重要见解。

我们合成了一种试剂，其中将三甲基补骨脂素与地高辛（Dig）相连，后者是一种在哺乳动物细胞中不存在的植物甾醇，常被用作免疫标记物。该试剂需要光活化，因此可通过激光（365 nm）在活细胞核内特定兴趣区域（ROI）精确定位补骨脂素交联（ICLs）。这些交联位点可通过针对Dig标签的免疫荧光进行显示。DNA修复及DNA损伤应答（DDR）蛋白出现在激光定位的ICL条带区域13,14。

由用于产生DNA双链断裂（DSBs）的高强度激光所激活的DNA损伤应答（DDR）可能源于孤立或成簇的损伤15,16。因此，这些实验结果是否适用于自然发生的、浓度低得多的损伤尚不明确。为了探讨关于补骨脂素加合物在DNA中出现频率和间距的类似问题，我们利用了DNA纤维技术17和免疫量子点。量子点比荧光染料更亮，且不会因光照而发生漂白，因此常用于单分子成像18，而荧光染料在此类应用中亮度不足。单个DNA纤维可在载玻片上拉伸，并通过免疫荧光法显示细胞收获前孵育期间掺入的核苷类似物。我们用Dig-补骨脂素处理细胞，并对感兴趣区域（ROI）进行激光微照射。随后从细胞中制备DNA纤维，并利用免疫量子点可视化单个Dig-补骨脂素加合物。让细胞短暂暴露于核苷类似物（20–60分钟）可显示激光定位的DNA交联（ICLs）附近区域的复制轨迹。

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方案

1. 地高辛标记的dUTP的制备

  1. 在氮气氛围下，将50 mg（0.18 mmol）的4'-氯甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素与590 mg（2.7 mmol）的4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺混合于一个干燥的25 mL圆底烧瓶中。加入10 mL甲苯，回流反应12小时。在减压条件下使用旋转蒸发仪除去溶剂。
    1. 通过硅胶快速柱色谱法纯化残留物。以氯仿、甲醇和28%氨水溶液（9:1:0.5）作为洗脱剂洗脱色谱柱。在减压条件下使用旋转蒸发仪蒸发溶剂，得到纯的4'-[N-(13-氨基-4,7,10-三氧杂十三烷)]氨基甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素，为淡黄色粘稠液体。
    2. 在氮气氛围下，将5.5 mg（0.012 mmol）的4'-[N-(13-氨基-4,7,10-三氧杂十三烷)]氨基甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素与5 mg（0.008 mmol）的地高辛NHS酯混合于一个干燥的圆底烧瓶中。加入0.5 mL无水二甲基甲酰胺（DMF）和3.4 µL三甲胺，在50 °C下搅拌18小时。
    3. 在减压条件下使用旋转蒸发仪除去溶剂。
    4. 用最少体积的二氯甲烷溶解残留物。将溶液以每点2 µL的量水平点样至以硅胶为固定相的制备型薄层色谱板底部。使用氯仿:甲醇:28%氢氧化铵溶液（8:1:0.1）作为展开剂进行制备型薄层色谱分离。
    5. 除板的垂直边缘外，其余部分遮蔽，用短波长254 nm紫外灯识别产物条带。用刮刀刮下产物部分，并使用氯仿:甲醇:28%氢氧化铵溶液（8:1:0.1）混合液提取纯产物。
    6. 在减压条件下使用旋转蒸发仪除去溶剂。将残留的固体溶解于1 mL 50% EtOH:H2O中，分装为50 µL等份至1.5 mL离心管中（约20份），在离心蒸发仪中干燥至完全除去溶剂（约3小时）。
    7. 将每份等份物重新溶解于200 µL 50% EtOH:H2O中，再次在离心蒸发仪中干燥。再次将每份溶解于200 µL 50% EtOH:H2O中，干燥后于-20 °C长期保存。
  2. 使用时，将固体溶解于50 µL 50% EtOH:H2O中。将溶解的地高辛标记的补骨脂素（Dig-TMP）用H2O稀释100倍，在250 nm处测定OD值。Dig-TMP的消光系数为25,000。若在-20 °C保存，该溶液可稳定约一个月。每次使用前应通过测定250 nm处的OD值验证其浓度。
    1. 计算储备液浓度：Abs × 100 × 106 / 25,000 = 浓度（单位为µM）。通常储备液浓度约为3 mM。保持在此浓度范围内至关重要，以尽量减少加入培养基中的乙醇体积。

2. 激光定位 Dig-TMP ICLs

  1. 使用共聚焦显微镜进行激光定位，该显微镜配备SRS氮激光器（337 nm），通过染料池泵浦产生365 nm波长的激光线，发射3 ns脉冲，频率为10 Hz，功率为0.7 nW。
  2. 用记号笔在35 mm玻璃底细胞培养皿的一侧做一条垂直标记。用金刚石笔在培养表面的玻璃中心划一个十字，使培养皿侧边的黑色条纹位于十字其中一条臂的上方。十字标记在玻璃的生长表面上，以确保其与细胞处于同一焦平面。
  3. 标记后用70%乙醇冲洗培养皿进行灭菌，接种细胞前使其干燥。
  4. 在实验前一至两天，将细胞（如HeLa或U2OS等标准实验室细胞系）接种于已标记十字的培养皿中。实验当天细胞应处于活跃分裂状态，融合度为50–70%。加入1 µM 5-氯-2-脱氧尿苷（CldU）孵育24小时，以均匀标记DNA。
  5. 将Dig-TMP溶于50%乙醇：H2O中，加入细胞培养基至终浓度为20 µM。将培养基预热至37 °C。更换细胞上的培养基后，置于培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育30分钟，使Dig-TMP充分平衡分布。
  6. 在细胞孵育期间，确定激光作用视野的x/y坐标。按照仪器制造商的校准程序，通过软件控制激光在镜面玻璃载玻片上刻划一条水平线和一条对角线。这两条线定义了激光可作用目标区域的边界。
  7. 将培养皿置于显微镜载物台的环境培养室中，保持37 °C、受控CO2浓度和湿度，使用60倍油镜聚焦于十字交叉点。
  8. 使用软件中的形状工具由研究者设定感兴趣区域（ROI），将365 nm激光束导向该区域，形成3 µm × 0.6 µm的条带。通过光标将ROI轮廓置于靠近十字交叉点的细胞核内。调节z轴焦平面，使激光靶向细胞核中部。使用350–370 nm波长范围内的激光。405 nm激光无法诱导交联19。
    注：我们将ROI定位于核仁以外的核质区域，这些区域可在微分干涉差（DIC）成像中与核仁区分开来。
  9. 通过提高激光功率至足以摧毁一个细胞的水平（细胞将变暗并消失）来验证激光的聚焦状态和活性。这是检测激光光路是否畅通无阻（经显微镜、盖玻片进入细胞）的重要诊断步骤。
    1. 将功率调低至刚好足以激活补骨脂素并引发ICL相关的DNA损伤应答（DDR）的水平（该值需根据每种激光/显微镜组合经验性确定）。选择一个在无补骨脂素存在时不激活DDR的激光强度设置（此处为1.7%），可通过γ-H2AX的形成情况进行监测。
      注：此参数的确定至关重要，若更换激光源或光路中的任何组件，可能需要重新调整设置。通过观察GFP标记的修复蛋白（如XPC或FAN1）的积累情况来验证，这些蛋白会迅速（数秒内）被招募至激光诱导的补骨脂素条带区域，而不会被招募至仅暴露于激光的ROI区域。某些DDR蛋白在数秒内出现，而其他蛋白可能需要数分钟。对每种目标蛋白均需进行时间进程分析。我们还注意到，在未暴露于激光的细胞中，未观察到响应蛋白形成的条带。
  10. 完成一个视野内所有细胞的照射后，移动培养皿至新的视野，但仍需靠近十字交叉点。
  11. 在旨在确定损伤间距离分布的实验中，围绕十字交叉点在20–25个视野（每个视野4–5个细胞）中对细胞进行激光照射。为分析局部ICL附近区域的复制模式，可在激光照射后用10 µM 5-碘-2-脱氧尿苷（IdU）孵育细胞。
    注：IdU孵育时间的选择具有一定灵活性。我们曾使用过短至20分钟、长至60分钟的孵育时间（见下文）。较长的脉冲标记（数小时）常导致多个复制轨迹融合，从而失去观察单个复制叉进展的机会。在某些实验中，细胞先用CldU标记24小时以均匀标记DNA，随后暴露于Dig-TMP，再进行复制轨迹的脉冲标记。

3. 细胞收获与DNA纤维拉伸

  1. 将培养板从载物台上取下，吸去培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。吸去PBS溶液。在玻璃表面中央十字交叉处滴加10 µL商用胰蛋白酶/EDTA溶液。
  2. 室温（RT）孵育3–4分钟，然后用移液枪头将含有脱落细胞的胰蛋白酶溶液吸入枪头中。无需中和胰蛋白酶。
  3. 将含有细胞的胰蛋白酶/EDTA液滴置于经硅烷化处理的载玻片一端。加入10 µL 0.5% SDS溶液裂解细胞并释放DNA，在室温下轻轻吹打混匀，孵育3–4分钟，使液滴边缘逐渐干燥。
  4. 将载玻片倾斜20º，使液体流向玻片末端。流动液体的流体动力可使DNA纤维伸展拉长。让载玻片自然晾干（约10分钟），然后在甲醇:乙酸（3:1）固定液中固定10分钟。取出载玻片，再次自然晾干。此时可将载玻片长期保存于-20 °C的70%乙醇（EtOH）中。使用前从70%乙醇中取出，晾干后再进行下一步操作。
  5. 用PBS洗涤载玻片，然后在2.5 M HCl中室温变性1小时。该处理可使DNA脱嘌呤，从而使掺入的卤代核碱基暴露，便于抗体识别。
  6. 用0.4 M Tris-HCl（pH 7.4）中和载玻片。再用含0.5% Tween-20的PBS（PBST）洗涤两次，每次5分钟。
  7. 用含5%牛血清白蛋白（BSA）和10%山羊血清的PBS溶液封闭载玻片。轻轻覆盖一层封口膜（parafilm），使封闭液均匀覆盖整个玻片表面，室温孵育1小时。
  8. 向每张载玻片上加入100 µL用封闭液按1:200稀释的大鼠抗溴脱氧尿苷（anti-bromodeoxyuridine，特异性识别CldU）一抗溶液。轻轻覆盖封口膜，使溶液均匀分布，在湿盒中室温孵育1小时。移除封口膜，用PBST洗涤三次，每次5分钟。
  9. 向每张载玻片上加入100 µL用封闭液按1:100稀释的山羊抗大鼠Alexa Fluor 647二抗溶液。轻轻覆盖封口膜，室温孵育45分钟。用PBST洗涤三次，每次5分钟。
  10. 向每张载玻片上加入100 µL用封闭液稀释的一抗混合液，包括按1:40稀释的小鼠抗溴脱氧尿苷抗体（可识别IdU和CldU；由于该抗体具有双重特异性，需通过前一步大鼠抗BrdU抗体封闭CldU信号）以及按1:200稀释的兔抗DIG抗体。轻轻覆盖封口膜，在湿盒中室温孵育1小时。移除封口膜，用PBST洗涤三次，每次5分钟。
  11. 向每张载玻片上加入100 µL用封闭液稀释的二抗混合液，包括按1:100稀释的山羊抗小鼠Alexa Fluor 488抗体和按1:5,000稀释的山羊抗兔探针（e.g.，Qdot 655）。轻轻覆盖封口膜，室温孵育45分钟。用PBST洗涤三次，每次5分钟。
  12. 将多余的PBST液体在纸巾上沥干。每张载玻片上加50 µL抗荧光淬灭封片剂，加盖盖玻片。立即成像或于-20 °C保存不超过48小时。

4. 荧光显微镜下的光纤成像

  1. 使用倒置显微镜上的63倍物镜进行图像采集，显微镜配备完全电动化的滤光轮，用于FITC、Cy5和Q Dot 655检测。激发滤光片为425 nm，发射滤光片为655 nm，带宽20 nm，中心位于发射峰处20。

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结果

通过免疫荧光检测与补骨脂素连接的Dig标签，可显示激光定位的Dig-TMP（图1A）交联链（ICLs）。尽管激光可被引导至任意轮廓区域进行照射，但条带状并非细胞内的“自然”形态，因此可通过该特征将真实信号与因一抗或二抗非特异性结合导致的假象信号区分开来。当使用特异性不够理想的抗体时，这一特性尤为有用。图中展示了经典的DNA损伤应答（DDR）标志物γ-H2AX在Dig-TMP交联链条带区域的信号示例（图1B）。

激光条带中Dig标记损伤灶的免疫荧光染色无法提供有关加合物频率和间距的任何结论。为了确定这一点，细胞在引入交联（ICLs）前先与CldU共孵育24小时。针对CldU的染色可使Dig标记的损伤灶在长DNA纤维上可视化，并且比直接染色（如DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）或YOYO {1,1'-(4,4,8,8-四甲基-4,8-二氮杂十一亚甲基)双[4-[(3-甲基苯并-1,...

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讨论

激光定位技术需要使用贴壁细胞，且其细胞核在明场显微镜下可见。我们曾尝试使用细胞黏附剂（如多聚赖氨酸或胶原蛋白）或更复杂的混合物，将非贴壁细胞（如原代淋巴细胞）或松散贴壁的培养细胞（如AD293细胞）固定在玻璃表面。尽管这些处理可使细胞结合于表面，但我们发现这些细胞通常保持圆形，难以对焦至细胞核。此外，这些细胞在去除培养基后的初始洗涤步骤中常无法存活。然而，在满足贴壁细胞要求的前提下，我们已成功将多种标准细胞系以及原代细胞应用于这些研究。建议检测细胞是否存在支原体污染，我们发现此类感染会改变细胞的反应特性。

激光的焦平面非常重要。目标是将ICLs放置在细胞核内。焦平面过高，光激活会位于细胞核上方；过低则会落在玻璃表面。我们发现，在细胞质与细胞核交界处调整微分干涉差（DIC）图像的焦点清晰度较为有效。

纤维实验并不困难，但在获得可解释的结果之前需要一定的练习。正确实施该技术至关重要。激光显微切割实验回收的细胞数量较少，每个样本都会被完整地用于一张载玻片上。因此，必须最大限度提高每次实验的回收率，因为样本无法分割，也不能保留部分用于...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家衰老研究所院内研究计划（Z01 AG000746-08）和范可尼贫血研究基金会的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
地高辛NHS酯Sigma-Aldrich11333054001
氯代补骨脂素Berry and AssociatesPS 5000
二氨基二甘醇Sigma-Aldrich3695194,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺
氯仿Acros Organics423550040
甲醇Fisher ScientificA4524
氨水溶液Sigma-Aldrich5002
TLC板Analtech, Inc.P02511
Flass玻璃柱 24/40，100 mLChemglass Life SciencesCG-1196-02
Nikon T2000_E2转盘共聚焦显微镜，配备自动载物台、环境控制室和培养板支架Perkin Elmer配备Volocity软件
Micropoint Galvo Andor Technologies配备氮气脉冲激光器 
染料池Andor TechnologiesMP-2250-2-365
365染料Andor TechnologiesMP-27-365-DYE
IdU Sigma-Aldrich17125
35 mm玻璃底培养皿，1.5号盖玻片，玻璃直径10 mm，未包被MatekP35G-1.5-10-C
显微镜载玻片New Comer SupplyPart # 5070新型硅烷载玻片
小鼠抗BrdU抗体（IdU）BD Biosciences3475801比40
大鼠抗BrdU抗体（CldU）Abcamab63261比200 
兔抗地高辛抗体ThermoFisher Scientific7100191比200
Q-dot 655山羊抗兔IgGThermoFisher ScientificQ-11421MP1比5,000
AF647-山羊抗大鼠IgGJackson Immunoresearch112-605-1671比100
AF488-山羊抗小鼠IgGJackson Immunoresearch115-545-1661比100
Zeiss A200正置荧光显微镜Zeiss 配备Axiovision软件
Q-dot 655滤光片Chroma39107

参考文献

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