核磁共振波谱法作为快速评估鱼油补充剂脂质谱的可靠工具

Kathryn Williamson; Emmanuel Hatzakis

doi:10.3791/55547

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核磁共振波谱法作为快速评估鱼油补充剂脂质谱的可靠工具

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DOI：

10.3791/55547

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2017年5月1日

Kathryn Williamson¹ , Emmanuel Hatzakis¹^,²

¹Department of Food Science and Technology, The Ohio State University, ²Foods for Health Discovery Theme, The Ohio State University

本文内容

摘要

本研究采用高分辨率¹H和¹³C核磁共振（NMR）波谱法作为对封装鱼油补充剂进行定性和定量分析的快速且可靠的工具。

摘要

西方饮食中n-3脂肪酸含量较低，因此建议服用鱼油补充剂以增加这些必需营养素的摄入。本研究的目的是利用两种不同核磁共振（NMR）仪器——500 MHz和850 MHz仪器，通过高分辨率¹H和¹³C NMR波谱法，对封装的鱼油补充剂进行定性和定量分析。质子（¹H）和碳（¹³C）NMR谱图均可用于鱼油补充剂主要成分的定量测定。鱼油补充剂中脂质的定量通过积分相关一维谱图中的适当NMR信号实现。尽管两种原子核及两种仪器在分辨率和灵敏度上存在差异，¹H和¹³C NMR所得结果彼此之间具有良好一致性。¹H NMR分析速度较¹³C NMR更快，其谱图可在1分钟内完成采集，而¹³C NMR分析则需10分钟至一小时。然而，¹³C NMR谱图信息更为丰富，可提供更多种类单个脂肪酸的定量数据，并可用于确定脂肪酸在甘油骨架上的位置分布。两种原子核均能在一次实验中提供定量信息，无需纯化或分离步骤。磁场强度主要影响¹H NMR谱图，因其分辨率低于¹³C NMR，但即便是成本较低的NMR仪器，也可被食品工业和质量控制实验室高效地作为标准方法应用。

引言

饮食中摄入 n-3 脂肪酸已被证实对多种疾病具有防治作用，例如心脏疾病¹^,²^,³、炎症性疾病⁴ 和糖尿病⁵。n-3 脂肪酸在西方饮食中含量较低，因此建议通过鱼油补充剂来改善消费者膳食中 n-6/n-3 脂肪酸的比例¹。尽管近年来鱼油补充剂的消费量显著增加，但部分产品的安全性、真实性及质量仍存在疑问。对鱼油补充剂进行快速而准确的成分分析，对于正确评估这些商品的质量并保障消费者安全至关重要。

评估鱼油补充剂最常用的方法是气相色谱法（GC）和红外光谱法（IR）。尽管这些方法具有很高的灵敏度，但存在若干缺点⁶。GC分析耗时较长（4–8小时），因为需要对各个化合物进行分离和衍生化处理⁷，且在分析过程中可能发生脂质氧化⁸^,⁹。虽然红外光谱法可以实现定量分析，但通常需要采用偏最小二乘回归（PLSR）建立预测模型，尽管在某些情况下红外吸收峰可归属于单一化合物¹⁰。PLSR需要分析大量样品，从而延长了分析时间¹¹。因此，人们日益关注开发新的分析方法，以实现对大量鱼油样品进行准确且快速的分析。美国国立卫生研究院（NIH）下属的膳食补充剂办公室（ODS）和食品药品监督管理局（FDA）已与官方分析化学家协会（AOAC）合作，共同推动这些新方法的开发¹²^,¹³。

核磁共振（NMR）波谱法是用于筛查和评估膳食补充剂等多组分基质的最有前景的分析方法之一¹⁴^,¹⁵。NMR波谱法具有多项优势：它是一种非破坏性且可定量的技术，几乎无需或仅需极少的样品前处理，并具有优异的准确性和重现性。此外，NMR波谱法是一种环境友好型方法，仅需使用少量溶剂。NMR波谱法的主要缺点是其灵敏度相对其他分析方法较低，但近年来仪器技术的进步，如更强的磁场、多种直径的低温探头、先进的数据处理方法以及多样化的脉冲序列和技术，已将灵敏度提高至纳摩尔（nM）级别。尽管NMR仪器成本较高，但核磁共振波谱仪寿命长且应用广泛，长期来看可降低单次分析的成本。本详细的视频实验方案旨在帮助该领域的新手避免在进行鱼油补充剂的¹H和¹³C NMR波谱分析时可能遇到的问题。

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方案

1. NMR 样品制备

注意：请谨慎操作，使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。样品制备中使用的氘代氯仿（CDCl₃）具有毒性。进行样品制备时，请采取一切适当的安全措施，包括在通风橱中操作，并佩戴个人防护装备（护目镜、手套、实验服、长裤、封闭式鞋履）。

¹H 和 ¹³C 样品的制备
1. 使用注射器从膳食补充剂胶囊中提取 120 µL（约 110 mg）鱼油，并将其放入 4 mL 玻璃小瓶中。记录鱼油的重量。
2. 样品溶解
  1. 将约 120 µL 鱼油溶解于 500 µL 含 0.01% 四甲基硅烷（TMS）的 CDCl₃ 中，TMS 用作 ¹H 和 ¹³C 化学位移的参考标准。
    注：TMS 仅用于化学位移校准（见步骤 2.2.1.2.7 和 2.2.2.2.7），不用于定量分析（见步骤 2.2.1.3 和 2.2.2.3）。
  2. 若需以 mg/g 表示定量结果，则通过将约 220 mg 2,6-二-叔-丁基-4-甲基苯酚（BHT）和 15 mg 三（乙酰丙酮）铬(III)（Cr(acac)₃）溶解于 20 mL 含 0.01% TMS 的 CDCl₃ 中，配制 BHT 储备液。取 500 µL 该储备液溶解 100 mg（± 10 mg）鱼油。
3. 溶解油样后（耗时数秒），将全部溶液直接转移至高品质 5 mm NMR 样品管中并盖上盖帽。样品制备后 24 小时内完成分析。

2. 核磁共振仪器准备

注意：请谨慎操作，注意核磁共振（NMR）仪器产生的强磁场可能会影响心脏起搏器、外科假体等医疗设备和植入物，以及信用卡、手表等电子物品，等等。若使用非屏蔽磁体进行分析时，需格外小心。本研究采用两台核磁共振仪采集¹H 和 ¹³C NMR 谱图：一台核磁共振波谱仪的 ¹H 和 ¹³C 核工作频率分别为 850.23 MHz 和 213.81 MHz，配备三共振氦冷却反向（TCI）5 mm 探头；另一台核磁共振波谱仪的 ¹H 和 ¹³C 核工作频率分别为 500.20 MHz 和 125.77 MHz，配备宽带检测（BBO）氮冷却 5 mm 探头。所有实验均在 25 ± 0.1 ºC 条件下进行，谱图数据采用标准的核磁共振数据采集与处理软件包进行处理（见材料列表）。

核磁共振谱图采集前的准备工作
注意： ¹氢和 ¹³13C NMR 谱可以在不将样品从仪器中取出的情况下连续采集。
1. 将核磁共振管插入旋转载样器涡轮中（见材料列表）。
2. 将转子和试管置于分级深度规的顶部，轻轻按压试管顶端，直至其底部接触深度规的底部。
3. 将核磁共振样品放入样品架的空位中，并记录样品所在的插槽编号。
4. 在 NMR 中加载样品时，返回控制计算机并输入“sx #”，其中 # 是样品架中放置样品的槽位编号。
5. 等待 CDCl 的氘信号₃ 在锁屏窗口中显示。如果未自动出现，请手动输入 "锁定显示"一旦氘信号可见，输入 "锁定" 在命令行中并选择 "CDCl₃₃" 从溶剂列表中选择，以使用 CDCl 锁定样品₃ 氘核共振。
  注意：如果前一位用户使用了不同的溶剂，氘信号可能不会出现。用户应等待样品下降指示，然后进行锁场。
6. 类型 "bsmsdisp" 在命令行中输入以确保旋转未激活。如果 "SPIN" 按钮为绿色，点击以停止旋转。
7. 输入 "新" 创建新数据集的命令。在 "名称" 标签和实验编号在 "实验编号" 表。使用数字 "1" 在 "PROCNO" 表。在 "实验" 标签，点击 "选择" 并选择 "质子" 参数文件。在实验标题处填写实验名称 "标题" 点击标签页 "好的。"
8. 类型 "getprosol" 在命令行中输入以获取当前 NMR 探头和溶剂的标准参数。
9. 重复步骤 2.1.7 ¹³C，选择 "C13IG" 脉冲序列在 "实验" 1D谱的标签 ¹³C反向门控去耦实验。
10. 类型 "getprosol" 在命令行中输入以获取当前 NMR 探头和溶剂的标准参数。
11. 输入命令 "atma" 对探头进行碳核和质子核的自动调谐与匹配。
12. 执行一维梯度匀场，以获得高度均匀的磁场，从而实现核磁共振信号的最佳线型。
  1. 使用标准的自动一维匀场程序，只需按顺序执行命令即可 "qu topshim 1dfast ss", "qu topshim tuneb ss," 和 "qu topshim 报告" 在命令行中。
参数优化
1. 90° 脉冲校准
  1. 创建一个新的数据集 ¹H（见步骤 2.1.7 和 2.1.8）。
  2. 输入命令 "paropt" 在命令行中输入以启动用于校准90的自动化程序° 脉冲。选择脉冲持续时间 p1 作为待调整的参数。
  3. 从 "2" µ将 p1 的初始值输入为 "2" µs 增量并执行 "16" 实验
  4. 创建一个新的数据集 ¹³C（参见步骤 2.1.9），并重复该过程 ¹³C核（见步骤2.2.1.2和2.2.1.3）。
2. T₁ 采用零点法测量的测量值¹⁶ 用于 ¹H
  注意：该空方法采用反转恢复脉冲序列，包含一个180°脉冲° 脉冲后接一个延迟（tau），以允许z轴方向的弛豫，以及最终的90° 产生可观测的横向磁化强度的脉冲。
  1. 创建一个新的数据集 ¹H（见步骤 2.1.7 和 2.1.8）。
  2. 类型 "pulprog t1ir1d" 将脉冲序列更改为反转恢复实验。
  3. 在命令行中输入以下命令，以设置谱宽（ppm）、射频发射器中心频率、扫描次数、预扫描次数以及数据点数 "8", "o1p 3.8", "ns 2", "ds 2" 和 "td 64K".
  4. 类型 "p1（值）" 并输入90的持续时间值° 由脉冲校准（参见步骤 2.2.1）确定的脉冲并输入类型 "p2（值）" 对于 180° 脉冲（180°脉冲的持续时间值）° 脉冲为90° 脉冲持续时间乘以二）
  5. 将循环延迟设置为一个非常大的值，例如通过输入 10 s "d1 10".
  6. 设置 tau 将数值设为较短的值，例如 10 ms，通过输入 "d7 10毫秒" 在命令行中。
  7. 使用命令将接收增益（RG）设置为适当值 "rga" 用于RG的自动计算。
  8. 输入命令以运行谱图 "zg".
  9. 输入傅里叶变换命令以执行 "efp" 在命令行中。
  10. 输入命令以执行自动相位校正 "apk" 在命令行中。如果需要额外的相位调整以进一步改善谱图，请点击 "步骤标签，" 然后点击 "调整相位" 进入相位校正模式的图标。
    1. 使用零级（0）和一级（1）相位校正图标，通过拖动鼠标使所有信号均处于负吸收模式。单击以应用并保存相位校正参数 "返回并保存" 退出相位校正模式的按钮。
  11. 增加 tau 直至所有峰均为正峰或通过重复步骤 2.2.2.6–2.2.2.9 使信号完全抵消。以确定 T₁ 值，只需将 tau 峰在 ln2 处被抵消的值。
3. T₁ 采用零点法测量的测量值¹⁶ 用于 ¹³C
  1. 创建一个新的数据集 ¹³C（参见步骤 2.1.9）
  2. 类型 "pulprog t1irpg" 将脉冲序列更改为碳核的反转恢复实验。
  3. 在命令行中输入以下命令，以设置谱宽（ppm）、射频发射器中心频率、扫描次数、预扫描次数以及数据点数： "谱宽 200", "o1p 98", "ns 8", "ds 2"和 "td 64K".
  4. 类型 "p1（值）" 并输入90的持续时间值° 由脉冲校准（见步骤 2.2.1）确定的脉冲并输入 "p2（值）" 对于180° 脉冲（持续时间值为90）° 脉冲持续时间乘以二）
  5. 将循环延迟设置为一个非常大的值，例如通过输入 100 s "d1 100".
  6. 设置 tau 将数值设为较短的时间，例如通过输入100 ms "d7 100ms" 在命令行中。
  7. 使用命令将接收增益（RG）设置为适当值 "rga" 用于RG的自动计算。
  8. 输入命令以运行谱图 "zg".
  9. 输入以执行傅里叶变换 "efp" 在命令行中。
  10. 通过输入命令执行自动相位校正 "apk" 在命令行中。如果需要额外的相位调整以进一步改善谱图，请点击 "调节相位" 零阶（0）和一阶（1）相位校正的图标以及相位校正图标。
    1. 单击零级和一级相位校正图标的同时，拖动鼠标直至所有信号均处于负吸收模式。通过单击 "返回并保存" 退出相位校正模式的按钮。
  11. 增加 tau 直至所有峰均为正峰或通过重复步骤 2.2.3.6–2.2.3.9 被抵消。以确定 T₁ 值，只需将 tau 峰在 ln2 处被抵消的值。
一维（1D）核磁共振谱
1. ¹氢核磁共振（1H NMR）谱
  1. 核磁共振数据的采集
    1. 前往 ¹第2.1.7步创建的H数据集，并使用标准 "脉冲-采集" 脉冲序列， "zg"，通过输入 "脉冲程序 zg" 在命令行中。
    2. 在命令行中输入以下命令，以设置谱宽（ppm）、射频发射机中心频率、扫描次数、预扫描次数、数据点数以及90°脉冲的脉冲持续时间° 脉冲角度： "sw 8", "o1p 3.8", "ns 2", "ds 2", "td 64K" 和 "p1（通过脉冲校准确定）" （参见步骤 2.2.1）.
      注：500 MHz 仪器可使用 32K 数据点。
    3. 为500 MHz仪器设置7秒的弛豫延迟，或为850 MHz仪器设置9秒的弛豫延迟，通过输入 "d1 7s" 或 "d1 9s"，分别在命令行中。
    4. 使用命令将接收增益（RG）设置为适当值 "rga" 用于RG的自动计算。
    5. 类型 "digmod baseopt" 以获得基线更佳的谱图。
    6. 输入脉冲-采集命令以开始采集 "zg" 在命令行中。
  2. 核磁共振数据的处理
    1. 类型 "64K" 在命令行中应用零填充，并将实谱的大小设置为 64K。
    2. 将线宽参数设置为 0.3 Hz，方法是输入 "0.3 磅" 在命令行中应用线宽因子为 0.3 Hz 的指数衰减加权函数，再进行傅里叶变换。
    3. 通过输入执行傅里叶变换 "efp" 在命令行中。
    4. 通过输入命令执行自动相位校正 "apk" 在命令行中。如果需要额外的相位调整以进一步改善谱图，请点击 "步骤标签，" 然后点击 "调节相位" 零阶（0）和一阶（1）相位校正的图标以及相位校正图标。
      1. 单击零阶和一阶相位校正图标的同时，拖动鼠标直至所有信号均处于正吸收模式。通过单击 "返回并保存" 退出相位校正模式的按钮。
    5. 输入命令以应用四次多项式函数进行积分时的基线校正 "绝对值".
      注意：这可确保光谱基线平坦且强度最低。
    6. 以 TMS 为基准，报告化学位移（单位：ppm）δ = 0）。单击校准（"校准轴"）图标，将带红线的光标置于TMS NMR信号（最接近0的峰）上方，单击左键并输入 "0".
  3. 核磁共振数据解析
    1. 积分谱图中以下区域： δ 1.1 至 δ 0.6 以及在 δ 4.98, δ 5.05 和 δ 5.81 使用 "积分" 图标（位于下方 "流程" 标签）和高亮（"定义新区域") 图标。左键单击并拖动以选中积分区域。
      注意：如果需要聚焦某个区域，可单击高亮图标以取消激活，然后按住鼠标左键并拖动以放大该区域。如需调整阈值强度，可使用鼠标中键。再次单击高亮图标以激活积分功能，然后移至下一个峰。
      1. 右键单击信号下方显示的积分值，选择将上述积分总和归一化为100 "归一化积分总和". 输入数值 "100" 在方框中并点击 "返回并保存" 退出积分模式。
    2. 使用BHT作为内标时，对位于 δ 6.98，并将积分值设为每0.5 mL储备溶液中BHT的毫摩尔数。
    3. 在可能的情况下，对目标峰（参见步骤 2.3.1.3.1）两侧各延伸 10 Hz 的范围进行积分。
    4. 继续执行 ¹³C-NMR 谱的采集与处理方式类似。
2. ¹³碳-13核磁共振（13C NMR）谱
  1. 核磁共振数据的采集
    1. 前往 ¹³C 数据集并使用反向门控去耦脉冲序列， "zgig" 通过输入 "pulprog zgig" 在命令行中。
      注意：使用标准宽带去耦脉冲序列运行碳实验时，输入 "pulprog zgpg" 在命令行中。
    2. 在命令行中输入以下命令，以设置谱宽（ppm）、射频发射器中心频率、扫描次数、预扫描次数、数据点数以及90°脉冲的脉冲持续时间° 脉冲角度： "sw 200", "o1p 95", "ns 16" "ds 2", "td 64K" 和 "p1（通过脉冲校准确定）" （参见步骤 2.2.1.4）
    3. 为500 MHz仪器设置35秒的弛豫延迟，或为850 MHz仪器设置45秒的弛豫延迟，通过输入 "d1 35s" 或 "d1 45秒"，分别在命令行中设置。使用BHT时，500 MHz仪器的弛豫延迟应为50 s，850 MHz仪器的弛豫延迟应为60 s。
    4. 使用命令将接收增益（RG）设置为适当值 "rga" 用于RG的自动计算。
    5. 类型 "digmod baseopt" 在命令行中以获取基线改善的谱图。
    6. 输入脉冲-采集命令以开始采集 "zg" 在命令行中。
  2. 核磁共振数据的处理
    1. 类型 "si 64K" 在命令行中应用零填充，并将实谱的大小设置为 64K。
    2. 将线宽参数设置为 1.0 Hz，方法是输入 "1.0 lb" 在命令行中应用线宽因子为1.0 Hz的指数衰减加权函数，再进行傅里叶变换。
    3. 通过输入执行傅里叶变换 "efp" 在命令行中。
    4. 通过输入命令执行自动相位校正 "apk" 在命令行中。如果需要进一步调整相位以改善谱图，请点击 "步骤标签，" 然后点击 "调节相位" 零阶（0）和一阶（1）相位校正的图标以及相位校正图标。
      1. 单击零阶和一阶相位校正图标的同时，拖动鼠标直至所有信号均处于正吸收模式。通过单击 "返回并保存" 退出相位校正模式的按钮。
        注意：对于在214 MHz拉莫尔频率（850 MHz仪器）下采集的碳谱，由于较大的离共振效应，非专业用户在进行频率依赖性误差（一阶）校正时可能会面临挑战且耗时较长° 脉冲
    5. 输入命令以应用四次多项式函数进行积分时的基线校正 "绝对值" 在命令行中。
    6. 以 TMS 为基准，报告化学位移，单位为 ppmδ = 0）。单击校准（"校准轴") 图标，将带红线的光标置于需参照的核磁共振信号上方，左键单击并输入 "0".
  3. 核磁共振数据解析
    1. 积分谱图中以下区域： δ 175 至 δ 171 使用 "积分" 图标（位于下方） "流程" 标签）和高亮（"定义新区域") 图标。左键单击并拖动以选中积分区域。
      注意：如果需要聚焦某个区域，请单击高亮图标以取消激活，然后按住鼠标左键并拖动以放大该区域。再次单击高亮图标以激活积分功能，然后移至下一个峰。
      1. 右键点击信号下方显示的积分值，将其设置为100 "校准当前积分". 输入数值 "100" 在盒子中并单击 "返回并保存" 退出积分模式。
    2. 使用BHT作为内标时，对位于 δ 151.45，并将积分值设定为每0.5 mL储备溶液中BHT的毫摩尔数。
    3. 从峰的每侧各延伸5 Hz，对目标峰进行积分（参见步骤2.3.2.3.1）。

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结果

¹H 和 ¹³C NMR 谱图是使用两种市售鱼油补充剂的 NMR 仪器采集的，分别为 850 MHz 和 500 MHz 波谱仪。这些谱图可用于鱼油中组分的定量测定，例如二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA），以及其他化合物如 n-1 酰基链和营养学重要指标 n-6/n-3 比值。即使不使用内标物也可进行定量分析，但此时定量结果必须以相对摩尔百分比表示。当需要将数据表示为绝对值（mg/g）时，则必须使用内标物。NMR 获得的结果具有高度可重复性，¹³C NMR 分析的相对标准偏差（RSD）为 0.3% 至 2%，¹H NMR 分析的 RSD 为 0.5% 至 2.5%，具体数值取决于所分析的脂质类型。¹H NMR 的 RSD 略高，这通常是由于质子谱图信号拥挤，影响了分析准确性，特别是对于信噪比（S/N）较低的共振信号。850 MHz 与 500 MHz 仪器之间的结果一致性良好，RSD 范围为 1%...

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讨论

修改与故障排除策略

谱图质量核磁共振信号的线宽以及核磁共振谱图的分辨率在很大程度上依赖于匀场，匀场是优化磁场均匀性的过程。对于常规分析，一维匀场已足够，无需进行三维匀场，前提是该操作由核磁共振专业人员定期执行。若未满足此条件，则需在分析前使用含有0.6 mL H的样品进行三维匀场。₂O:D₂O (90:10)。为了实现更好且更快的匀场，需使用分级深度规将样品置于射频（RF）线圈的激发/检测区域中心位置，然后再将其放入磁体孔腔中。影响匀场的另一个因素是将样品以10–20 Hz的转速旋转。尽管在此转速下旋转样品可改善径向匀场（X、Y、XY、XZ、YZ、X²-γ², 等等。），通常不建议使用，以避免出现一级或更高阶的旋转边带。然而，当使用拉莫尔频率低于400 MHz的仪器进行一维核磁共振实验时，建议采用旋转。

分辨率和灵敏度均受接收增益（rg）值的影响。接收增益值过低会降低灵敏度，而过高的值则会导致模...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由俄亥俄州立大学食品与健康发现主题项目及俄亥俄州立大学食品科学与技术系资助。作者谨此感谢俄亥俄州立大学核磁共振中心和宾夕法尼亚州立大学核磁共振中心提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
Avance III 850 NMR 仪器	布鲁克
Avance III 500 NMR 仪器	布鲁克
TCI 5 mm 探头	布鲁克		采用氦气冷却的反向（质子检测）核磁共振探头，具有三个独立通道¹H ¹³C, ¹⁵N)
BBO Prodigy 5 mm 探头	Bruker		氮冷却观测（X核检测）探头，具有两个通道；一个用于 ¹氢和 ¹⁹F检测以及一个用于X核（覆盖从 ¹⁵N 到 ³¹P)
涡轮旋转器	布鲁克		NMR转子由聚合物材料制成，并配有橡胶O形圈，以确保NMR管牢固固定
Topspin 3.5	Bruker
氘代氯仿	Sigma-Aldrich	865-49-6	99.8 原子% D，含有 0.03 TMS
2,6-二-叔叔丁基-4-甲基苯酚	Sigma-Aldrich	128-37-0	纯度 >99%
鱼油样品
核磁共振管	新时代	NE-RG5-7	5毫米外径常规探头 “R” 系列 NMR 样品管
BSMS	布鲁克		Bruker 系统管理系统；控制系统设备

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核磁共振波谱法作为快速评估鱼油补充剂脂质谱的可靠工具

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