本论文介绍了一种无需复杂高成本设备即可制备凹形微孔的可靠方法。利用磁力、钢珠和通孔阵列，在3 cm × 3 cm的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上形成了数百个微孔。
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本文内容
摘要
摘要
类球体培养是一种用于理解细胞行为的有效工具，因为它提供了一个类似体内环境的三维结构。in vivo 细胞相互作用、免疫激活、药物筛选、干细胞分化和类器官生成的研究中，已采用多种类球体生成方法，如非黏附表面、旋转瓶、悬滴法和微孔阵列。在这些方法中，具有三维凹面几何结构的微孔阵列因其能够生成尺寸均一的类球体，并便于对单个类球体的反应进行监测，已引起科学家和工程师的关注。尽管已有成本较低的方法被提出，例如使用柔性膜和冰光刻技术，但这些技术存在严重缺陷，如难以控制图案尺寸、难以实现高纵横比以及难以制备大面积的微孔阵列。为克服这些问题，我们提出了一种无需复杂高成本设备即可制备凹面微孔阵列的可靠方法。该方法利用一个30 × 30通孔阵列、数百个微米级钢珠以及磁力，在3 cm × 3 cm的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上制备出900个微孔。为验证该方法在细胞生物学应用中的适用性，我们将脂肪干细胞培养3天，并成功利用该微孔平台生成了类球体。此外，我们还进行了静磁模拟，以探究磁力如何将钢珠固定在通孔中的机制。我们认为，所提出的微孔阵列制备方法可广泛应用于基于类球体的多种细胞研究，如药物筛选、组织再生、干细胞分化和癌症转移研究。
引言
以球状体形式培养的细胞比二维平面培养更接近体内真实组织1。 由于这一优势，球状体已被广泛应用于改善细胞间相互作用2,3、免疫激活4、药物筛选5和分化研究6。此外，近年来包含多种细胞类型的球状体已被应用于类器官（接近生理状态的三维（3D）组织），在人类发育与疾病研究中具有重要价值7。 目前已有多种方法用于制备球状体。最简单的方法是使用非黏附表面，使细胞彼此聚集并形成球状体。可通过在培养皿表面包被牛血清白蛋白、Pluronic F-127或疏水性聚合物（如聚2-羟乙基甲基丙烯酸酯）来实现表面非黏附性8,9。旋转烧瓶法是另一种广为人知的大规模制备球状体的方法10,11。该方法通过搅拌使细胞保持悬浮状态，防止其贴附于基质表面，从而促使悬浮细胞聚集形成球状体。非黏附表面法和旋转烧瓶法均可实现球状体的大规模生产，但存在难以精确控制球状体大小....
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方案
1. 通孔阵列铝板和磁铁阵列的制备
- 准备两块 50 mm × 50 mm（或更大）的铝板，每块板的厚度为 300 µm，为钢珠直径的一半。
- 使用数控旋转雕刻机在一块铝板上加工出一个30 × 30的通孔阵列 Φ550-µm 微钻头，以 30 mm/s 的进给速率和 8000 RPM 的主轴转速进行加工。各孔之间的距离（中心到中心）为 1 mm（图1a 和 图2a, i).
- 形成一个 30 × 30 的阵列 Φ750-µm通孔，采用与1.2步骤相同的程序（图1a 和 图2a, ii).
- 使用胶带将两块板相互粘合固定 Φ两块铝板的四个角均设有直径3 mm的对准孔。
- 将铝板浸泡在15%的硫酸中12小时以清洁其表面。由于铝表面的薄层氧化铝具有抗腐蚀性，该酸处理不会改变铝板的孔径和厚度。
- 形成一个 30 × 30 个 1 × 1 × 1 mm 的钕磁铁阵列（磁力强度为 0.363 N）。确保每个磁铁与其相邻磁铁的极性相反。为防止磁铁阵列破裂或散开，使....
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结果
通过执行步骤2.1至3.7，成功制备了凸形模具和微孔阵列图案（图4）。商用钢珠被固定在30 × 30的通孔阵列中，钢珠被紧密固定，与相应通孔之间无任何间隙（图4a）。所制备的凹形微孔呈凹半球形，直径为600 µm，与钢珠的直径相同（图4b）。凹形微孔的横截面（图4c）显示，相邻微孔之间的距离为1 mm（中心到中心），与通孔间距一致。直径为Φ14 mm的凹形微孔基底置于24孔板中，包含超过120个微孔（图4d）。
将脂肪来源的干细胞培养在凹形微孔阵列中。我们在直径为14 mm的凹形微孔阵列上接种了2 × 106个细胞。24小时后，细胞已聚.......
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讨论
该制备方法面临的主要挑战是如何在铝板的通孔阵列中牢固固定微珠。为解决这一问题，采用了一个30 × 30的磁铁阵列，利用磁力将微珠牢固固定，如图6和图7所示。该磁铁阵列具有相反的极性，其磁通密度在每块磁铁表面的中心处最强。由于磁力的强度取决于磁通密度，微珠因此被引导至每块磁铁顶面的中心位置并被固定在此处。若使用单个大尺寸磁铁（5 cm × 5 cm × 1 cm），则微珠（尤其是位于最外侧孔中的微珠）容易被吸引至磁铁边缘处形成的高强度磁场区域。使用大磁铁的另一个问题是微珠会自发聚集并形成微小的珠链结构（图8a）。
上板（750 µm 孔）的作用是提供凹坑结构以捕获微珠。由于这种凹坑结构，可以通过丙烯酸板刮擦的方式一次性创建大量被捕获的微珠阵列（方案 2.4 以及图 1c和1d）。如果不使用上板，则必须将每个微珠手动逐个插入到底板（550 µm 孔）中。
本方法的.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过科学、信息通信技术与未来规划部资助（项目编号：NRF-2014R1A1A2057527 和 NRF-2016R1D1A1B03934418）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 数控旋转雕刻机 | Roland DGA | EGX-350 | |
| 微型钻头 | HAM Präzision | 30-1301 TA | Φ 0.55 和 0.75 mm |
| 98% 硫酸 | Daejung | 7683-4100 | 用于清洗铝板。 用蒸馏水稀释成15%溶液 |
| 钕磁铁 | Supermagnete | W-01-N | 1 × 1 × 1 mm |
| 轴承钢珠 | Agami Modeling | SUJ2 | Φ 600 μm 钢珠 |
| 聚二甲基硅氧烷 (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | p2443 | 用磷酸盐缓冲液稀释至4% (w/v) 溶液 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| 胎牛血清 | ATCC | 30-2020 | |
| 脂肪来源的间充质干细胞 | ATCC | ATCC PCS-500-011 |
参考文献
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in t....
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