本文介绍了一种快速平衡透析（RED）方法，用于测定药物与肺结核病灶及空洞中干酪样坏死物的结合。该方案也可用于泡沫状巨噬细胞来源基质，后者是干酪样坏死物的有效替代物。
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本文内容
摘要
摘要
结核病的根除需要能够穿透复杂肺部病灶多层结构的药物治疗方案。药物在空洞和病灶干酪样核心中的分布尤为关键，因为这些区域藏匿着具有耐药性的细菌亚群，通常被称为持留菌。目前用于测定药物在结核病病灶中渗透情况的方法往往成本高昂且耗时较长 体内 药代动力学研究结合生物分析或成像技术。 体外 测量药物与干酪样坏死物大分子的结合可作为此类技术的替代方法，因为这种结合会阻碍药物分子在干酪样物质中的被动扩散。快速平衡透析是一种快速且可靠的系统，常用于血浆蛋白和组织结合研究。在本方案中，我们使用快速平衡透析（RED）装置来测定药物与从结核感染兔病灶和空洞中切除的干酪样坏死物匀浆之间的结合。该方案还描述了如何利用脂质负载的THP-1巨噬细胞生成一种替代基质以代替干酪样坏死物。这种干酪样坏死物/替代基质结合实验是结核病药物研发中的重要工具，也可经调整后用于研究其他疾病所致病灶或脓肿中的药物分布。 关键词：药物结合，干酪样坏死物，快速平衡透析，THP-1巨噬细胞，结核病，药物分布，病灶
引言
治疗肺结核疾病需要将药物有效地分布到不同类型的病灶中。坏死性病灶和空洞含有干酪样中心，其中寄居着具有药物耐受性或“持续性”细菌的亚群。1,2 空洞性疾病与较低的治愈率和不良预后相关。3,4 以往研究利用定量和成像技术表明，不同药物类别穿透干酪样物质的能力存在显著差异。5,6 然而，这些方法需要使用动物感染模型，耗时且繁琐。为此设计了一种体外（in vitro）检测方法，用于测量药物与离体（ex vivo）干酪样物质的结合能力。研究发现，该结合能力与药物在干酪样肉芽肿中的穿透能力呈负相关，因此可作为预测药物穿透效果的工具。7
平衡透析法被认为是血浆蛋白结合研究的金标准方法。快速平衡透析（RED）装置为此类实验提供了快速、简便且可靠的系统8。该装置由两部分组成：一次性使用的插入件，包含两个腔室，中间由一段垂直的半透膜圆柱隔开；以及可重复使用的底板，每次最多可容纳48个插入件。透析膜的截留分子量为8 kDa（MWCO），非常适合药物与大分子结合研究。膜腔具有较高的表面积与体积比，可实现快速透析和平衡。插入件和底板均经过验证，非特异性结合极低。将RED装置与生物分析技术相结合，可准确测定药物在血浆中的游离分数8,9。
尽管RED装置最初设计用于测定血浆蛋白结合率，但其已被应用于多项使用组织匀浆的组织结合研究10,11。在本实验方案中，我们测定药物与干酪样物质（caseum）的结合，该物质为从结核感染兔的坏死病灶和空洞中切除的坏死碎屑。由于干酪样物质无细胞且无血管结构，易于匀浆化为均一悬浮液，适用于本检测方法。
由于干酪样坏死物的制备繁琐且难以获取，本实验方案也已验证可用于一种由泡沫样巨噬细胞制备的替代基质。通过油酸诱导THP-1单核细胞来源的巨噬细胞，使其积累多个脂滴，从而呈现“泡沫样”形态。这些富含脂质的细胞被收集并加工，制备成一种可模拟干酪样坏死物的替代基质。本研究表明，药物与该替代基质的结合情况与药物在干酪样坏死物中的结合具有良好的相关性，能够有效模拟药物在肉芽肿和空洞干酪样核心中渗透受阻的体内过程。
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方案
所有动物实验均依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》进行，并获得美国国家过敏与传染病研究所（NIAID，NIH）机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准，实验地点位于马里兰州贝塞斯达。所有涉及结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的研究均在生物安全三级（BSL-3）实验室中进行。
1. 兔子感染模型建立与干酪样坏死物采集
- 使用仅暴露鼻腔的气溶胶感染系统，如前所述将结核分枝杆菌（M. tuberculosis）感染新西兰白兔12,13。让感染进展持续12–16周。通过肌肉注射给予35 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪对兔子进行镇静，随后通过静脉注射0.22 mL/kg戊巴比妥钠和苯妥英钠实施安乐死，并立即进行尸体解剖。
- 使用镊子和解剖刀从胸腔中取出肺组织。从每个肺叶中，用解剖刀分离出单个空洞及较大的坏死性肉芽肿。小心地从空洞壁和肉芽肿壁上刮下干酪样坏死物（caseum）。称重后记录并储存于2 mL螺口管中，置于-20 °C保存，待后续使用。
- 将具有感染性的干酪样坏死物样本置于干冰上，以3 MegaRad剂量进行γ射线辐照处理，使其失去感染性，以便在生物安全二级（BSL-2）实验室中安全操作。
2. 体外 从 THP-1 细胞生成类结核性干酪样物质
- 在T175细胞培养瓶（每瓶80 mL）中，使用RPMI 1640培养基（含2 mM L-谷氨酰胺和10%胎牛血清）培养THP-1单核细胞。将培养瓶置于5% CO₂培养箱中孵育。2 大气中 37 °C 3-4 天。
- 将来自T175培养瓶的培养物分装至两个50 mL锥形管中，在150 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL RPMI 1640培养基中。
- 移液器 5 µL 将该培养物转移至含有1.5 mL离心管中 45 µL 台盼蓝。用移液器充分混匀。转移 10 µL 使用血细胞计数板，在光学显微镜（10倍放大）下计数活THP-1单核细胞（未染色）的数量。计算每毫升培养液中的活细胞数。用RPMI培养基稀释至最终浓度为1.25 × 10⁶个细胞/mL。6 cells/mL
- 将40 mL培养物接种至大尺寸细胞培养皿（50 x 106 细胞/孔）。添加 40 µL 的 100 µM PMA（佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯，以乙醇配制）并置于培养箱中过夜，使细胞贴壁。
注意：PMA 的终浓度为 100 nM。 - 将纯油酸（OA）（0.89 g/mL）用乙醇稀释至 0.1 M 浓度（即 31.7 µL OA在 968.3 µL 乙醇）。将该溶液用新鲜预热的RPMI培养基稀释至10 mM浓度。再将该油酸（OA）悬液用预热的RPMI培养基稀释至0.4 mM（最终工作浓度） 37 °C.
- 移除细胞培养板中已有的培养基和未贴壁的细胞，轻柔地向THP-1巨噬细胞（THP-M）加入40 mL的0.4 mM OA。置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育 37 °C 在培养箱中孵育过夜。
- 在40倍放大倍数下使用光学显微镜，目视确认每个THP-M细胞内存在大量脂质体包涵物。用50 mL血清移液管从细胞培养板中完全移除RPMI培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤贴壁细胞两次。
注：脂滴在 THP-M 的细胞质中呈现为微小、透明的球形结构。 - 向每块板中加入 40 mL PBS 配制的 5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），在 15 min 内孵育 37 °C.
- 使用10 mL血清移液管反复吹打整个培养板表面，使泡沫状巨噬细胞（FM）脱落。将细胞悬液转移至50 mL锥形管中，在150 × g离心5分钟。
- 将细胞沉淀重悬于10 mL PBS中（第三次PBS洗涤），转移至已称重的15 mL锥形管中。在150 × g条件下离心5分钟。使用移液管小心吸除上清液并弃去。
- 将FM沉淀物进行3次冻融循环以裂解细胞，并在 75 °C 20-30 分钟以变性基质中的蛋白质。将沉淀物储存在 -20 °C 直至使用前
3. 快速平衡透析（RED）实验
- 用二甲基亚砜（DMSO）配制所有测试化合物的 10 mM 储存液。每次实验前，用 DMSO 将储存液稀释至 500 µM 的工作液。
- 称量装有模拟干酪样物质团粒的离心管。减去空管重量，得到团粒的净重。每管加入 2–3 颗金属研磨珠，使用组织匀浆器以每分钟 1,200 次冲程匀浆 1 分钟，将干酪样物质或模拟基质在 PBS 中（1:9 w/v）破碎，制成每种基质的 10 倍稀释悬浮液。
- 取 6.5 µL 的 500 µM 测试化合物溶液加入 643.5 µL 匀浆液中，使终浓度达到 5 µM（DMSO 含量 ≤1%），随后涡旋混匀。
- 将 RED 小室插入底板中。在每个 RED 小室的供体腔（红色环）中加入 200 µL 加药基质，在每个接收腔中加入 350 µL PBS。每种测试化合物准备 3 个重复小室（三复孔）。用粘性板封膜密封板孔，于 37 °C、200 rpm（1 × g）条件下在温控振荡器中孵育 4 小时。
- 孵育结束后，用移液器轻柔吹打 2–3 次，使供体腔和接收腔内容物充分混匀。从供体腔中吸取 20 µL 匀浆液，加入含 20 µL 新鲜 PBS 的 1.5 mL 离心管中（1:1 稀释）。同样，从接收腔中吸取 20 µL PBS 样品，加入含 20 µL 新鲜匀浆液的离心管中（基质匹配）。8
注意：采用基质匹配法可避免为定量分析分别建立匀浆液和 PBS 中的两条标准曲线。供体腔内容物可能随时间发生沉降，取样前应通过轻柔吹打混匀。
4. 液相色谱-质谱定量与数据分析
- 向每支试管中加入 160 µL 含有 500 ng/mL 双氯芬酸或 10 ng/mL 维拉帕米（内标）的 1:1 甲醇:乙腈溶液，涡旋混合以沉淀蛋白质。在 10,000 × g 条件下离心 5 分钟，使沉淀沉降，然后将上清液转移至 96 孔深孔板中，用于液相色谱-质谱（LCMS）分析。7
- 以与上述样品相同的基质组成为各测试化合物建立 1–1,000 nM 范围内的校准曲线。采用 LC-MS 方法定量测定供体室和接收室样品中测试化合物的浓度。
- 使用公式 1 计算药物在稀释基质中的游离分数（fu）。使用公式 2 计算未稀释基质中的 fu（D = 稀释倍数，为 10）。14
- 使用公式 3 检查各化合物的回收率（质量平衡），以识别存在稳定性、代谢或非特异性结合问题的化合物。
注：回收率通常在 70% 至 130% 之间。15
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结果
利用本方案，我们已测试了数百种结核病药物研发化合物穿透干酪样物质的预测效能。 图1 可视化RED实验的基本原理。RED插入装置中的透析膜允许未结合的小分子从供体孔扩散至接收孔，最终在两个区室之间达到平衡。而与大分子（如蛋白质或脂质）结合的小分子则被截留在供体孔中。对两个区室样品进行定量分析，可计算出未结合组分的比例（fu每种小分子在干酪样物质或替代基质中的分配比例。该比例已被证明与药物在干酪样物质中的渗透性直接相关 体内.7 作为 图2 利用基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱成像，信号强度越高表明 fu，药物向干酪样物质中扩散的程度就越广泛。因此，这一现象与以下假设相吻合：当药物分子从病灶中细胞层与干酪样物质交界面处向其外周扩散时，会与干酪样大分子结合，从而被截留，阻止其进一步向干酪样核心区域扩散。一个包含18种抗结核药物的样本列表见于 表...
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讨论
结核病感染患者的肺部坏死性病灶和空洞中含有对药物治疗具有耐受性的细菌亚群。这些结构的干酪样核心尤其会在细胞外环境中容纳这些持留菌。16 人们认为，抗菌药物在这些远端部位的良好分布是决定结核病药物疗效的重要因素。在本方案得到验证之前，尚无可用的 体外 可预测药物发现化合物在干酪样病变中分布情况的技术。因此，对这些关键病灶中药物分布的评估在很大程度上依赖于动物感染模型、病灶中心药代动力学研究以及基质辅助激光解吸电离质谱成像技术。5,17
本文所述的体外实验是一种快速且有效的方法，可用于预测药物在结核病病灶中的渗透能力，而无需进行耗时且昂贵的体内药代动力学研究。该方案是对血浆蛋白结合实验的改进，而RED装置最初的设计用途正是用于该实验。通过将组织样本均质化至可移液的一致状态，即可使用同一装置测定组织蛋白结合情况。若能从动物感染模型中获得干酪样坏死物（caseum），也可采...
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披露
不存在任何相互竞争的财务利益。
致谢
我们感谢强生公司、结核病联盟、阿斯利康、Rib-X 以及特里厄斯治疗公司分别提供了贝达喹啉、PA-824（普托马尼）、AZD5847、来地唑利和特地唑利。Brendan Prideaux、Matthew Zimmerman、Stephen Juzwin、Emma Rey-Jurado、Nancy Ruel、Leyan Li 和 Danielle Weiner 在 MALDI 分析、生物分析方法、干酪样物质模拟物的制备、化学合成以及兔源干酪样物质的分离方面提供了支持。本研究获得了比尔及梅琳达·盖茨基金会的资助（授予 V. Dartois 的项目编号为 OPP1044966 和 OPP1024050）、美国国立卫生研究院共享仪器资助 S10OD018072，以及比尔及梅琳达·盖茨基金会与惠康信托联合资助的“发展中国家疾病先导优化卓越中心”项目（授予 P. Wyatt）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 新西兰白兔 | Covance | - | |
| HN878 结核分枝杆菌 | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia（氯胺酮）100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased（赛拉嗪）100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol（戊巴比妥钠和苯妥英钠）溶液 | Virbac | 710101 | |
| THP-1 单核细胞系 | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175 cm² 经组织培养处理的培养瓶（T175） | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| 不含谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基 | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone 胎牛血清，经γ射线照射 | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-谷氨酰胺，200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar 组织培养皿，145 mm × 20 mm，带通气孔 | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| 佛波醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯（PMA） | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma | E6758 | |
| 油酸 | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED 装置可重复使用底板 | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED 装置插入件，50/盒 | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED 插入件移除工具 | Fisher Scientific | 89812 | |
| 粘性板密封膜 | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS，pH 7.4，10× 500 mL（Gibco） | Life Technologies | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| 乙腈 | Sigma | 34998 | |
| 甲醇 | Sigma | 34860 | |
| 盐酸维拉帕米 | Sigma | V4629 | |
| 双氯芬酸钠盐 | Sigma | 93484 | |
| 台盼蓝溶液，0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| 乙醇，200 证明 | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| 珠磨均质器配件，金属散装珠 | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R 钴-60 照射器 | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip 一次性血细胞计数板 | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| 直立式光学显微镜 | Leica | DM1000 | |
| 二元液相色谱系统 | Agilent | 1260 | 多组分 |
| 质谱仪 | AB Sciex | 4000 |
参考文献
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