本文展示了一种研究黑腹果蝇（Drosophila）幼虫冷伤害感受的新方法。该方法利用自行构建的帕尔帖探针，可施加局部有害低温刺激，并引发可量化的特异性冷反应行为。该技术将有助于进一步解析冷伤害感受的细胞与分子机制。
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本文内容
摘要
摘要
生物体如何感知并响应有害温度至今仍不清楚。此外，感觉机制致敏过程背后的机制，例如在外周神经病变患者或损伤诱导致敏个体中所出现的情况，也尚未得到充分阐明。这一遗传上易于操作的 果蝇 该模型已被用于研究介导有害热刺激检测所需的细胞和基因， 已鉴定出多个保守的候选基因，但对介导有害低温感知的关键细胞与受体仍知之甚少。尽管如此， 果蝇 无法在低温（≤10 ºC）下长期存活，在行为偏好实验中会回避低温环境，更倾向于选择较高温度；然而，它们如何感知并可能回避有害低温刺激，直到最近才开始被研究。
本文描述并表征了首个用于黑腹果蝇（Drosophila）的有害低温（≤10 ºC）行为检测方法。利用该工具和检测方法，我们向研究者展示了如何对低温伤害性感受行为进行定性和定量评估。该检测可在正常/健康培养条件下进行，也可在疾病、损伤或致敏等背景下进行。此外，该检测可应用于具有特定基因型的幼虫，以研究其对温度感知、疼痛或伤害性感受致敏性的影响。鉴于疼痛是一种高度保守的生物学过程，利用该检测方法进一步研究 热伤害性感受，有望加深我们对包括脊椎动物在内的其他物种疼痛机制的理解。
引言
Drosophila 已被证明在鉴定参与复杂行为的新型保守基因和神经回路方面具有极高价值。果蝇拥有复杂的遗传工具包和简化的神经系统，可实现精确的遗传与神经操控1,2,3,4，从而解析伤害性感受的细胞与分子基础5,6,7。幼虫尤其适用于此类研究，因为针对轻触刺激8,9,10、有害热刺激11,12,13以及有害机械刺激感知4,11的行为学检测方法已经建立，且其透明的幼虫表皮便于对表皮及下方的感觉....
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方案
1. 幼虫的制备
- 在25 ºC培养箱中培养品系或进行遗传杂交。
- 若进行杂交培养，每瓶常规玉米粉果蝇培养基中放入20–25只处女雌蝇和15–20只雄蝇。让雌蝇产卵约48小时后，将其转移至新的培养瓶中。
- 卵产出后4-5天，收集3rd 通过将水流轻轻喷入软质培养基及幼虫中，冲出所需基因型的龄期幼虫，并将内容物倒入一个中等大小的洁净培养皿（60 mm × 15 mm）中。
- 接下来，使用镊子或画笔轻轻按大小对幼虫进行分选，以排除较大的个体 "游走 3rd 龄期" 或弱小病态的幼虫被用于检测。丢弃含有任何不需要的遗传标记或平衡染色体的幼虫。
- 让实验室的另一位成员标记好用于放置分选后幼虫的培养皿或容器，以便实验人员能够 "盲法" 根据幼虫的实验条件或基因型（如适用）进行处理。实验人员可在实验结束后，使用实验室成员生成的密钥对收集的数据应用解码后的标签。
- 使用药匙将一枚硬币大小的新鲜食物转移至一个已标记的洁净培养皿（35 mm × 10 mm 或 60 mm × 15 mm）中，培养皿内加入半满的室温水。
- 使用镊子或画笔将分选后的幼虫轻轻转移至食物上（若预计测试时间超过20分钟，此举可防止幼虫饥饿或干燥）。
2. 冷探针实验....
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结果
Drosophila 幼虫以一种包含偶尔停顿、头部转向和改变方向的蠕动方式运动22。然而，在局部施加有害低温刺激时，幼虫表现出一系列独特的行为反应，不同于对有害热刺激和机械刺激所引发的逃避性侧滚行为。这些行为也不同于对轻触刺激8,9,10或室温探针触碰的反应。低温诱发的行为包括：将身体前段和后段向中部收缩形成身体蜷缩（CT）、将前段和后段抬离平面约45–90°形成U形（US），或仅将后段抬离平面约45–90°（PR）（图1）。需提醒实验人员，这些行为描述为定性指导，而非定量阈值。这些反应可在3–18 °C的低温范围内观察到（图2A）。然而，不同行为在不同低温区间达到峰值（图2B和2C）：P.......
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讨论
此处所述的检测方法可用于定性及定量评估幼虫的伤害感受或伤害感受敏化 不同的遗传背景、环境因素和/或损伤诱导条件。由于该检测方法能够对冷刺激进行局部施加，因此利用此工具可特异性地评估一部分外周感觉神经元在响应低温时的功能。有趣的是，这些由冷刺激引发的行为似乎依赖于与热刺激所激活的感觉神经元不同类型的神经元。7,11，但完整的热伤害感受神经环路尚未被完全阐明. 与其他许多局部伤害性感受检测方法类似，该检测方法在不同操作者之间的应用中可能存在一定变异，具体取决于操作手法 冷探针。然而，冷探针在虫体中部（避开头部和尾部）的具体放置位置似乎对冷反应没有显著影响7通过练习和重复操作，可以最大限度地减少这种用户间的差异性。
我们先前对冷探针实验进行了表征，并报道了产生冷诱发卷曲（CT）反应所需的特异性冷响应神经元和感觉通道7。本文进一步阐述了潜伏期.......
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披露
一种冷探针设计的美国专利申请（CL）正在审批中。有关冷探针部件编号和结构的更多详细信息，以及工具设计方面的额外咨询，可根据要求提供。
致谢
感谢 Sarah Wu 和 Camille Graham 在冷探针实验早期阶段的开发工作，感谢布卢明顿果蝇资源中心（Bloomington Drosophila Stock Center）提供果蝇品系，以及 Galko 实验室成员对稿件的审阅。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）博士后培训基金（NIH F31NS083306）对 HNT 的资助，以及 NIH R01NS069828、R21NS087360 项目和德克萨斯大学 MD 安德森癌症中心基础研究 Clark 奖学金对 MJG 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 冷探针 | Pro-Dev Engineering | 按需定制 | 可根据要求提供零件编号和构造细节 |
| 温控单元 | TE Technology | 定制外壳 | 可根据要求提供零件编号和构造细节 |
| 蔡司 Stemi 2000 体视显微镜 | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 高强度照明器 | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott 双蛇形管 23 英寸光纤导光管 | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| 镊子 | FST | FS-1670 | 用于分选和操作幼虫。使用前应将镊子尖端略微磨平，以降低意外刺穿或损伤幼虫的风险 |
| 画笔 | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | 用于分选和操作幼虫。使用时保持画笔微湿会更方便操作 |
| 35 mm × 10 mm 聚苯乙烯培养皿 | Falcon | 351008 | |
| 60 mm × 10 mm 聚苯乙烯培养皿 | Falcon | 351007 | |
| 一块黑色乙烯基材料（至少 2 英寸 × 2 英寸） | 用于提供对比背景，便于将幼虫定位至冷探针 | ||
| Fisherbrand Scoopula 刮勺 | Fisher Scientific | 14-357Q | 用于转移食物 |
| Kimtech Science 吸水纸 | Fisher Scientific | 06-666A | 当幼虫或冷探针表面湿度过高时，用于吸干多余水分 |
参考文献
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila....
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重印与许可
