新型冷伤害感受检测方法 果蝇 幼虫

摘要

本文展示了一种研究黑腹果蝇（Drosophila）幼虫冷伤害感受的新方法。该方法利用自行构建的帕尔帖探针，可施加局部有害低温刺激，并引发可量化的特异性冷反应行为。该技术将有助于进一步解析冷伤害感受的细胞与分子机制。

摘要

生物体如何感知并响应有害温度至今仍不清楚。此外，感觉机制致敏过程背后的机制，例如在外周神经病变患者或损伤诱导致敏个体中所出现的情况，也尚未得到充分阐明。这一遗传上易于操作的 果蝇 该模型已被用于研究介导有害热刺激检测所需的细胞和基因， 已鉴定出多个保守的候选基因，但对介导有害低温感知的关键细胞与受体仍知之甚少。尽管如此， 果蝇 无法在低温（≤10 ºC）下长期存活，在行为偏好实验中会回避低温环境，更倾向于选择较高温度；然而，它们如何感知并可能回避有害低温刺激，直到最近才开始被研究。

本文描述并表征了首个用于黑腹果蝇（Drosophila）的有害低温（≤10 ºC）行为检测方法。利用该工具和检测方法，我们向研究者展示了如何对低温伤害性感受行为进行定性和定量评估。该检测可在正常/健康培养条件下进行，也可在疾病、损伤或致敏等背景下进行。此外，该检测可应用于具有特定基因型的幼虫，以研究其对温度感知、疼痛或伤害性感受致敏性的影响。鉴于疼痛是一种高度保守的生物学过程，利用该检测方法进一步研究 热伤害性感受，有望加深我们对包括脊椎动物在内的其他物种疼痛机制的理解。

引言

Drosophila 已被证明在鉴定参与复杂行为的新型保守基因和神经回路方面具有极高价值。果蝇拥有复杂的遗传工具包和简化的神经系统，可实现精确的遗传与神经操控^1,2,3,4，从而解析伤害性感受的细胞与分子基础^5,6,7。幼虫尤其适用于此类研究，因为针对轻触刺激^8,9,10、有害热刺激^11,12,13以及有害机械刺激感知^4,11的行为学检测方法已经建立，且其透明的幼虫表皮便于对表皮及下方的感觉神经元进行活体或固定后的成像观察。最近，一种针对有害冷刺激的行为学检测方法也已被开发⁷，本文将对此进行更详细的描述。

使用精细的锥形冷探针，我们发现黑腹果蝇（Drosophila）幼虫在受到低温刺激时表现出一系列特异性的冷反应行为，这些行为不同于正常运动、轻触刺激、强烈机械刺激或高温刺激后所观察到的行为^7,8,11。这些低温特异性行为包括强烈的全身收缩（CT）、后部体节抬高45–90º（PR），以及前后体节同时抬起形成U形（US）。这些行为的发生频率随温度降低而增加，但各自在略有不同的低温条件下达到峰值。近期研究表明，介导CT反应的外周感觉神经元与响应有害热刺激或强烈机械刺激的神经元不同⁷。

与脊椎动物的伤害性感受器类似，Drosophila 多树突（md）外周感觉神经元具有复杂的树突结构，其树突在表皮上广泛分支¹。md神经元存在于幼虫的每个体节中，并将其轴突投射至腹神经索¹⁴。根据树突形态的不同，md感觉神经元可分为四类（I–IV），并具有不同的感觉功能^{4,9,10,15,16,17}。其中，IV类神经元介导幼虫对高温或强烈机械刺激产生的侧身翻滚行为反应⁴，而III类神经元则负责对轻触刺激的反应^9,10，不仅可被低温激活，而且对低温诱发的行为反应也是必需的⁷。III类和IV类神经元均利用特定的瞬时受体电位（TRP）通道，以介导对有害^7,11,18和无害刺激^9,10,17,19的行为反应。此外，幼虫的伤害性感受在损伤后会在细胞²⁰和行为水平^12,21上发生致敏化。

本文所述的实验方法可用于定量分析果蝇幼虫在有害低温（≤ 10 ºC）、无害凉爽（11–17 ºC）至室温（18–22 ºC）范围内的正常或可能改变的行为反应。本实验所采用的低温可直接激活III类感觉神经元，引发显著且可重复的钙离子水平升高以及冷刺激诱发的行为反应，这些反应可进行定性和定量分析⁷。该方法几乎适用于任何基因型的幼虫，也可用于研究经历不同环境条件（如营养改变、损伤、药物处理）的幼虫 ，以确定影响冷伤害感受、伤害性感受敏化或伤害性感受可塑性的遗传和环境因素。鉴于温度感知在多种物种中普遍存在，该实验为研究伤害感受提供了有力工具，可能揭示新的基因靶点或神经元相互作用，从而增进我们对脊椎动物伤害感受机制的理解。

定制的冷探针（参见冷探针，材料表）采用闭环温控帕尔帖装置，通过热传导冷却铝制轴体和锥形探针尖端。一个热敏电阻嵌入在铝制锥形尖端内部 ，将实时温度反馈至控制单元。散热片和风扇连接在热电模块上，用于调节帕尔帖效应产生的热负荷（Qc），从而实现所需的温度范围（22–0 °C）（参见热控单元，材料表）。通过手动将冷探针尖端施加于幼虫背侧中线，作用位置为距前后两端等距的体节（大致为A4体节，参见图1A）。在冷刺激下，幼虫通常会在10 s 的时间截止范围内表现出三种冷诱发行为之一：全身收缩（CT）、前后体节抬高45–90º形成U形（US），或仅后部体节抬高（PR）（见结果部分）。这些行为在正常的蠕动运动或觅食行为中均不会出现，也不同于轻触反应以及对高温或有害机械刺激产生的回避性翻滚反应。

方案

1. 幼虫的制备

1. 在25 ºC培养箱中培养品系或进行遗传杂交。
   1. 若进行杂交培养，每瓶常规玉米粉果蝇培养基中放入20–25只处女雌蝇和15–20只雄蝇。让雌蝇产卵约48小时后，将其转移至新的培养瓶中。
2. 卵产出后4-5天，收集3^rd 通过将水流轻轻喷入软质培养基及幼虫中，冲出所需基因型的龄期幼虫，并将内容物倒入一个中等大小的洁净培养皿（60 mm × 15 mm）中。
3. 接下来，使用镊子或画笔轻轻按大小对幼虫进行分选，以排除较大的个体 "游走 3^rd 龄期" 或弱小病态的幼虫被用于检测。丢弃含有任何不需要的遗传标记或平衡染色体的幼虫。
4. 让实验室的另一位成员标记好用于放置分选后幼虫的培养皿或容器，以便实验人员能够 "盲法" 根据幼虫的实验条件或基因型（如适用）进行处理。实验人员可在实验结束后，使用实验室成员生成的密钥对收集的数据应用解码后的标签。
5. 使用药匙将一枚硬币大小的新鲜食物转移至一个已标记的洁净培养皿（35 mm × 10 mm 或 60 mm × 15 mm）中，培养皿内加入半满的室温水。
6. 使用镊子或画笔将分选后的幼虫轻轻转移至食物上（若预计测试时间超过20分钟，此举可防止幼虫饥饿或干燥）。

2. 冷探针实验

1. 打开冷探针装置，等待数分钟，使其冷却至所需温度。若设定较低温度，探针表面可能会形成冷凝水。
2. 用实验室擦拭纸擦去多余的水分，然后再施加到幼虫上。当探针不立即使用时，应盖上绝缘帽，以起到绝缘作用，同时保持探针尖端清洁并防止损坏。
3. 放置一个中期3^rd 将龄期幼虫置于明亮视野显微镜下的一小片深色可移动乙烯基材料上（通常使用从笔记本装订条上剪下的小片）。黑色乙烯基有助于增强对比度，便于在不接触幼虫的情况下移动其位置，从而使其与探针准确对齐。
4. 调整显微镜（参见 材料表）和光源单元（参见 材料表将亮度调至中等（最大亮度的50-75%），以提供对比度并防止幼虫过快干燥。
5. 丢弃那些未先表现出正常蠕动运动的幼虫 可能会干扰实验结果。幼虫应保持来自培养皿水中的湿润状态，否则幼虫会粘附在乙烯基材料上，影响其正常运动。幼虫周围不应有积水。
6. 以90º角相对于幼虫前后体轴手动推进探针，利用乙烯基膜移动幼虫至正确位置（参见 图1A).
7. 将探针尖端调整方向，使其轻轻覆盖在幼虫背部中线位置，探针与显微镜载物台呈约45º角。
8. 探针接触后，启动实验室计时器。施加足够的向下压力，使幼虫表皮表面产生轻微凹陷，同时仍允许探针向前或向后移动。
9. 将探针固定在原位长达10秒 或直至观察到冷刺激诱发的行为反应（以先发生者为准），随后移除探针。
10. 记录观察到的行为反应及反应潜伏期。若幼虫在10秒内未产生反应 被视为 "无应答者"潜伏期也可在有反应的个体中记录，并用于测量反应强度/幅度的变化。
11. 弃去幼虫，准备下一个样本。
12. 重复步骤 2.3–2.11，直至达到所需数量的测试幼虫（本实验中使用了三组，每组 n = 20–40 条幼虫）。

结果

Drosophila 幼虫以蠕动方式移动，期间伴有短暂停顿、头部转向以及运动方向的改变²²。然而，在局部施加有害低温刺激时，幼虫会表现出一系列独特行为，不同于对有害热刺激和机械刺激所引发的逃避性侧滚反应。这些行为也不同于对轻触刺激^8,9,10或室温探针接触所产生的反应。低温诱导的行为包括：将身体前段和后段向中部收缩形成收缩反应（CT），将前段和后段抬离基面约45–90°形成U形（US），或仅将后段抬离基面约45–90°（PR）（图1）。需提醒实验人员，这些行为描述为定性指导，而非定量判定标准。这些反应可在3–18 °C的不同低温范围内观察到（图2A）。然而，不同类型的行为在不同低温区间内出现频率达到峰值（图2B和

讨论

此处所述的检测方法可用于定性及定量评估幼虫的伤害感受或伤害感受敏化 不同的遗传背景、环境因素和/或损伤诱导条件。由于该检测方法能够对冷刺激进行局部施加，因此利用此工具可特异性地评估一部分外周感觉神经元在响应低温时的功能。有趣的是，这些由冷刺激引发的行为似乎依赖于与热刺激所激活的感觉神经元不同类型的神经元。^7,11，但完整的热伤害感受神经环路尚未被完全阐明. 与其他许多局部伤害性感受检测方法类似，该检测方法在不同操作者之间的应用中可能存在一定变异，具体取决于操作手法 冷探针。然而，冷探针在虫体中部（避开头部和尾部）的具体放置位置似乎对冷反应没有显著影响⁷通过练习和重复操作，可以最大限度地减少这种用户间的差异性。

我们先前对冷探针实验进行了表征，并报道了产生冷诱发卷曲（CT）反应所需的特异性冷响应神经元和感觉通道⁷。本文进一步阐述了潜伏期...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冷探针	Pro-Dev Engineering	按需定制	可根据要求提供零件编号和构造细节
温控单元	TE Technology	定制外壳	可根据要求提供零件编号和构造细节
蔡司 Stemi 2000 体视显微镜	Zeiss	NT55-605
Fiber-Lite MI-150 高强度照明器	Dolan-Jenner Industries.	A20500
Schott 双蛇形管 23 英寸光纤导光管	Schott North America, Inc.	Schott A08575
镊子	FST	FS-1670	用于分选和操作幼虫。使用前应将镊子尖端略微磨平，以降低意外刺穿或损伤幼虫的风险
画笔	Dick Blick Art Materials	06762-1002	用于分选和操作幼虫。使用时保持画笔微湿会更方便操作
35 mm × 10 mm 聚苯乙烯培养皿	Falcon	351008
60 mm × 10 mm 聚苯乙烯培养皿	Falcon	351007
一块黑色乙烯基材料（至少 2 英寸 × 2 英寸）			用于提供对比背景，便于将幼虫定位至冷探针
Fisherbrand Scoopula 刮勺	Fisher Scientific	14-357Q	用于转移食物
Kimtech Science 吸水纸	Fisher Scientific	06-666A	当幼虫或冷探针表面湿度过高时，用于吸干多余水分