我们描述了一种基于表型荧光的神经氨酸酶抑制试验，用于评估甲型和乙型流感病毒对神经氨酸酶抑制剂类抗病毒药物的敏感性。
本文内容
摘要
摘要
神经氨酸酶（NA）抑制剂是目前唯一一类被批准用于治疗和预防流感且对正在流行毒株有效的抗病毒药物。除了用于季节性流感的治疗外，多个国家已储备了NA抑制剂，以应对可能发生的流感大流行。因此，监测流行流感病毒对这类抗病毒药物的敏感性至关重要。目前有多种检测方法可用于评估流感病毒对NA抑制剂的敏感性，但使用荧光底物或化学发光底物的酶抑制试验应用最为广泛，并被推荐使用。本方案描述了一种基于荧光的检测方法，用于评估流感病毒对NA抑制剂的敏感性。该检测方法基于神经氨酸酶裂解底物2′-(4-甲基伞形基)-α-D-N-乙酰神经氨酸（MUNANA），释放出荧光产物4-甲基伞形酮（4-MU）。因此，NA抑制剂对流感病毒神经氨酸酶的抑制效果通过其使NA活性降低50%所需的浓度来确定，该浓度以IC50值表示。
引言
血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是甲型和乙型流感病毒的两种主要表面糖蛋白。HA 可结合细胞表面糖蛋白或糖脂中的唾液酸-半乳糖，而 NA 则通过切割细胞表面半乳糖上的唾液酸，促进病毒的释放1。神经氨酸酶抑制剂是一类合理设计的抗流感病毒药物，可紧密地结合于 NA 的酶活性位点，从而阻止子代病毒的释放与传播。奥司他韦和扎那米韦是两种已在全球多个国家获批用于流感治疗和预防的 NA 抑制剂。近年来，另外两种 NA 抑制剂——帕拉米韦和拉尼那米韦——已在少数国家获批使用。对流感病毒进行 NA 抑制剂敏感性检测，并鉴定导致耐药性的突变，对于评估和监测此类抗病毒药物的有效性具有重要意义。
在过去16年中，基于荧光的神经氨酸酶（NA）抑制试验已在位于墨尔本的世界卫生组织流感参考与研究合作中心（Melbourne WHOCCRRI）常规开展，用于监测流行性流感病毒对抗病毒药物敏感性的变化趋势。每年，有超过2,000株流感病毒被检测其对抗病毒药物的敏感性。在大多数流感季节中，>98%的病毒对所有四种神经氨酸酶抑制剂均敏感2,3,4。然而，在2007-2008年北半球流感季节期间，对奥司他韦（oseltamivir）敏感性降低的既往季节性A(H1N1)病毒数量显著上升5。这类携带NA氨基酸取代H275Y的病毒株至2008年底已传播至全球，导致奥司他韦在全球范围内不再适用于该病毒的治疗。目前绝大多数流行的流感B病毒、流感A(H3N2)病毒以及流感A(H1N1)pdm09毒株均对奥司他韦敏感，尽管全球多个地区已报道出现携带NA氨基酸取代H275Y的A(H1N1)pdm09变异株社区聚集病例，这些变异株对奥司他韦和帕拉米韦（peramivir）的敏感性降低6,7。
由于需要足够高的病毒滴度，临床样本（包括动物鼻腔冲洗液）在进行抗病毒药物敏感性检测之前，必须在细胞培养物或鸡胚中进行传代培养。本文所述的神经氨酸酶抑制试验可分为三个部分：
确定特定荧光计上荧光产物4-甲基伞形酮（4-MU）的线性范围
由于不同荧光计本身存在差异，需要确定荧光终产物4-MU的线性范围及其相对荧光单位（RFU）。一旦确定了该荧光计上4-MU的线性范围，即可选择最佳目标信号，并据此在神经氨酸酶（NA）活性检测中调整流感病毒的浓度。此步骤在针对某一特定荧光计完成之后，无需重复进行。
测定病毒的神经氨酸酶（NA）活性
神经氨酸酶活性检测是一种简单的检测方法，通过将系列稀释的病毒与底物2′-(4-甲基伞形基)-α-D-N-乙酰神经氨酸（MUNANA）混合来进行。利用荧光计测量NA切割MUNANA后生成的荧光终产物4-甲基伞形酮（4-MU）的量。通过绘制荧光单位与病毒稀释度的关系曲线，选择适用于神经氨酸酶抑制试验的合适病毒稀释度。根据所得的S型曲线，其线性部分的中点应对应于第1节中确定的荧光计4-MU线性范围，从而确定第3节中应使用的病毒适当浓度。
使用神经氨酸酶抑制试验评估病毒对神经氨酸酶抑制剂的敏感性
为评估病毒对特定神经氨酸酶抑制剂的敏感性，将第二节中确定稀释度的病毒与一系列浓度的神经氨酸酶抑制剂共同孵育。随后与MUNANA孵育后，通过荧光计以相对荧光单位（RFU）测量未被抑制病毒产生的4-甲基伞形酮（4-MU）。根据抑制病毒神经氨酸酶活性50%所需的神经氨酸酶抑制剂浓度，计算其抑制效果，并以IC50值表示。
方案
1. 在荧光计上确定荧光产物4-MU的线性范围
- 通过将11.3 mg的4-MU溶解于5 mL无水乙醇中，配制10 mL的6.4 mM 4-MU储备液。向该储备液中加入5 mL 0.9% NaCl（w/v），定容至10 mL。取1 mL 6.4 mM 4-MU溶液与9 mL 1×检测缓冲液（33.3 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）和4 mM CaCl₂）混合，稀释配制640 µM的工作液。2，pH 6.5）。
注意：通过加入13 g MES和8 mL 1 M CaCl₂制备2×测定缓冲液2 加入蒸馏水至992 mL。使用10 M NaOH将pH值调节至6.5。使用孔径为0.2 µm的无菌醋酸纤维素滤膜过滤缓冲液。注意！氢氧化钠具有腐蚀性，可能引起皮肤和眼睛的化学灼伤。务必穿戴全套个人防护装备。 - 配制一系列不同浓度的4-MU溶液，总体积为5 mL（即， 5 µM、10 µM、20 µM、40 µM、80 µM、160 µM 和 320 µM）通过使用1x检测缓冲液对640 µM 4-MU进行两倍系列稀释制备。
- 加入50 µL每种4-MU的连续稀释液 (即，5 µM，10 µM，20 µM，40 µM，80 µM，160 µM，320 µM 和 640 µM）（每个稀释度两个孔），加入透明的96孔平底板中，并向其余孔中加入50 µL 1x检测缓冲液（作为测定背景信号的空白孔）。
注意：反应体系（50 µL 4-MU + 50 µL 300 µM MUNANA）中4-MU的最终浓度分别为2.5 µM、5 µM、10 µM、20 µM、40 µM、80 µM、160 µM和320 µM。 - 将25 mg MUNANA溶于20 mL蒸馏水中，配制2.5 mM MUNANA储备液。取0.72 mL 2.5 mM MUNANA与5.28 mL 1×检测缓冲液混合，得到300 µM MUNANA工作液（足够一整块板使用）。用铝箔包裹盛有300 µM MUNANA工作液的离心管，并置于冰上保存，除非立即使用。剩余材料应丢弃。
注意：2.5 mM MUNANA 储备液可在 -20 °C 保存 1 个月，且必须在一次冻融循环内使用完毕。4-MU 和 MUNANA 溶液对光敏感，需避免长时间光照。 - 向每孔中加入50 µL 300 µM MUNANA，轻轻振荡混匀，在37 °C孵育30分钟。使用酶标板封板膜覆盖板孔，防止蒸发。
注意：此步骤旨在校正神经氨酸酶抑制试验中的背景荧光。 - 将 11 mL 无水乙醇与 2.225 mL 0.824 M NaOH 混合，配制终止液（每块板所需体积）。
- 每孔加入 100 µL 终止液以终止反应，并轻轻振荡混匀。
- 按照制造商的说明，使用荧光计在激发波长355 nm、发射波长460 nm的条件下读取酶标板。
- 使用不含4-MU的所有孔的荧光信号计算平均背景信号。将该平均背景信号从含4-MU的各孔信号中扣除，并计算每个4-MU浓度下的平均信号值（RFU）。以RFU为纵坐标，4-MU浓度（µM）为横坐标绘制标准曲线，如图所示 图1a；曲线的近端线性部分如图1b所示。
- 绘制相对荧光单位（RFU）与4-MU浓度（µM）的关系图，以确定线性范围和最佳目标信号；线性范围是指图中荧光信号随4-MU浓度增加而呈正比增长的区间，而最佳目标信号则是线性范围内任意选定的一个4-MU浓度值。
注意：线性范围和最佳目标信号因荧光仪而异。例如，墨尔本世界卫生组织合作中心（WHOCCRRI）的荧光仪线性范围为 2.5–40 µM 4-MU，最佳目标信号约为 30 µM 4-MU，对应约 1,500 RFU。
2. 测定病毒的神经氨酸酶活性
注意：流感病毒可在Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞或鸡胚中培养至足够滴度8。
- 将未稀释的培养流感病毒每孔120 µL加入96孔U型底板的第1列，其余11列每孔加入含0.1% NP-40的1x检测缓冲液60 µL。
- 在孔板中对病毒进行连续倍比稀释即， 使用多通道移液器将60 µL液体从第1列转移至第2列，依此类推，直至第11列，第12列作为空白对照，仅含1x检测缓冲液。
- 从每个孔（稀释的病毒液和空白对照）中转移50 µL至透明的96孔平底板中。
注意：若将材料从第12列转移至第1列，无需更换移液器吸头。 - 每孔加入 50 µL 300 µM MUNANA（按步骤 1.4 制备），轻轻敲击酶标板以混匀。将酶标板置于 37 °C 培育 1 小时，并用酶标板封板膜覆盖，防止蒸发。
- 每孔加入 100 µL 终止液（按步骤 1.6 配制）以终止反应，并轻轻振荡酶标板混匀。
- 使用荧光计读取酶标板。
- 激发波长设置为 355 nm，发射波长设置为 460 nm。
- 根据第12列的荧光读数确定平均背景信号，并从每个孔的读数中减去平均背景信号。绘制RFU相对于病毒稀释度的曲线图。
注意：在墨尔本WHOCCRR流感参比与研究合作中心，100 µM MUNANA的背景值通常介于50至120 RFU之间，但具体数值会因所用荧光计的不同而有所差异。 - 观察相对荧光单位（RFU）随病毒稀释度变化的曲线图，确定每种病毒曲线线性部分的中点图2）。以步骤1中确定的最佳靶信号作为参考点。
注意：此浓度应与第1节中确定的荧光计对4-MU的线性范围相对应，并将提供适用于第3节的病毒适当浓度。
3. 使用神经氨酸酶抑制试验评估病毒对神经氨酸酶抑制剂的敏感性
- 制备浓度为 300 µM 的神经氨酸酶（NA）抑制剂母液。
- 通过将 5.0 mg 的扎那米韦（分子量，MW = 332.32 g/mol）溶解于 50 mL 的 2× 检测缓冲液（66.6 mM MES 和 8 mM CaCl2，pH 6.5）中，制备 300 µM 的扎那米韦溶液。
- 通过将 5.8 mg 的奥司他韦羧酸盐（D-酒石酸盐；MW = 386.44 g/mol）溶解于 50 mL 的 2× 检测缓冲液中，制备 300 µM 的奥司他韦羧酸盐溶液。
- 通过将 5.7 mg 的帕拉米韦三水合物（MW = 382.45 g/mol）溶解于 50 mL 的 2× 检测缓冲液中，制备 300 µM 的帕拉米韦三水合物溶液。
- 通过将 5.2 mg 的拉尼米韦（MW = 346.34 g/mol）溶解于 50 mL 的 2× 检测缓冲液中，制备 300 µM 的拉尼米韦溶液。
注：NA 抑制剂母液可在 -20 °C 下保存 12 个月。请核对 NA 抑制剂的分子量，以确保复溶时使用正确的质量和体积。奥司他韦羧酸盐是前药磷酸奥司他韦的活性成分，因此在 NA 抑制实验中应仅使用奥司他韦羧酸盐。
- 从母液中，在 50 mL 离心管中用 2× 检测缓冲液（66.6 mM MES 和 8 mM CaCl2，pH 6.5）制备 NA 抑制剂的十倍系列稀释工作液，浓度分别为 0.03 nM、0.3 nM、3 nM、30 nM、300 nM、3,000 nM 和 30,000 nM；用于多次检测。
注：反应体系（50 µL 病毒稀释液 + 50 µL NA 抑制剂 + 50 µL 300 µM MUNANA）中 NA 抑制剂的最终浓度分别为 0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1,000 nM 和 10,000 nM。最终浓度不包括加入的 100 µL 终止液。所有 NA 抑制剂稀释液应储存于 2–8 °C。其有效期与母液相同。 - 在含有 0.1% NP-40 表面活性剂的 1× 检测缓冲液中，于 96 孔深孔板中制备病毒稀释液。病毒稀释比例依据第 2 节中 NA 活性检测结果确定。每种病毒使用总体积 2 mL，用于测试四种 NA 抑制剂。
注：在 96 孔深孔板中为每种病毒准备两个孔（每孔 1 mL）。VIRUS 1、2 和 3 的病毒稀释示例见表 1。 - 将所需体积的 NA 抑制剂（按步骤 3.2 制备）加入 8 孔深孔储液槽中，然后将浓度从 0 nM（仅 2× 检测缓冲液）至 30,000 nM 的 NA 抑制剂各 50 µL 分别加入透明平底 96 孔板的 A 至 H 行。
注：板式布局见图 3。 - 向第 1–11 列的每个孔中加入 50 µL 稀释后的待测病毒液，向第 12 列的每个孔中仅加入 50 µL 1× 检测缓冲液。轻轻敲击板面以混匀，并在室温下孵育 45 分钟。用封板膜覆盖板子以防止蒸发。
- 向每个孔中加入 50 µL 300 µM MUNANA（按步骤 1.4 制备），并轻轻敲击板面以混匀。将板置于 37 °C 孵育 1 小时。用封板膜覆盖板子以防止蒸发。
- 向每个孔中加入 100 µL 终止液（按步骤 1.6 制备），并轻轻敲击板面以混匀。
- 使用荧光计读取板内信号。
- 激发波长设为 355 nm，发射波长设为 460 nm，具体如前所述。
4. IC50 值的计算
注意：JASPR v1.2 是一种用于计算 IC50 值的曲线拟合软件。该软件由美国亚特兰大疾病控制与预防中心（CDC）流感科开发。该软件采用以下方程：V=Vmax ×(1-([I]/(Ki +[I]))），其中 Vmax 表示最大代谢速率，[I] 表示抑制剂浓度，V 表示被抑制的反应，Ki 表示抑制曲线的 IC50 值。
- 将荧光仪输出的原始数据复制并粘贴到电子表格中，采用12列板格式（96孔），从单元格A1开始。
注意：每块后续板的原始数据必须间隔一个空行。如果每种病毒已针对四种神经氨酸酶（NA）抑制剂进行了测试，则应将原始数据以四组为单位粘贴（每块板之间留一个空行）。 - 打开拟合软件，点击 "Experiment" 选项卡，选择 "Alternative 2-drug Fluoro 11 Samples"。
- 点击 "Options" 选项卡，并勾选 "Generate Graphs"。
- 再次点击 "Options"，然后点击 "New Key" 选项卡。将 "inhibition_key" .csv 文件保存至与原始数据电子表格文件相同的文件夹中。
- 在 inhibition_key 文件中，于 ID 下方列出所有样本名称。每个样本名称必须唯一。
- 若测试了四种NA抑制剂，则在 Oseltamivir 下方插入两行空白，并输入 "Peramivir" 和 "Laninamivir"。保存对 inhibition_key 文件所做的更改。
- 返回至 "jaspr v 1.2-Inhibition Curve fitting" 窗口，选择原始数据文件作为 "Experiment File"，选择 inhibition_key 作为 "Key File"，运行分析。将结果保存为 .csv 和 .pdf 格式。
注意：软件将自动绘制抑制曲线（RFU 对 NA抑制剂浓度），如 图4 所示。程序还会计算每种病毒对单个NA抑制剂的IC50值（图4）。此外，JASPR 以电子表格形式提供IC50值和信号-背景比（S/B）。背景值因实验室所用荧光仪不同而异。在墨尔本WHOCCRRI，100 µM MUNANA 的背景值范围为50至120 RFU。为获得可靠的IC50值，建议S/B比≥10；尽管低于10的比值仍可接受，特别是对于NA活性极低的突变病毒。 - 检查软件生成的IC50值和曲线形状。所有数据点应落在曲线上或接近曲线；若不符合，应重复NA抑制实验。
注意：对于表现出异常高IC50值的病毒，应重复实验以确认结果。
结果
根据世界卫生组织（WHO）流感抗病毒药物敏感性监测工作组制定的标准化报告指南9，流感病毒对神经氨酸酶（NA）抑制剂的敏感性使用“正常抑制”（NI）、“抑制作用降低”（RI）和“高度抑制作用降低”（HRI）等术语进行报告。NI病毒是指其IC50值与甲型流感病毒参考中位IC50值相比小于10倍（或乙型流感病毒小于5倍）的病毒。RI病毒是指其IC50值高于甲型流感病毒参考中位IC50值10至100倍（或乙型流感病毒为5至50倍）的病毒。HRI病毒是指其IC50值高于甲型流感病毒参考中位IC50值100倍以上（或乙型流感病毒高于50倍以上）的病毒；详见表2。
参考中位 IC50 A(H1N1)pdm09、A(H3N2)以及B/Yamagata/B/Victoria病毒的数值每年均在墨尔本世界卫生组织合作中心（WHOCCRRI）进行计算和更新，以反映IC中的微小变化50 流感病毒株对神经氨酸酶抑制剂的敏感性数值（表3). 半数抑制浓度（IC₅₀）的中位数50 甲型(H1N1)pdm09病毒对四种神经氨酸酶抑制剂的数值几乎相同，但扎那米韦和拉尼米韦的中位IC50 A(H3N2)病毒的数值比奥司他韦和帕拉米韦的IC值高2至4倍50 值（表3). 奥司他韦的中位抑制浓度（IC）50 流感B病毒的IC值通常比扎那米韦、帕拉米韦和拉尼米韦高出5至10倍50 值（表3).
神经氨酸酶抑制剂（NA）抑制试验是一种表型试验，无法提供与耐药性（RI）或高度耐药性（HRI）相关的遗传变异信息。因此，在鉴定出具有RI或HRI的病毒后，必须进行遗传学分析。在墨尔本世界卫生组织合作中心（WHOCCRRI），变异株的NA基因通过Sanger测序和焦磷酸测序进行分析。表4列出了在具有RI和HRI的病毒NA基因中可能发现的代表性氨基酸替换。世界卫生组织（WHO）网站上还提供了更多可影响NAI敏感性的氨基酸替换列表10。
图1：相对荧光单位（RFU）与4-MU浓度的关系。（a）RFU随4-MU浓度（µM）变化的标准曲线。虚线框内显示了荧光计检测4-MU的线性范围。超出线性范围的荧光信号可能会饱和，因此荧光的微小变化可能无法被荧光计检测到。（b）图1a标准曲线中线性部分的放大图，用于确定“最佳目标信号”。墨尔本世界卫生组织合作中心（WHOCCRRI）的荧光计对4-MU的线性范围为2.5–40 µM，最佳目标信号约为30 µM 4-MU，对应约1,500 RFU。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2： 流感病毒神经氨酸酶（NA）活性曲线示例。 NA 活性曲线中每个稀释度的数据点均已减去平均背景值 50.61 RFU。箭头指示每种病毒在 NA 抑制试验中应使用的合适病毒稀释度。为便于病毒稀释液的配制，对于病毒 3，可选择使用 1/100 稀释度代替 1/96 稀释度。请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 神经氨酸酶抑制实验设置的板布局。 每块板包含最后一列，作为阴性对照，其中不含病毒，仅含有1×检测缓冲液（AB）、神经氨酸酶抑制剂、MUNANA和终止液。注意：JASPR使用每块板第12列的读数来确定用于计算IC50值的平均空白信号。请点击此处查看该图的放大版本。
图4： A(H1N1)pdm09病毒株A/Perth/82/2015的抑制曲线及IC50值示例。 JASPR软件以荧光信号（相对荧光单位，RFU）对神经氨酸酶抑制剂浓度（nM）作图，展示随抑制剂浓度递增的抑制曲线，每个数据点均拟合于曲线中。根据该抑制曲线，IC50值定义为抑制50%病毒神经氨酸酶活性所需的NA抑制剂浓度。 请点击此处查看该图的高清版本。
| 病毒 | 所需病毒稀释倍数 | 1× 检测缓冲液体积 (µL) | 表面活性剂-Amps-NP-40 (10%) (mL) | 病毒体积 (mL) |
| 1 | 1/20 | 940 | 10 | 50 |
| 2 | 1/40 | 965 | 10 | 25 |
| 3 | 1/100 | 890 | 10 | 10 |
表1：NA抑制试验中病毒1、2和3的病毒稀释液制备。
| 病毒类型/亚型/谱系 | 正常抑制 | 抑制降低 | 显著抑制降低 |
| (NI) | (RI) | (HRI) | |
| A(H1N1)pdm09 | <10 fold | 10-100 fold | >100 fold |
| A(H3N2) | <10 fold | 10-100 fold | >100 fold |
| B Yamagata 和 B Victoria | <5 fold | 5-50 fold | >50 fold |
表2：世界卫生组织抗病毒工作组推荐的流感病毒对神经氨酸酶抑制剂敏感性分类指南。
| 病毒类型/亚型/谱系 | N | 扎那米韦 | 奥司他韦 | 帕拉米韦 | 拉尼米韦 |
| 中位数（范围）IC50 nM | 中位数（范围）IC50 nM | 中位数（范围）IC50 nM | 中位数（范围）IC50 nM | ||
| A(H1N1)pdm09 | 1,326 | 0.42 (0.1-3.43) | 0.36 (0.01-3.48) | 0.19 (0.07-1.60) | 0.55 (0.05-2.29) |
| A(H3N2) | 1,654 | 0.9 (0.11-4.0) | 0.38 (0.01-3.65) | 0.33 (0.12-3.06) | 1.38 (0.01-9.38) |
| B 山形系和 B 维多利亚系 | 1,115 | 2.2 (1.24-10.72) | 15.12 (2.39-70.75) | 1.36 (0.57-6.67) | 2.89 (1.62-9.15) |
表3：2015年在世界卫生组织合作中心（CCRRI，墨尔本）测定的正常抑制（NI）病毒的中位IC50值及IC50值范围。
| 氨基酸替换 | 型别/亚型/谱系 | 与参考中位 IC50 值相比的 IC50 变化倍数 | |||
| 扎那米韦 | 奥司他韦 | 帕拉米韦 | 拉尼米韦 | ||
| H275Y | A(H1N1)pdm09 | 1 | 557 (HRI) | 123 (HRI) | 2 |
| E119V | A(H3N2) | 1 | 63 (RI) | 1 | 1 |
| H134Y | B Victoria | 1 | 4 | 76 (HRI) | 2 |
| N151T | B Victoria | 4 | 4 | 42 (HRI) | 1 |
| G104E | B Victoria | 1,220 (HRI) | 87 (HRI) | 17,724 (HRI) | 701 (HRI) |
| E105K | B Victoria | 3 | 5 (RI) | 59 (HRI) | 2 |
| I222T | B Victoria | 2 | 7 (RI) | 8 (RI) | 3 |
| H273Y | B Yamagata | 1 | 230 (HRI) | 377 (HRI) | 2 |
| D197N | B Yamagata | 4 | 7 (RI) | 32 (RI) | 3 |
表4：与神经氨酸酶抑制剂敏感性降低（RI）或显著降低（HRI）相关的氨基酸替代位点代表性列表。
| 问题 | 可能原因 | 溶液 |
| 无或低NA活性 | 未检测到病毒或病毒产量较低。 | 临床标本必须在细胞系中进行培养（即 Madin-Darby 犬肾细胞或鸡胚中扩增至较高病毒载量，用于神经氨酸酶抑制试验。 |
| 某些突变病毒即使在病毒载量较高的情况下，其神经氨酸酶（NA）活性也极低。 | 使用纯化的病毒浓度进行检测。较低pH的检测缓冲液（例如 pH 5.3）可以使用。但在比较数据时必须谨慎。 | |
| 神经氨酸酶抑制试验中无或低神经氨酸酶活性 | 未添加病毒。 | 重新稀释病毒。确保将病毒直接加入1x检测缓冲液中。 |
| 使用了错误的病毒稀释度。 | 重复进行神经氨酸酶活性检测。 | |
| 孵育时间不足。 | 确保遵循孵育时间。 | |
| 数据点超出IC范围50 曲线 | 高浓度核酸抑制剂的交叉污染。 | 确保在将稀释后的病毒加入96孔板时，移液器吸头不与神经氨酸酶抑制剂接触。 |
| 如果使用了8孔深孔储液槽，则应弃去原储液槽中的核酸抑制剂浓度溶液，并将核酸抑制剂浓度重新分配至新的8孔深孔储液槽中。 | ||
| NA抑制剂、MUNANA或稀释病毒的体积未等量加入各孔中。 | 使用校准的多通道移液器重复该检测。确保每种试剂等体积加入各孔中。 | |
| 异常高的 IC50 数值 | 病毒浓度过高。 | 重复进行神经氨酸酶（NA）活性检测和神经氨酸酶（NA）抑制检测。 |
| 测试样本包含甲型流感和乙型流感的混合物。 | 采用实时 PCR 检测病毒混合物的存在。 | |
| 样品中的细菌污染 | 在含抗生素的无菌条件下培养病毒。 | |
| 高背景荧光信号 | MUNANA底物可能会随时间降解。 | 使用新的一批MUNANA底物。 |
| 邻孔荧光检测 | 使用黑色96孔平底板 |
表5：神经氨酸酶抑制试验中潜在问题的故障排除。
讨论
目前，多家实验室正在采用荧光法或化学发光法神经氨酸酶（NA）抑制试验，对流感病毒对NA抑制剂的敏感性进行全球监测11,12。其中，荧光法比化学发光法更为常用。尽管两种方法均具有良好的稳健性和可重复性，但基于荧光法测得的IC50值通常高于基于化学发光法的结果，这使得两种方法所得数据之间的直接比较变得困难13。即使采用相同的实验方案，不同实验室产生的数据仍可能存在差异。鉴于实验室之间的此类差异，世界卫生组织（WHO）抗病毒药物敏感性监测工作组制定了一项指南，以协助实现实验室间的比较。该指南不直接比较IC50的绝对值，而是采用相对于各实验室所测试的NA敏感型流感病毒IC50中位值的IC50倍数差异来进行比较。这一标准化方法使得五个合作中心之间的数据得以相互比较，从而实现了全球流感病毒抗病毒药物敏感性数据的年度发布2,3,4。大量流感病毒敏感性数据在公共领域的可获取性，使研究人员能够将其自身实验室获得的IC50数据与这些研究中的数据进行比对。
其他采用类似原理的神经氨酸酶（NA）抑制试验也有商业化试剂盒可供使用。这些商业试剂盒包含即用型试剂（不含神经氨酸酶抑制剂），同样具有良好的可重复性。然而，自行配制的神经氨酸酶抑制试验成本显著低于商业试剂盒，因为大部分试剂均可在实验室内部大量制备，且过去构成试验主要成本的MUNANA底物，目前可从多个供应商以具有竞争力的价格购得。每种流感分离株针对一种药物的检测成本约为1美元（USD）。在墨尔本世界卫生组织合作中心（WHOCCRRI），通过引入自动化液体处理平台，对实验室自建的神经氨酸酶抑制试验进行了改进。除病毒稀释液需手动制备外，其余大部分操作均由液体处理机器人完成。这不仅减少了人工操作，还显著提高了每日可运行的检测数量。
尽管神经氨酸酶（NA）抑制试验具有高度的稳健性，但仍有一些关键步骤需要格外谨慎地完成。首先，NA抑制剂浓度的任何不准确都会导致抑制曲线和IC50值发生偏移；因此，在配制NA抑制剂浓度时应格外仔细。其次，精确的移液操作和准确的孵育时间对于在不同试验之间保持结果的一致性至关重要；这可以通过使用经过校准的移液器和计时器来实现。每次试验中均应包含对照病毒，以便在不同试验之间以及长期监测试验性能。第三，由于季节性流感病毒的NA酶活性在pH 6.5时最佳，因此试验缓冲液的正确pH值非常重要。一些研究报告指出，使用较低的pH条件可能有助于更好地识别流感变异株，例如携带R292K突变的A(H7N9)变异株14,15。然而，调整试验缓冲液的pH值会导致IC50值发生变化，这可能使实验室内部以及实验室之间的数据比较变得复杂。其他可进行的修改和故障排除措施列于表5中。
神经氨酸酶抑制剂是目前唯一一类对流行性流感病毒有效的获批抗病毒药物。在其他类别的抗病毒药物可用于临床之前，针对流行性流感病毒的抗病毒敏感性监测将仅集中于神经氨酸酶抑制剂。由于神经氨酸酶抑制试验结果具有操作简便和可重复性强的优点，该方法将继续用于评估流感病毒对神经氨酸酶抑制剂的敏感性。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
墨尔本世界卫生组织流感参比与研究合作中心由澳大利亚政府卫生部提供支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 甲型和乙型流感病毒 | 在MDCK细胞或9日龄无特定病原体（SPF）的鸡胚中培养 | ||
| 马迪-达比犬肾（Madin-Darby Canine Kidney, MDCK）细胞 | ATCC | PTA-6500 | |
| 2-(4-甲基伞形基)-α-D-N-乙酰神经氨酸（MUNANA） | Biosynth AG | M-5507 | |
| 2-(4-甲基伞形基)-α-D-N-乙酰神经氨酸（MUNANA） | Sigma | M8639 | |
| 4-甲基伞形酮（4-MU） | Sigma | M1381-25G | |
| 2-[N-吗啉]乙磺酸（MES水合物）（游离酸） | Sigma | M8250-250G | |
| 氯化钙（CaCl2） | APS AJAX Finechem | 127-500G | |
| 表面活性剂-Amps-NP-40（10%溶液） | Thermo Fisher Scientific | PIE28324 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | APS AJAX Finechem | 482-2.5KG | |
| 无水乙醇 | APS AJAX Finechem | 214-2.5L GL | |
| 96孔透明平底板 | NUNC | 456537 | |
| 96孔U形底板 | Greiner Bio-one | 4650101 | |
| 8通道深孔板 | Pacific Laboratory Products | RES-MW8-HP | |
| 96孔深孔板，2.0 mL方形孔 | Pacific Laboratory Products | P-2ML-SQ-C | |
| 板封膜 | Thermo Fisher Scientific | 236366 | |
| 瓶顶式真空过滤系统（硝酸纤维素膜，孔径0.2 μm，膜面积33.2 cm2，过滤容量500 mL） | Sigma-Aldrich | CLS430758-12EA | |
| 单通道移液器（1 µL - 1,000 µL） | 多种供应商（例如 Eppendorf, Sartorius） | ||
| 多通道移液器 | 多种供应商（例如 Eppendorf, Sartorius） | 8或12通道电子及手动移液器（体积范围5 - 1250 µL） | |
| 移液器吸头（1 µL - 1,250 µL） | 多种供应商（例如 Eppendorf, Sartorius） | ||
| 一次性移液管（10 mL和25 mL） | Greiner Bio-one | P7740-200EA 和 P7865-200EA | |
| 移液控制器 | Eppendorf | 4430000018 | |
| 50 mL离心管 | BD Bioscience | 352070 | |
| 带架试管 | Scientific Specialties, Inc. | 1750-00 | |
| 荧光计，激发波长设定为355 nm，发射波长设定为460 nm | ThermoFisher Scientific | ASCENT FL 374 | |
| Ascent软件 | ThermoFisher Scientific | 5185410CD | |
| 设定为37 °C的培养箱 | Lab Supply | Biocell 1000 | |
| 扎那米韦 | 葛兰素史克（GlaxoSmithKline） | 需直接向公司申请 | |
| 奥司他米韦羧酸盐 | 罗氏（Roche） | ||
| 帕拉米韦（Peramivir, BCX-1812） | BioCryst | ||
| 拉尼米韦（Laninamivir, R-125489） | 第一三共（Daiichi-Sankyo） | ||
| JASPR v1.2 | 美国中国台湾亚特兰大疾病控制与预防中心（CDC）流感部 | 可免费申请获取（fluantiviral@cdc.gov） |
参考文献
- Moscona, A. Neuraminidase inhibitors for influenza. N.Engl.J.Med. 353 (13), 1363-1373 (2005).
- Hurt, A. C., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 132, 178-185 (2016).
- Meijer, A., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 110, 31-41 (2014).
- Takashita, E., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 117, 27-38 (2015).
- Lackenby, A., et al. Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A(H1N1) viruses in Europe. Euro Surveill. 13 (5), (2008).
- Hurt, A. C., et al. Community transmission of oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 influenza. N Engl J Med. 365 (26), 2541-2542 (2011).
- Takashita, E., et al. Characterization of a large cluster of influenza A(H1N1)pdm09 viruses cross-resistant to oseltamivir and peramivir during the 2013-2014 influenza season in Japan. Antimicrob Agents Chemother. 59 (5), 2607-2617 (2015).
- Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
- Meetings of the WHO working group on surveillance of influenza antiviral susceptibility - Geneva, November 2011 and June 2012. Wkly Epidemiol Rec. 87 (39), 369-374 (2012).
- A summary of amino acid substitutions in the influenza neuraminidase associated with resistance or reduced susceptibility to NAIs. WHO. , Available from: http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/avwg2014_nai_substitution_table.pdf?ua=1 (2016).
- Okomo-Adhiambo, M., Hurt, A. C., Gubareva, L. V. The chemiluminescent neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 95-113 (2012).
- Hurt, A. C., Okomo-Adhiambo, M., Gubareva, L. V. The fluorescence neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 115-125 (2012).
- Analysis of IC50 data. isirv Antiviral Group (isirv-AVG). , Available from: https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data (2016).
- Sleeman, K., et al. R292K substitution and drug susceptibility of influenza A(H7N9) viruses. Emerg Infect Dis. 19 (9), 1521-1524 (2013).
- Gubareva, L. V., Robinson, M. J., Bethell, R. C., Webster, R. G. Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guanidino-Neu5Ac2en. J Virol. 71 (5), 3385-3390 (1997).
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