在小鼠胚胎干细胞结构功能研究使用重组酶介导的盒式交换

Summary

蛋白质常含有可发挥不同的细胞功能多个域。基因敲除（KO）不考虑这个功能的多样性。这里，我们报告在KO胚胎干细胞的重组介导的盒式交换（RMCE）系的结构 - 功能的方法，其允许各种功能结构域或蛋白质的变体的分子清扫。

Abstract

在小鼠胚胎或胚胎干细胞（mESCs）基因工程允许对于给定的蛋白质的功能的研究。蛋白质是细胞的工作母机和经常由多个功能性结构域，其可以通过翻译后修饰的影响的。整个蛋白在有条件的或组成型敲除（KO）小鼠的耗尽不考虑这一功能多样性和调节。先前报道的mESC的线和衍生的小鼠模型，其中停靠位点FLPE重组介导的盒式交换（RMCE）插入所述ROSA26（R26）基因座内，被。在这里，我们在结构与功能的办法，允许多域蛋白质的不同功能的分子解剖报告。为此，RMCE兼容小鼠必须用基因敲除小鼠杂交，然后RMCE兼容KO mESCs必须隔离。接着，推定救援构建体的面板可以被引入到经由RMCE targeti的R26轨迹NG。所述救援候选的cDNA可以使用重组克隆的靶向载体的RMCE位点之间很容易地插入。接着，KO mESCs被转染的化合物，连同FLPE重组酶表达质粒靶向载体。 RMCE重新激活在ROSA26停放地点的启动子的新霉素抗性基因，并允许正确的靶向事件的选择。以这种方式，获得接近100％的高效率的定位，从而允许在一个半高通量的方式多个推定的救援构建体的插入。最后，R26驱动救援构建体的多个可以针对其营救在亲本KO mESCs观察到表型的能力进行测试。我们目前在P120连环蛋白（p120ctn各）使用内胚层分化的胚状体（EB）的表型读数KO mESCs一个验证的原理结构与功能的研究。这种方法使重要领域的确定，假定下游途径，与疾病相关的点背后对于给定的蛋白质KO表型的突变。

Introduction

据估计，哺乳动物的基因组包含约20000个蛋白质编码基因。选择性剪接和翻译后修饰进一步增加蛋白质的剧目。蛋白具有模块化结构¹和通常包含多个相互作用结构域，其允许其招募不同的蛋白质复合物以及它们在多种细胞过程²的参与。一个例子是所谓的p120ctn各多功能蛋白。 p120ctn各由Ctnnd1基因编码，并且由通过N端和C端区域侧接的大型中央犰狳重复结构域。的p120ctn各犰狳域结合经典钙黏着蛋白，其参与细胞 - 细胞粘着的高度保守的近膜结构域，但它也结合所述转录阻遏Kaiso。 p120ctn各的N-末端结构域具有不同的激酶，磷酸酶，小RhoGTPases，和微管相关p相互作用roteins ^3。有趣的是，作为选择性剪接的结果，可以从四个备选起始密码子⁴产生同种型p120ctn各。亚型p120ctn各1A是最长的，因为它是从最-5' 翻译起始密码子，并含有全长N-末端片段。在同种型中p120ctn各3和4所示，该N端片段部分和完全，分别删除。了解蛋白质（或蛋白质亚型）和他们的域名在不同的细胞功能的确切作用仍然是一个挑战。

基因靶向mESCs使蛋白质功能的研究，通过相应基因的基因缺失和发育的重要疾病相关的基因和通路的识别已经广泛贡献。这一突破在反向遗传学在mESC的分离和....

Protocol

在老鼠身上所有的实验都按照制度，国家和欧洲法规的动物进行。

1. RMCE兼容KO mESCs的分离

1. 繁殖与RMCE兼容的小鼠，如ROSALUC小鼠¹⁰或ROSA26-iPSC集小鼠²¹杂合敲除小鼠。既RMCE兼容小鼠维持混合129 / C57BL6 /瑞士背景。
   注:杂合子基因敲除小鼠穿越建议克服纯合子基因敲除小鼠胚胎致死。
2. 使用PCR以选择包含在R26轨迹¹²的RMCE盒杂合敲除小鼠。
3. 品种杂合子基因敲除小鼠RMCE兼容，杂合子基因敲除小鼠和隔离RMCE兼容，纯合KO囊胚。
   1. 成立时间交配在傍晚和检查交配第二天早上插头。
      注:插头由从男性的凝结和水疱腺体分泌物凝固的。这些插头填补了女性的阴道，并持续8 - 繁殖后24小时。堵塞的女性被认为是携带0.5 DPC（天交配后）的胚胎。
      1. 要检查插头，她的尾巴根部提起女性，并通过检查她的白色大众阴道口。传播外阴的嘴唇与斜角探头稍当插头是很难看到的。从她们的男性单独插入女性。
   2. 在3.5 DPC收集囊胚。
      1. 经批准的方法（ 例如，颈椎脱位）安乐死怀孕的女性。做一个切口midventral和解剖子宫输卵管和使用细剪刀和镊子（仍然彼此连接）。
      2. 弯曲26....

Results

以分离RMCE兼容KO mESC的线的过程在图2中被描绘。连续两个育种需要获得RMCE兼容KO囊胚。首先，杂合基因敲除小鼠与RMCE兼容小鼠杂交获得RMCE兼容，杂合子基因敲除小鼠。然后将这些小鼠用于与其它杂合敲除小鼠交配定时以获得3.5-DPC，RMCE兼容，纯合KO胚泡。获得这样的胚的机会是八分之一的，由孟德尔遗传所预测。因此，需要一种有效的隔离mESC的协议。使用pluripotin基或21-基于协议，我们分别是能够分离mESCs线，包括RMCE兼容p120ctn各KO mESCs，具有约94％（N = 114个胚泡）和64％（N = 22个胚泡）的效率， ^12，19。典型地，胚泡舱口之间后3和6天在vi卓（DIV）培养;这之后是ICM长出的至MEF中或到明胶包被的培养皿附件。在第12天，大ICM长出形成忠实地产生mESC的线（ 图2）。由于这种高效率的mESC的分.......

Discussion

我们mESC的隔离方法是用户友好，不需要高深的技能或设备，如囊胚显微外科。因此，这种技术是相当大的比重，科学界的访问。任何人只要有基本的细胞培养经验可以传播ICM长出，并建立mESCs线。然而，囊胚的冲洗和处理需要一些练习。甲口移液管用于传递胚泡，由微量移，微量吸管保持器，管道和抽吸嘴件²⁸的。微量可以通过加热巴斯德吸管的部分最好为几秒钟，从火焰中除去移液管，并拉动两端定制。 （ - 200微米100），其直径大于胚泡稍大选择针。针可以用蒸馏水（3×）和EtOH（3×）洗涤后可重复使用。根据我们的经验，基于pluripotin-mESC的隔离效率相比更高至2I-基于协议^12。然而，在高浓度下使用的pluripotin已显示诱导基因组不稳定^19。

基于RMCE-R26靶向在mESCs通常产生20 - G418选择后40菌落。如果观察到更多的殖民地，这意味着G418浓度不是最佳的，并且允许非目标mESCs生存，影响整体目标的效率。因此，建.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ROSALUC 小鼠	内部		冷冻精子
R26-iPSC 内部	制造的		小鼠 可根据要求提供冷冻精子
容器探针	精细科学工具	10160-13	检查交配塞
M2 培养基	Sigma-Aldrich	M7167	制成等分试样并储存在 -20 °;C
细镊子（Dumont #5 标准尖学生镊子）	精细科学工具	11251-10	使用前用 70% 乙醇喷雾（不要高压灭菌）
23 G 针	细喷射	8697
1 mL 注射器	Soft-ject	6680
60 毫米细菌级板（用于冲洗）	Gosselin	BB60-01
制造的		口腔移液器	参见讨论
小鼠胚胎成纤维细胞（MEF，TgN （DR4）1 Jae 菌株）	ATTC	SCRC-1045
TgN （DR4）1 Jae 小鼠	杰克逊实验室	3208
丝裂霉素 C	Sigma-Aldrich	M0503
不含钙或镁的磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Gibco	14190-094
Tg（DR4）1Jae/J 小鼠	JAX	3208	小鼠，包含四个药物选择基因和 DR4 MEFS 赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素和 6-硫鸟嘌呤
0.1% 明胶	Sigma-Aldrich	G1393	将 0.5 g 溶于 500 mL 蒸馏水中，高压灭菌并储存在 4°C 下。
胰蛋白酶 （0.25%）	Gibco	25200-056
2 μM pluripotin	Cayman Chemical	10009557
pRMCE-DV1	BCCM/LMBP 集合	LMBP 08870	公开可从 BCCM/LMBP 集合中获得 （http://bccm.belspo.be）
cre 切除的 pRMCE-DV1	BCCM/LMBP 集合	LMBP 08195	公开，可从 BCCM/LMBP 集合 （http://bccm.belspo.be）获得
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA	Addgene	20733
热休克能力 DH5α 细菌	自制
Gateway pDONR221 载体	Thermo Fisher	12536-017	含有卡那霉素抗性基因
BP 克隆酶 II 混合物	Thermo Fisher	11789-020
LR 克隆酶 II 混合物	Thermo Fisher	11791-020
Luria 肉汤 （LB）
氨苄西林
Applied Biosystems 3730XL DNA 分析仪	Thermo Fisher	3730XL
G418 Thermo	Fisher	11811-023
Lipofectamine 2000 转染试剂	Thermo Fisher	11668027
Lipofectamine LTX 转染试剂	Thermo Fisher	15338100
Effectene 转染试剂	Qiagen	301425
GATEWAY pENTR 1A 载体	Thermo Fisher	A10462	重组兼容载体
小鼠单克隆抗 p120ctn 抗体	BD 转导实验室	610134
小鼠单克隆抗钙粘蛋白抗体	BD 转导实验室	610181
通用设备
无菌解剖工具			用于解剖子宫的细剪刀和镊子
无菌移液器：5 mL、10 mL 和 25 mL
15 mL 和 50 mL 锥形离心管
96 孔培养板 V 形底和平底）
培养皿：24 孔、12 孔和 6 孔
多通道移液器（用于移液 30、50、100 和 200 μL）
无菌多通道储液槽
获得层流
进入 37 °C 含 5% CO2
使用倒置显微镜
使用台式离心机
使用透射光体视显微镜
培养基
MEF 培养基			储存在 4 &°;C;37 °C 温暖 30 分钟;C 使用
Dulbecco's 修改后的鹰's 培养基 （DMEM）	Gibco	41965-062
10% 胎牛血清 （FBS）	Sigma-Aldrich	F-7524
L-谷氨酰胺 （2 mM）	Gibco	25030-024
丙酮酸钠 （0.4 毫米）	吉布科	11360-039
青霉素 （100 U/mL）	Gibco	15140-122
链霉素 （100 µg/mL）	Gibco	15140-122
基于 SR 的 mESC 培养基			储存在 4 °C;37 °C 温暖 30 分钟;C 使用前
DMEM/F12	Gibco	31330-038	以 1：1 的比例混合
15% 敲除血清替代物 （SR）	Gibco	10828–028
L-谷氨酰胺 （2 mM）	Gibco	25030-024
0.1 mM 非必需氨基酸	Gibco	11140-050
青霉素 （100 U/mL）	Gibco	15140-122
链霉素 （100 µg/mL）	Gibco	15140-122
&β;-巯基乙醇 （0.1 mM）	Sigma-Aldrich	M 3148
2,000 U/mL 重组小鼠 LIF	（IRC/VIB 蛋白质服务设施）
<>基于 FBS 的 mESC 培养基（类似于基于 SR 的 mESC 培养基）			储存在 4°C;30&37 度温暖 37 分钟;C 使用前
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
差异培养基			储存在 4 °C;37 °C 温暖 30 分钟;C 使用前 Iscove
改良型 Dulbecco 培养基 （IMDM）	Gibco	21980-032
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
5% CD 杂交瘤培养基 （1x） 液体	吉布科	11279-023
2 毫米 L-谷氨酰胺	Gibco	25030-024
0.4 mM 1-硫代甘油	Sigma-Aldrich	M-6145
50 μg/mL 抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A-4544
青霉素 （100 U/mL）	Gibco	15140-122
链霉素 （100 µg/mL）	Gibco	15140-122
2i
1 μM Erk 抑制剂 PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408
3 μM Gsk3 抑制剂 CHIR99021	Axon Medchem	Axon 1386