通过光谱流式细胞术分析从实体组织中分离的细胞悬液

摘要

本文介绍了光谱流式细胞术，这是一种流式细胞术的新方法，利用发射光谱的形状来区分荧光染料。该方法采用一种算法替代补偿，并可将自发荧光作为一个独立参数进行处理。这种新方法使得对从实体器官中分离的细胞进行准确分析成为可能。

摘要

流式细胞术在过去40年中被用于定义和分析淋巴细胞及其他造血细胞的表型。最初仅限于分析少数几种荧光染料，目前已有数十种不同的荧光染料，且可同时组合使用多达14至18种不同染料。然而，仍存在若干限制因素影响其分析能力。由于荧光探针种类繁多，数据处理变得日益复杂，需要构建大型多参数补偿矩阵。此外，现已开发出携带荧光蛋白的转基因小鼠模型，可用于检测和追踪不同组织中的特定细胞类型，因此需要通过流式细胞术分析来自实体器官的自发荧光细胞悬液。光谱流式细胞术通过区分宽波长范围内发射光谱的形状，解决了其中部分问题。该技术采用一种算法对数据进行分析，取代了传统的补偿矩阵，并将自发荧光作为一个独立参数进行处理。因此，光谱流式细胞术能够区分发射峰相近的荧光染料，并可在无需补偿的情况下实现多参数分析。

本方案描述了光谱流式细胞术分析，可实现21参数（19种荧光探针）表征，并能有效管理自发荧光信号，从而在稀有细胞群检测中提供高分辨率。本文展示的结果表明，相较于传统流式细胞术难以表征的组织（如心脏和肠道）中的细胞群体分析，光谱流式细胞术具有显著优势。因此，光谱流式细胞术展现了高性能传统流式细胞术所具备的多参数分析能力，同时无需进行补偿校正，并可实现对自发荧光的有效管理。

引言

在过去的几十年中，流式细胞术（FCM）已成为一种广泛应用的分析方法，是细胞表型研究中不可或缺的技术。可用于标记的荧光染料种类显著增加，尤其是可被紫激光（405 nm）激发的荧光染料例如， 荧光染料的种类不断增多（如 Brilliant Violet 和新型量子点染料），但可用荧光染料的增加也带来了发射光谱重叠的风险，需要耗费大量人力的补偿矩阵校正。流式细胞术（FCM）已广泛用于分析来自实体组织的细胞悬液，但自发荧光细胞的存在限制了对特异性标记细胞群体的分辨。

光谱流式细胞术（spectral FCM）的基本原理已在Futamura et al.^1,2中详细报道。简而言之，本研究中使用的光谱流式细胞仪（见材料表）配备有405 nm、488 nm和638 nm激光器。该光谱流式细胞仪通过一个32通道线性阵列光电倍增管（32ch PMT）采集500 nm至800 nm范围内的全部发射荧光光谱，同时配备两个独立的光电倍增管分别用于420 nm至440 nm和450 nm至469 nm波段，从而取代传统的带通滤光片。488 nm激光光斑与405 nm/638 nm激光光斑在空间上相互分离，而405 nm与638 nm激光光斑则共线排列。对于每一个单独的颗粒，光谱流式细胞仪可检测由405 nm和488 nm激光激发产生的最多66个通道的....

方案

所有实验均根据巴斯德研究所伦理宪章和欧盟指南进行，并获得法国农业部批准。

1. 成年小鼠器官单细胞悬液的制备

1. 脾细胞的分离
   1. 通过颈椎脱位处死成年小鼠。在腹部正中线做切口，并用剪刀剪开皮肤。用镊子取出脾脏。
   2. 将脾脏置于两片载玻片之间碾碎以分散细胞，并用5 mL含1%胎牛血清（FCS）的Hank's平衡盐溶液（HBSS）稀释。
   3. 在 120 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。
   4. 将沉淀重悬于5 mL含1%胎牛血清的HBSS中。使用台盼蓝活体染色法，并用布雷尔计数板进行细胞计数。
      注意：应从一个成年脾脏中获得8000万个细胞。
2. 从小肠中分离细胞
   1. 通过颈椎脱位法处死成年小鼠。使用剪刀在腹部正中线处的皮肤做一切口。用镊子一只手夹住小肠，另一手用剪刀在小肠两端进行剪切：首先在胃之后，然后在小肠末端、大肠之前。使用带针头的2 mL注射器，以1×Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗小肠。
   2. 将小肠置于一张纸巾上，用一把锋利的剪刀小心地剪除派伊尔结。
   3. 用剪刀将剪刀的一侧刀刃插入肠管，沿肠管长轴方向剪开。用锋利的剪刀将打开的肠管切成约1 cm长的小段。

结果

用于分析脾细胞的21参数光谱流式细胞术检测方案

图1 显示了应用19色荧光抗体组合对脾细胞进行检测所获得的结果，该组合包含识别T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞和髓系细胞亚群的不同抗体，其中CD45标记所有造血来源的有核细胞。该抗体组合还包括活力染料（PI）以及细胞大小（FSC）和颗粒度（SSC）参数。 图1A 显示参考荧光染料光谱。在排除CD45标记的死细胞后⁺ 门控（图1B），分析结果表明 CD3⁺ T细胞表达TcRβ链，并具有预期的CD4/CD8分布及CD25阳性细胞比例⁺ CD4 T细胞中的细胞。CD8 T细胞中表达CD44和Ly49D的细胞呈正态分布。CD19⁺ B细胞共同表达B220和MHCII，以及IgM和IgD，这是成熟脾B细胞的典型特征。NK1.1的一.......

讨论

传统的流式细胞术（FCM）基于检测荧光探针被激发后发射的光子。一种荧光染料在设计用于检测另一种荧光染料信号的检测器中产生的荧光发射，会引起物理上的信号重叠。这种发射光谱之间的溢出需要通过补偿进行校正。

光谱流式细胞术结合非混合去卷积算法进行数据处理，可实现发射峰相近但光谱形状不同的荧光染料组合使用，无需额外补偿。该分析算法将自发荧光视为独立参数，从实体组织细胞悬液中扣除非特异性荧光。

采用19种荧光染料组成荧光染料组合，仅使用两束激光（488 nm和405 nm）即可分析免疫细胞。实际上，当开启638 nm激光时，32通道光电倍增管（PMT）中对应于该激光激发波长的部分通道将无法使用。为了最大限度地利用PMT的检测能力，关闭了红色激光。对小鼠脾脏细胞进行了分析，能够检测到超过12种不同的细胞群体，其中部分细胞群占造血细胞的比例不足1%。

为了测试光谱流式细胞术处理自发荧光的能力，研究了两种可能影响分析结果的不同情况：一种是淋巴细胞被上皮细胞污染，另一种是分析具有自发荧光的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠	Janvier Labs	CD45.2	细胞来源
70% 乙醇	VWR	83801.36	消毒
DPBS（含Ca2+，含Mg2+）	GIBCO ThermoFisher	14040-174	胚胎收集
Hanks' 平衡盐溶液（含Ca2+，含Mg2+）（HBSS+/+）	GIBCO Life ThermoFisher	14025092	解离、消化和染色溶液
Hanks' 平衡盐溶液（不含Ca2+，不含Mg2+）（HBSS-/-）	GIBCO Life ThermoFisher	14175095	解离、消化和染色溶液
胎牛血清（FCS）	EUROBIO	CVFSVF00-0U	解离、消化和染色溶液
胶原酶	Sigma	C2139	酶解溶液
90 × 15 mm， 塑料组织培养培养皿	TPP	T93100	胚胎和心脏收集
35 × 15 mm， 塑料组织培养培养皿	TPP	T9340	心脏收集
精细虹膜剪刀	Fine Science Tools	14090-09	解剖工具
粗镊子（窄型镊子，弯曲，12 cm）	Fine Science Tools	11003-12	解剖工具
精细镊子（Dumont 7号镊子）	Fine Science Tools	11272-30	解剖工具
手术刀	VWR	21909-668	解剖工具
LEICA MZ6 解剖显微镜	LEICA	MZ6 10445111	取样；目镜 W-Pl10x/23
冷光源灯	SCHOTT VWR	KL1500 compact	取样； 配备两条鹅颈光纤
FACS 管	VWR	60819-310	细胞消化
96孔板（圆底）	VWR	10861-564	细胞染色
尼龙网筛布（已灭菌）， 50/50 mm 片状	SEFAR NITEX	SEFAR NITEX	细胞过滤
UltrasComp eBeads
荧光标记抗体	Biolegend	货号见下表	细胞染色