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自由活动小鼠中使用棱镜探针和微型荧光显微镜进行多层皮层 Ca2+ 成像

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DOI：

10.3791/55579

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2017年6月13日

 ,  , 
1Inscopix Inc.

本文内容

摘要

本文介绍了一种在自由活动的小鼠中，跨多个皮层以细胞分辨率进行大规模 Ca2+ 成像的操作流程。通过使用微型头戴式显微镜结合植入式棱镜探针，可同时观察数百个活跃的细胞。

摘要

在体神经环路与细胞水平的功能成像技术是理解大脑活动的关键工具。利用双光子显微镜对小鼠大脑皮层神经元进行高分辨率成像，已为皮层的结构、功能及可塑性研究提供了独特的见解。然而，这些研究通常局限于头部固定的动物，极大地限制了可研究的行为复杂性。本文中，我们描述了一种在自由活动小鼠中，对多个皮层层次进行长期、细胞分辨率荧光显微成像的操作流程。我们采用集成化的微型荧光显微镜，结合植入式棱镜探针，在数天内同步观察并记录小鼠执行新物体探索任务时，体感皮层多个皮层层次中数百个神经元的钙动力学变化。该技术可推广应用于其他物种的不同脑区，以及多种其他行为范式的研究。

引言

大脑皮层在许多复杂的认知和行为功能中起着关键作用，从注意力、感觉知觉和自上而下的认知控制1,2,3，到动机、奖赏以及成瘾通路4,5。理解支撑其功能的计算过程，是推动对多种精神和行为障碍获得更佳临床认识的重要目标。

目前许多精神疾病理论均围绕一个观点展开，即皮层神经环路功能障碍或失协调可能是精神分裂症6、自闭症7或强迫症8等疾病特征性认知与行为异常的基础。因此，在同步获取行为信息的适当背景下，获得皮层环路的群体神经活动数据具有重要意义，理想情况下还可针对特定细胞类型，以实现对神经环路更精细的解析。

微型显微镜结合可植入的梯度折射率（GRIN）微透镜，可在自由活动条件下实现对多种脑区神经元群体的光学观测9,10,11,12,13，包括大脑皮层14,15,16。利用与遗传编码的钙指示剂耦合的移动显微成像系统，可在数天至数周内对包含数百个神经元的同一细胞群体在多个脑区进行稳定成像9，并可通过病毒载体或转基因技术将成像特异性地靶向特定类型的细胞。

由于大脑皮层的不同功能及其与不同脑区的连接取决于皮层各层中细胞的位置17,18,19我们希望在清醒且自由活动的受试者中获取多层神经元活动的同步数据。本文展示了如何利用微型化荧光显微镜对自由活动的小鼠脑内数百个荧光标记的神经元进行连续数天的成像。20 结合植入式棱镜探针，可提供大脑皮层的多层视图（图1).

此处使用的棱镜探针由两个独立的梯度折射率（GRIN）透镜组成：一个棱镜和一个柱状中继透镜（图1）。显微镜发出的光经探针棱镜部分的斜边反射后，激发位于棱镜探针成像面附近的荧光标记细胞。细胞发射的荧光同样经棱镜斜边反射，通过显微镜物镜收集，并最终到达显微镜的传感器。本实验所用的棱镜探针经过适配设计，可方便地与标准立体定位设备配合使用。

微型荧光显微镜20可在单细胞分辨率下检测神经元群体中动作电位引发的Ca2+瞬变信号，前提是这些细胞已特异性地标记了对Ca2+敏感的基因编码荧光指示剂。在本实验方案中，我们注射携带Ca2+指示剂的病毒载体（AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40），植入棱镜探针，安装显微镜，随后在动物自由探索过程中接触新物体表面时，获取其体感皮层（S1后肢区）神经活动的多日数据（图2）。

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得加利福尼亚州美国国家航空航天局艾姆斯研究中心 LifeSource 生物医学服务公司机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 术前准备

  1. 使用热珠灭菌器对将用于手术操作的器械进行灭菌，并用70%乙醇擦拭手术区域。打开置于立体定位仪上的加热垫，并将其温度维持在37 °C。
  2. 使用异氟烷对动物进行麻醉（诱导浓度为5%，维持浓度为1-2%，氧气流速为0.6-0.8 L/min O2）。通过检查趾夹反射是否消失来评估麻醉深度。
  3. 将动物固定在配备耳杆和门齿固定的立体定位仪中。
  4. 在动物眼睛上涂抹眼用软膏，并用一张深色纸覆盖，以防止眼睛干燥和强手术灯光的刺激。
  5. 皮下注射酮洛芬（2.5 mg/kg）或 卡洛芬（2.5 mg/kg）

2. 病毒注射手术

  1. 在双眼与双耳之间的头皮区域进行修剪和剃毛，并使用70%乙醇和碘伏交替擦拭三次，对皮肤进行消毒。
  2. 使用无菌手术刀从两眼之间开始，沿前后方向切开约1.5 cm，切开头皮以暴露颅骨。打开皮肤后暴露颅骨，用棉签和手术刀清除目标注射部位周围的骨膜。用无菌PBS冲洗颅骨，并用棉签清洁并抛光颅骨表面。
  3. 将颅骨调平，用记号笔标记病毒注射的立体定位坐标。使用高速微型钻（转速设定在约7,000–10,000 rpm）配备0.5 mm钻头，在颅骨上钻出一个小孔。钻孔时施加轻微压力，并间歇性地用无菌PBS清除骨屑并润湿钻孔区域，以防止脑组织过热，直至暴露脑表面。钻孔过程中保持脑组织湿润。
  4. 使用26 G针头吸取病毒（e.g. AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40）至微量注射器中，随后更换为35 G针头用于注射。将装有病毒的微量注射器固定在立体定位仪的操纵臂上。
  5. 将注射器移至注射孔位置附近，调整针头角度，使其以90°垂直于脑表面进入。缓慢降低针头直至接触软脑膜，并刺穿硬脑膜。以10 µm/s的步进方式继续降低针头，直至达到目标深度（z），然后利用立体定位臂固定针头位置。
  6. 设置微量注射泵以25 nL/min的速度注射250 nL病毒。
    1. 关键步骤：由于病毒注射体积取决于滴度和稀释倍数，应在实验前进行稀释实验，以确定成像实验中细胞标记的最佳体积和浓度参数。
  7. 若观察到病毒从注射部位溢出，应暂停注射，等待脑组织吸收病毒液滴。在完成全部注射体积后，等待5–7分钟再撤出针头。可在病毒溶液中加入快绿等染料，以便在病毒从脑表面溢出时控制注射速度。
  8. 如需标记皮层多个层次，可根据需要进行多次注射。首先从最腹侧的位点开始注射，注射后等待5–7分钟，再将针头上提至下一个更背侧的注射点（e.g. 在AP -1.0 mm，ML ±1.5 mm，DV 400 和 600 µm处注射）。最后一次注射完成后等待10分钟，再撤出针头并从立体定位装置中移除。
  9. 从双筒注射器中挤出少量in vivo生物相容性透明弹性胶粘剂（e.g. Kwik-Sil），混合均匀后覆盖颅骨上的钻孔。在弹性胶层上方涂抹氰基丙烯酸酯粘合剂，并使其固化。
  10. 缝合头皮，将动物置于温暖的恢复笼中，直至其恢复自主活动能力。在动物返回饲养笼前，皮下注射酮洛芬（2.5 mg/kg）或 卡洛芬（2.5 mg/kg）。术后动物应单笼饲养以保护手术部位 ，并在24小时 后重复给药一次。
  11. 移除微量注射器后，用蒸馏水反复冲洗26 G和35 G针头7–10次，清洁后储存。

3. 棱镜探针植入手术

  1. 病毒注射后1-2周，准备进行棱镜探针植入手术。将棱镜探针在70%乙醇中消毒，并用镜头纸擦拭清洁。将棱镜探针插入透镜固定工具中，并用螺丝刀拧紧六角螺钉。将显微镜放入基座固定器中（磁铁会将其固定到位）。
  2. 按照术前准备部分所述步骤准备动物。
  3. 在动物两耳之间及眼睛上方修剪并剃除头部毛发，然后用70%乙醇和碘伏交替擦拭消毒皮肤。
  4. 用无菌剪刀切开皮肤暴露颅骨，移除皮瓣及下方的骨膜。使用棉签干燥并抛光颅骨表面。彻底清除周围肌肉组织，以形成清洁、干燥且宽阔的骨性基础，为后续步骤做好准备。
  5. 在对侧半球植入颅骨螺钉，以确保植入物的稳定和固定。如果选择植入头杆以实现清醒状态下的头部固定，这些螺钉在第5节中准备动物进行实验性成像时也可能发挥作用。
  6. 调平颅骨，使用记号笔标记用于插入透镜的前后（AP）和内侧-外侧（ML）坐标。使用微型钻上的0.5 mm磨头进行圆形开颅，确保开颅直径略大于棱镜直径。 即 1.0 mm。钻孔时应轻柔操作，间歇性暂停，用无菌 PBS 冲洗颅骨，并用棉签吸走液体。清除产生的骨粉。
    1. 关键步骤：放置颅窗时，应确保当棱镜插入皮层后，其平面边缘（成像面）朝向病毒注射位点，并位于该位点150–200 µm的半径范围内。
  7. 在颅骨即将被完全磨薄之前停止钻孔。应能透过变薄的颅骨看到血管。用精细的45°镊子轻柔地移除骨瓣。
  8. 用 #5 镊子去除硬脑膜。
    1. 关键步骤：一旦暴露脑组织，务必始终保持组织湿润。将浸有无菌生理盐水的棉签置于颅骨开孔处，这不仅能保持组织湿润，还可对组织施加一定压力。
  9. 为减轻棱镜探针插入过程中脑组织所受压力，需预先制作插入通道。将直刃解剖刀固定于立体定位仪电极夹持臂上，并安装至立体定位仪，调整角度使刀刃与颅骨曲率垂直（本实验中为10°角），且位于与病毒注射柱平行的平面内。
  10. 小心地将刀片置于颅骨开孔的前内侧边缘上方，此处位于病毒注射位点外侧约 200 µm 处，刀刃朝向后方（图1将刀尖接触软脑膜时将Z轴归零，并以10 µm/s的步长逐渐降低至预定深度，以便插入棱镜探头。随后将刀具向后移动1 mm，为棱镜的前缘创建通路。切开过程中如发生出血，使用预先灭菌的生理盐水浸湿的明胶海绵进行止血并暂停操作。
  11. 当刀具到达此位置后，用无菌生理盐水冲洗手术部位，并等待出血停止。然后通过立体定位仪臂式显微操作器以10 µm/s的步长缓慢回撤刀具，并在切口处放置一块浸有无菌生理盐水的明胶海绵。
  12. 将镜头支架（含棱镜探头和显微镜）固定在立体定位操纵臂上，使其角度与前一步中刀片的角度相同。调整棱镜位置，使棱镜的平面一侧位于切口上方，并与病毒注射列平行。此步骤可能需要对立体定位臂的位置进行细微校正。调整对准时应尽量靠近颅骨，以加快操作速度。
  13. 当棱镜达到正确角度后，从脑表面开始，以10 µm为步长逐步将其向下插入脑组织，直至该探针的最终z值为1.1 mm。脑组织将在棱镜周围扩张，所产生的任何压力均位于成像平面后方，不会影响视野。通过USB3端口将显微镜连接至安装有采集软件的计算机，打开LED光源以观察视野中的荧光信号。
  14. 使用25G针头，将弹性体粘合剂以极薄的保护层覆盖颅骨开窗处棱镜周围暴露的组织。
  15. 在弹性体粘合剂固化后（通常约需3-5分钟），使用25G针头将少量氰基丙烯酸酯粘合剂涂抹于棱镜透镜的玻璃表面，使其与弹性体粘合剂层上方的邻近颅骨粘结，以防止棱镜在颅骨开窗内移动。粘合时应包括棱镜探针套管的边缘，以增强粘附效果。注意勿将任何粘合剂沾染到植入的棱镜探针的顶面。待氰基丙烯酸酯粘合剂完全固化后，拧松透镜固定装置并小心移除显微镜。随后缓慢回撤立体定位操纵臂，使棱镜探针稳固地保留在植入位置。
  16. 在植入物周围涂抹一层牙科丙烯酸树脂或氰基丙烯酸酯粘合剂，覆盖所有暴露的颅骨表面，但不得接触周围回缩的肌肉组织。通过该颅骨帽覆盖较大面积的颅骨，可为后续基板的固定提供便利。植入部位周围的皮肤应自行愈合，并包裹颅骨帽。
    1. 关键步骤：切勿让粘合剂接触周围的皮肤或肌肉组织，也切勿将皮肤包裹进颅骨帽中。否则会刺激皮肤，导致过度抓挠，并可能造成植入物损伤。
  17. 可选：如果希望在实验成像过程中使用清醒固定头部装置，将显微镜连接和脱离动物基板，而非短暂麻醉或抓握动物，可在颅骨帽中植入与所选清醒固定头部装置兼容的头杆（本方案未展示此步骤）。
  18. 将硅酮粘合剂注射器中的催化剂和固化剂混合，取一滴弹性体置于棱镜探头套筒内，覆盖探头透镜顶端，以防止损坏及灰尘沉积。
  19. 将动物从立体定位仪中取出，置于温暖的环境中使其从麻醉状态恢复。给予酮洛芬（2.5 mg/kg）或 皮下注射卡洛芬（2.5 mg/kg），待动物恢复自主活动后，将其转移至清洁的饲养笼中。所有实验动物均需单笼饲养，以保护植入物。 并在24小时后重复给药 稍后。

4. 用于微型显微镜安装的基板连接

  1. 在植入棱镜探头后一周至10天内，通过已植入的棱镜探头检查组织中的病毒表达情况；若制备样本显示出细胞活性，则在颅骨上安装基板。活体成像期间，显微镜将与该基板对接。
  2. 按照术前操作步骤准备动物以进行基板安装。
  3. 移除覆盖在已植入棱镜探头镜头顶部的硅胶密封帽。检查镜头表面，并使用镜头纸和70%乙醇轻轻清除任何碎屑，确保成像表面清洁。
  4. 将显微镜连接至其DAQ盒，并通过USB3端口连接到计算机。
  5. 在计算机上打开采集软件，并通过USB3端口连接显微镜。使用采集软件检查神经活动，并测量和记录该动物后续实验所需的视野参数。
  6. 将基板安装到显微镜上，并拧紧基板固定螺钉以固定基板位置；通过显微镜本体将其牢固地固定在立体定位微操臂的显微镜夹持器中。将夹持器连接至Newport杆，该杆可安装在立体定位微操臂上。
  7. 使用立体定位微操臂将显微镜定位在棱镜探头镜头上方。从动物平台的侧面和背面观察棱镜镜头，目视检查其方向。显微镜物镜与棱镜探头镜头的光轴必须对齐。
  8. 通过软件打开显微镜LED光源。在采集软件中聚焦于已植入棱镜探头镜头的顶面，以评估显微镜对准质量。当正确对准时，棱镜探头顶面边缘应清晰锐利。
  9. 使用立体定位操纵臂调节显微镜与已植入棱镜探头之间的物理距离，以获得组织内所需的焦平面。显微镜物镜与已植入GRIN透镜之间的光学优化距离约为500 µm。
  10. 在捕获所需成像平面后，保存一幅参考荧光图像。
    关键点：自此之后，切勿调整显微镜位置，否则会改变组织中成像平面的位置。
    注意：在下一步中使用粘合剂将基板永久固定于覆盖动物颅骨的丙烯酸帽上，粘合剂需跨越两者之间的间隙。逐步施加牙科丙烯酸树脂或氰基丙烯酸酯并分阶段固化，可最大程度减少前述粘合剂收缩对显微镜最终成像平面位置的影响。建议预先评估所用粘合剂混合物及其距离在体外（ex vivo）的收缩量，并在进入粘合步骤前，将显微镜+基板的最终Z轴位置回退相应距离，以补偿可能的收缩。
  11. 使用牙科丙烯酸树脂或氰基丙烯酸酯将基板永久固定在覆盖动物颅骨的丙烯酸帽上，用丙烯酸或粘合剂填补间隙。逐步施加牙科丙烯酸树脂/氰基丙烯酸酯并分阶段固化，可最小化前述收缩对显微镜最终成像平面位置的影响。
    1. 关键步骤：施加牙科丙烯酸树脂/氰基丙烯酸酯时需小心，避免任何材料接触显微镜物镜、固定螺钉或显微镜本体，否则可能影响仪器后续正常操作。
    2. 关键步骤：施加粘合剂时切勿对显微镜施加压力。对显微镜或基板施压可能导致显微镜物镜相对于棱镜探头镜头发生位移，造成光路失准或组织内焦平面改变，从而需要立即重新调整。
  12. 用镊子或注射器针头轻敲丙烯酸材料，确认牙科丙烯酸树脂/氰基丙烯酸酯已完全固化并硬化。使用采集软件获取最终的参考荧光图像。
  13. 松开夹持器，将显微镜从夹持器中释放并撤回。若使用了氰基丙烯酸酯或其他透明粘合剂，应在其表面涂覆黑色指甲油或一层黑色牙科水泥，防止环境光渗入颅顶帽，避免污染后续实验中获取的图像。
  14. 此时可根据需要取下显微镜。若需将显微镜与基板分离，可将基板固定螺钉逆时针旋转约½圈以松开。一手捏住显微镜本体，另一手支撑基板和丙烯酸帽，垂直向上拔出显微镜。随后将其放回储存容器中。
  15. 使用基板盖保护已植入的棱镜探头。这可以防止灰尘颗粒沉积在镜头表面，因为在基板安装完成后清理将变得困难。
  16. 将基板盖安装到基板上，并顺时针旋转固定螺钉约½圈，或直至螺钉与基板盖表面齐平。切勿过度拧紧。
  17. 将动物从麻醉状态中移出，并置于温暖的恢复舱内监测直至恢复自主活动能力，然后将其送回原饲养笼。所有植入基板的动物均应单独饲养，以保护植入物。

5. 在自由活动小鼠中对多个皮层进行成像

  1. 使用漂白剂溶液（10%）清洁并消毒行为学实验装置（例如 Phenotyper，Noldus），并将其擦拭干净。
  2. 将显微镜连接至其数据采集（DAQ）盒，并连接到计算机，启动数据采集软件。
  3. 检查数据采集计算机上的可用存储空间，为钙成像视频预留足够空间。为适应显微镜与计算机之间高速的数据传输并防止记录过程中数据丢失，应直接将数据保存至本地硬盘，而非外部硬盘。
  4. 在诱导室中使用异氟烷（5%溶于氧气）麻醉动物，以便安装显微镜。或者，若已知麻醉会干扰所选行为范式，可轻柔地抓握动物颈部皮肤，或使用带有头杆的清醒固定装置。
  5. 逆时针旋转基板固定螺钉，取下基板盖。
  6. 将显微镜安装到动物的基板上。借助基板上的磁铁，显微镜应能卡入到位。旋紧基板固定螺钉，直至感到轻微阻力。
    1. 关键步骤：切勿过度拧紧基板固定螺钉，以免损坏显微镜外壳。
  7. 通过软件采集荧光快照，检查组织中的成像平面；如有必要，松开显微镜转塔固定螺钉，旋转转塔以调节精细焦距，然后重新拧紧转塔外壳固定螺钉，调整组织中的焦平面。
    1. 关键步骤：在未先松开固定螺钉的情况下，切勿强行转动转塔；同时切勿过度拧紧转塔固定螺钉。
  8. 若进行纵向研究，应返回转塔的物理位置以捕获相同的视野。在硬件上记录每次成像时转塔的旋转圈数或物理位置，以便使用同一显微镜对每只动物快速恢复至相同视野。
  9. 将携带显微镜的动物放回其饲养笼或行为学实验舱中进行适应，并等待麻醉效果消退（如适用）。
    1. 关键步骤：在开始实验前，使用假显微镜对动物进行多次训练，确保其适应显微镜的重量，且佩戴显微镜不会干扰其正常行为。定期进行清醒固定操作和训练可避免动物产生过度应激。
  10. 选择用于数据采集的设置，包括采集数据的帧率（例如 20 fps，增益为1，LED功率为50%）。在选择设置时检查图像直方图，以确保良好的信噪比。
    注：1 mm棱镜探头的荧光收集数值孔径为0.35，而1 mm直探头为0.5。
  11. 启动行为学软件，并设置其在所需的成像记录周期（例如 每4次循环中开启5分钟、关闭2分钟）触发显微镜。使用RJ45转BNC线缆，将Noldus IO盒上的TTL端口连接至DAQ盒上的TRIG端口。
  12. 若动物尚未处于行为学实验区域，将其放入该区域，并开始实验。
  13. 在获取所需数据后，使用异氟烷（5%溶于氧气）在诱导室中重新麻醉动物，或轻柔地对清醒动物进行固定。
  14. 松开基板固定螺钉，轻轻向上拉出显微镜，将其从基板上取下。重新装上基板盖，并轻轻拧紧基板固定螺钉。
  15. 将动物放回饲养笼，直至下一次记录会话。在后续成像会话中，使用参考荧光图像作为指导，以返回相同的视野。

6. 评估大规模 Ca2+ 成像数据

  1. 为从数据中提取视野内的细胞位置和Ca2+动态信息，可使用不同的数据分析平台。本研究中采用了专为处理大规模Ca2+成像视频而设计的数据分析平台Mosaic。
  2. 在预处理步骤中，校正原始视频中的坏点，并对任何个别丢失的帧进行插值。将图像在空间上进行二倍下采样，将完整的1,440 × 1,080像素视野缩减为720 × 540像素，以减少数据量。
  3. 为校正脑组织相对于显微镜图像传感器产生的运动伪影，使用基于ImageJ的严格图像配准算法（TurboReg）对视频进行配准。
  4. 为识别单个神经元，将图像重新表示为荧光相对变化ΔF/F0 = (F - F0)/F0，其中F0是通过对整个视频取平均获得的均值图像。
  5. 使用已建立的细胞分类算法识别对应于单个细胞的空间滤波器。本研究中采用主成分与独立成分分析21来识别单个神经元。
    注意：在本数据集中，当某条轨迹中事件的峰值幅度超过其基线8个标准差时，即定义为一次事件，并导出该细胞的位置及Ca2+动态数据用于进一步分析。

结果

本方案介绍了一种有效且高效的方法，利用棱镜探针（图1）在自由活动的小鼠中对数百个皮层神经元进行纵向多层 Ca2+ 成像。以往的多层皮层成像方法主要局限于固定头部的动物22,23,24,25,26,27。为了在自由活动的条件下获取此类数据，采用了微型化显微镜平台以实现行为灵活性；使用一种遗传编码的钙指示剂（GCaMP6f）靶向特定的细胞群体（皮层中的 CAMKII+ 细胞）；并选用棱镜探针以提供长期、多层的视野。

我们演示了用于准备动物进行成像的工作流程。首先将编码适当钙指示剂的病毒载体注射到皮层（图2，步骤1），随后长期植入棱镜探针，以实现对标记细胞的光学访问（图2，步骤2）。然后在动物头部安装作为稳固临时支架的基板，用于在成像过程中固定显微镜的位置（图2，步骤3），从而能够在清醒、行为自由的实验条件下，对多个皮层层级的细胞活动进行可视化观测（图2，步骤4）。

为确保靶向目标细胞群，图3展示了代表性小鼠的死后冠状脑切片，其中棱镜探针的穿行路径及视野范围相对于体感皮层第2/3层和第5层中标记了GCaMP6f的神经元进行了标注。

使用该系统进行清醒行为成像期间，记录了小鼠在三种不同环境下的体感皮层神经元活动：开放场（第1天）、物体熟悉（第2–4天）和新物体（第5天）（图4）。第1天，将小鼠放置于无任何物体的行为实验 arena 中；第2–4天，将小鼠放置于 arena 中，其中放置两个质地不同的相同物体（一个凝胶垫和一个木块）；第5天，更换其中一个物体为一个新物体。连续5天，每天成像20分钟。

利用 Ca2+ 成像数据分析软件提取细胞后，将对应于细胞位置的空间滤波器叠加到显微镜记录数据的平均荧光强度投影图上（图 5）。白色虚线分隔了第 2/3 层与第 5 层的细胞。来自每层各 5 个细胞的相应 Ca2+ 信号轨迹显示了细胞在两种不同行为情境下的放电模式——物体熟悉期与新物体接触期。在小鼠接触新物体的当天，第 2/3 层细胞的活动较第 5 层细胞更为活跃。这一点也从光栅图中得以体现，该图展示了第 1、4 和 5 天所有成像细胞经阈值化处理后的放电活动。

用于GCaMP成像的微型显微镜棱镜探头装置；示意图与视野荧光结果
图1： 体内 Ca2+ 在自由活动小鼠中对多个皮层进行成像 (A) 棱镜探头规格及成像平面示意图。斜边内侧的反射涂层可实现成像 90° 从棱镜探头的插入平面出发。透镜套管与透镜支架集成在一起，简化了植入过程，并可在植入期间实现对周围组织荧光的潜在观察。B) (i) 示意图显示棱镜探针开颅位置和刀片切口相对于病毒注射位点的位置关系，以及 (ii) 示意图显示棱镜探针扁平面相对于刀片切口和病毒注射位点的位置。C示意图 体内 Ca2+ 成像装置示意图，显示通过植入小鼠皮层的棱镜探头，在整个视场内对一个小区域的光路。D棱镜探头安装过程中的视野示例。微型显微镜连接至透镜支架，该支架固定棱镜探头，可在安装过程中检测病毒表达情况。E) 显微镜与棱镜探头集成，用于成像标记了 GCaMP6f 的 S1 区多层皮层细胞。F 安装基板时的示例视野。安装基板时，原始图像中可见清晰的血管模式及部分细胞。当在采集软件窗口中开启 ΔF/F 时，可更清晰地观察到更多细胞。 请点击此处以查看此图的放大版本。

小鼠脑成像时间线；病毒注射、棱镜探针、基板、显微镜步骤。
图2：棱镜探针植入与显微镜安装工作流程事件的时间线示意图。 横轴表示周数，纵轴表示操作流程的各个步骤。(A) 图示沿相同的背腹轴进行病毒注射（AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40），以标记小鼠体感皮层的多个层次。(B) 病毒注射后两周，沿与病毒注射位点平行的轴向植入棱镜探针。(C) 棱镜探针植入约一周后，使用显微镜检测动物的表达情况；若观察到细胞群，则在头部安装基板。(D) 此后动物即可用于相关行为任务期间的长期成像（小鼠剪贴画经 UW-Madison Biochemistry MediaLab 授权修改后使用）。请点击此处查看此图的放大版本。

使用棱镜探针进行脑组织成像；荧光显微镜；白色和软脑膜；焦平面。
图3：棱镜探针位置及GCaMP表达的死后组织学验证。（A）代表性小鼠脑的冠状切面，显示棱镜探针的穿行路径，其成像侧面对表达GCaMP6f的细胞（AAV1.CaMKII.GCaMP6f在第2/3层和第5层神经元中表达）。（B）同一脑冠状切面经DAPI染色后的图像。比例尺 = 250 µm。（C）体感皮层中表达GCaMP6f细胞的放大视图。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

热图显示小鼠在开放场地、物体熟悉和新物体暴露中的活动情况。
图4：通过视频追踪软件记录小鼠在适应期、熟悉期和新物体暴露测试期间的活动情况。（A）第1天，将动物放入一个无任何物体的行为实验箱中（开放场地）。（B）第2–4天，在实验箱中放置两个质地不同的相同物体（凝胶垫和木块）（物体熟悉）。（C）第5天，其中一个物体被替换为一个新物体（带砂纸的木块）（新物体暴露）。请点击此处查看该图的放大版本。

神经活动分析，电生理学数据；图形和散点图可视化；151个细胞，层深度。
图5：通过显微镜成像的一只代表性小鼠体感皮层浅层与深层的钙动力学。（A）神经元空间滤波器（绿色斑点）与显微镜记录中通过棱镜探头视场的平均荧光强度投影图像的合并图。颗粒上层与颗粒下层之间的边界以白色虚线表示。比例尺 = 100 µm。（B）来自五个典型浅层与深层细胞（A图中实心蓝色和红色细胞）的钙信号轨迹，显示在主成分分析和独立成分分析后荧光的标准差单位。水平比例尺为50 s，垂直比例尺为10 S.D。（C）来自浅层（2/3层）和深层（5层）细胞的点阵图，展示在开放场、物体熟悉和新物体探索阶段的活动。比例尺 = 100 s。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在清醒行为期间理解神经环路活动是神经科学研究中的一个关键层面，对于有效解析健康与疾病状态下的脑功能至关重要。皮层是在清醒行为背景下尤为重要的研究区域，因为它在许多重要的感觉、认知和执行功能中发挥着关键作用28,29。

皮层柱被认为是皮层的基本功能单位，而皮层细胞在柱内不同物理位置的群体活动已知存在差异。例如，体感皮层第2/3层的兴奋性神经元主要投射至其他新皮层区域，并调节其他皮层网络30，而深层的细胞则主要投射至丘脑等皮层下区域31。若能在自由活动的受试体中，长期稳定地同时记录数百个预先指定的皮层细胞在不同皮层层次中的活动，将极大促进我们对皮层信息传递的理解，从而结合实时行为信息和与任务相关的时间尺度，对皮层柱进行更精细的功能解析。

利用高效且简化的微型显微成像平台进行大规模钙成像，使得获取此类神经环路数据成为可能2+ 在自由活动（或根据需要采用头部固定）的受试对象中进行成像。结合基因编码的钙指示剂以实现细胞类型特异性标记，并利用长期植入的棱镜探针获取多层视野的成像数据，本方案探讨了众多可能应用中的一种情况：观察小鼠在与新物体发生物理接触时体感皮层处理过程中的分层差异图5）。这是首次针对此类细胞类型特异性的操作示意图， 体内 研究清醒自由活动动物多个皮层的实验方法，拓展了可用于理解活跃大脑中层状结构的实验技术范围。

当需要保留目标区域正上方组织时，该技术中棱镜探头提供的侧向视野可合理应用于其他脑结构；例如，可在不干扰海马功能的情况下实现对CA3的成像。

基于棱镜探针的Ca2+活性成像技术需要将微型棱镜物理插入并永久植入皮层，这相当于在探针镜头插入部位形成一处皮层损伤。该操作可能导致局部神经环路的破坏，包括顶端树突及其突起的切断。此外，该手术还会引起植入区域胶质细胞的初期激活，但预计这种激活仅局限于棱镜表面周围约150 µm范围内的组织，并在脑组织愈合后逐渐消退22。在实验设计阶段，必须充分考虑该技术是否会影响动物正常的神经环路结构和（或）行为表现。应始终设置行为学对照组，以确保基础行为未发生显著改变，从而避免对实验结果造成干扰。

利用这种微型化、可移动的钙离子（Ca2+）成像技术，结合神经药理学干预手段，以及多种认知、社会、运动或内在行为范式，并与其他生理学指标相结合，可进一步深化和丰富针对神经环路在行为和信号处理中功能作用的研究32。通过药物调控特定通路的抑制或激活，可影响相关行为，而该技术可便捷地用于此类研究33。通过改造钙指示剂的靶向性，将其应用于不同类型的细胞，是另一项强大而实用的应用，能够实现多种实验工具的创造性组合，以解决多样化的神经环路科学问题。

披露

作者已阅读该期刊的政策，存在以下利益冲突：SG、SO 和 VC 是 Inscopix 公司的带薪员工。

致谢

作者谨向霍华德·休斯医学研究所珍利亚研究园区的基因编码神经元指示剂与效应器（GENIE）项目中的 V. Jayaraman、D.S. Kim、L.L. Looger 和 K. Svoboda 致谢，感谢他们慷慨地将 AAV1-GCaMP6f 病毒赠予宾夕法尼亚大学病毒载体核心实验室。作者同时感谢由美国国立卫生研究院资助（资助号 NS069375）的斯坦福大学 A. Olson 及神经科学显微技术核心实验室提供的共聚焦显微镜技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Neurostar 电动
超精密小型动物立体定位仪		Kopf型号 963SD手术
体视显微镜LabomedPrima DNT手术与成像
微型直肠热敏电阻探头（直径 0.062"/1.6 mm）- 1/4" 插头FHC40-90-5D-02手术
加热垫 5 × 12.5 cm FHC40-90-2-07手术
直流温度控制器FHC40-90-8D手术
微量注射泵World Precision InstrumentsUMP3 型号；序列号 155788 F110手术
NanoFil 10 μL 注射器World Precision InstrumentsNANOFIL手术
35G 斜面尖端 Nanofil 针头 2 支装World Precision InstrumentsNF35BV-2手术
Omnidrill35，115 - 230 VWorld Precision Instruments503598手术
微型钻头用磨头Fine Science Tools19007-05手术
nVistaInscopix100-001048成像
AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40Penn Vector CoreAV-1-PV3435手术
酮洛芬Victor Medical5487手术
卡洛芬Victor Medical1699008 手术
异氟烷Victor Medical1001054手术
明胶海绵（Patterson Veterinary Supply Inc 明胶海绵 12 cm × 7 mm）辉瑞（Fisher Scientific）NC9841478手术
Dumont #5/45 镊子Fine Science Tools11251-35手术
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11251-30手术
解剖刀Fine Science Tools10055-12手术
ProView 植入套件Inscopix100-000756手术与成像
ProView 棱镜探头 直径 1.0 mm，长度约 4.3 mmInscopix100-000592手术与成像
Kwik-Sil 粘合剂（2 包装）World Precision InstrumentsKWIK-SIL手术
Kwik-Cast 封闭剂World Precision InstrumentsKWIK-CAST手术与成像
微型光学安装柱NewportM-TSP-3成像
显微镜底板InscopixBPL-2成像
显微镜底板盖InscopixBPC-2成像

参考文献

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