新型高密度脂蛋白模拟纳米颗粒的制备及表征用于包载神经生长因子

摘要

采用简单的均质化方法制备新型高密度、模拟高密度脂蛋白的纳米颗粒，用于包载神经生长因子。本文详细阐述了纳米颗粒制备过程中的挑战及具体实验方案， 体外 表征，以及 体内 本文描述了相关研究。

摘要

本文旨在介绍载神经生长因子（NGF）的高密度脂蛋白（HDL）模拟纳米颗粒（NPs）的制备与表征方法。HDL 是内源性纳米颗粒，已被探索作为治疗剂的递送载体。目前已有多种方法用于制备 HDL 模拟纳米颗粒，但这些方法通常较为复杂、耗时，且难以实现工业化放大。本研究采用一步均质化法混合辅料并形成原型纳米颗粒。NGF 是一种分子量为 26 kDa 的水溶性蛋白。为促进 NGF 在 HDL 模拟纳米颗粒脂质环境中的包载，使用硫酸鱼精蛋白（protamine USP）与 NGF 形成离子对复合物，以中和 NGF 表面电荷。随后将 NGF/鱼精蛋白复合物引入原型纳米颗粒中，最后在纳米颗粒表面包被载脂蛋白 A-I。NGF HDL 模拟纳米颗粒在粒径、粒径分布、包封率等方面表现出较优的性能， 体外 释放、生物活性和生物分布。通过对高密度脂蛋白模拟纳米颗粒（HDL-mimicking NPs）中均质化过程的精心设计与探索，该制备工艺得以显著简化，并实现了纳米颗粒的可扩展生产。此外，诸多挑战也得以解决，例如未载入的神经生长因子（NGF）与纳米颗粒的分离，以及可靠地 体外 释放研究以及纳米颗粒生物活性的测定等难题得以解决。

引言

大分子物质，如蛋白质、多肽和核酸，近年来已逐渐成为极具前景的药物，并在过去几十年中受到广泛关注^1,2由于其高效性及特异性作用机制，它们在癌症、免疫系统疾病、艾滋病及相关疾病的治疗中展现出巨大的治疗潜力^3,4然而，其较大的分子尺寸、三维结构、表面电荷和亲水性等理化性质使得 体内 这些大分子的递送极具挑战性，这在很大程度上阻碍了其临床应用⁴近年来，药物递送系统取得了显著进展，如微粒、聚合物纳米颗粒（NPs）、脂质体和脂质纳米颗粒（NPs），这些技术克服了上述挑战并显著改善了 体内 大分子递送。然而，这些递送载体存在一些已知的缺陷，包括载药量低、包封效率低、半衰期短、生物活性丧失以及不良副作用^5,6,7,8有效的载体系统仍是研究热点。此外，与小分子相比，针对载药纳米颗粒中大分子的分析方法开发更具挑战性。

高密度脂蛋....

方案

注意：所有操作中包含的动物实验均已获得北德克萨斯大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会的批准。

1. NGF HDL模拟纳米颗粒的制备

1. 将辅料磷脂酰胆碱（PC）、鞘磷脂（SM）、磷脂酰丝氨酸（PS）、油酸胆固醇酯（CO）和D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）溶解于乙醇中，配制浓度为1 mg/mL的储备液。
   注意：将储备液分装后于-20 °C保存。油酸胆固醇酯需储存在避光瓶中。PC、SM、PS和CO储备液在-20 °C下分别可稳定保存6、3、12和12个月。TPGS溶液在-20 °C下至少可稳定保存12个月。
2. 在1.5 mL微量离心管中，加入10 µL神经生长因子（NGF）（1 mg/mL水溶液）和10 µL硫酸鱼精蛋白USP（1 mg/mL水溶液），室温静置10分钟，形成复合物。
   注意：NGF和鱼精蛋白储备液均应分装后于-20 °C保存。NGF储备液不建议反复冻融。
3. 取59 µL PC、11 µL SM、4 µL PS、15 µL CO和45 µL TPGS加入玻璃小瓶中。混合后，在温和氮气流下蒸发乙醇约5分钟，所有辅料应在玻璃瓶底部形成一层薄而油状的薄膜。
4. 向小瓶中加入1 mL超纯水（一级水），在室温下以9,500 rpm（8,600 × g）均质5分钟，形成原型纳米颗粒（NPs）。
5. 将步骤1.2中制备的复合物加入原型纳米颗粒中，于玻璃小瓶中使用小磁力搅拌子在3....

结果

通过离子对策略制备的模拟高密度脂蛋白、α-生育酚包被的神经生长因子纳米颗粒的工程化方案如图1所示。为中和神经生长因子（NGF）的表面电荷，采用美国药典级鱼精蛋白作为离子对试剂，与NGF形成复合物。为保护其生物活性，首先通过均质法制备了模拟高密度脂蛋白的原型纳米颗粒，随后将NGF/鱼精蛋白复合物包封入原型纳米颗粒中。均质过程提供了足够的能量，有效促进了辅料的混合。均质3分钟后，获得粒径均一的原型纳米颗粒（约170 nm）（图2）。在不同条件下将载脂蛋白A-I（Apo A-I）与原型纳米颗粒共同孵育，包括室温搅拌2小时；室温搅拌4小时；室温搅拌4小时后，4 °C过夜孵育；以及室温过夜搅拌。当在室温下过夜搅拌时，超过26%的Apo A-I被整合入纳米颗粒中。为加入NGF-鱼精蛋白复合物，先将该复合物于37 °C与原型纳米颗粒孵育30分钟，随后向混合物中加入Apo A-I，完成Apo A-I在纳米颗粒表面的最终包被。采用本方案制备的最终NGF模拟高密度脂蛋白纳米颗粒粒径为171.4 ± 6.6 nm（n = 3）.......

讨论

本研究展示了一种制备可包载神经生长因子（NGF）的高密度脂蛋白模拟纳米颗粒（HDL-mimicking NPs）的简便方法。已有多种纳米颗粒（NP）递送系统被研究用于蛋白质的递送。目前，许多纳米颗粒的制备方法涉及透析、溶剂沉淀和薄膜水化等步骤。这些过程通常较为复杂，且在放大生产时面临挑战。在本研究的纳米颗粒开发过程中发现，脂质对容器玻璃壁具有较强的黏附性，导致薄膜水化困难，辅料也无法有效混合。鉴于天然高密度脂蛋白纳米颗粒含有多种组分，混合过程在制备高密度脂蛋白模拟纳米颗粒时变得极为困难且至关重要。实验结果表明，提高温度和延长混合时间均未能促进纳米颗粒的形成。均质器是工业生产中常用的仪器，可提供高能量和强剪切力以实现充分混合。将该仪器应用于纳米颗粒的制备后，仅在3分钟内即成功制得粒径适宜且单一分散的纳米颗粒（图2 和 图3），显著缩短了制备时间，并简化了操作流程。

将大分子应用于治疗给药的主要挑战不仅在于递送，还在于制剂开发。蛋白质通常具有水溶性，且分子体积较大，表面带有电荷，这些特性会阻碍蛋白质被包封到基于脂质的纳.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
重组人β-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-α-磷脂酰胆碱（PC）	Avanti	131601P	95%，鸡蛋，鸡
鞘磷脂（SM）	Avanti	860062P	猪脑
磷脂酰丝氨酸（PS）	Avanti	840032P	猪脑
油酸胆固醇酯（CO）	Sigma	C9253
D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）	BASF	9002-96-4	维生素E聚乙二醇琥珀酸酯
硫酸鱼精蛋白	Sigma	P3369	符合美国药典（USP）检测标准
载脂蛋白 A1，人血浆	雅典研究 &科技	16-16-120101	1 毫克溶于 671 微升 µL 10 mM NH4HCO3，pH 7.4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	交联琼脂糖，  凝胶过滤层析柱填料
用于NGF的夹心ELISA试剂盒	R&D系统	DY008
牛血清白蛋白	Sigma	A2153
RPMI-1640 培养基	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
马血清	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
胎牛血清	Gibco	10082147
PC12细胞	ATCC	CRL-1721
大鼠尾胶原蛋白 I 型	Sigma	C3867
乙酸钠	Sigma	S2889
氯化钠	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
苯甲基磺酰氟（PMSF）	Sigma	P7626
氯化苯扎托铵	Sigma	B8879
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>仪器设备
匀浆器	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC 粒子分析仪	贝克曼库尔特	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 透析装置	Spectrum Laboratories	G235036	分子截留量 300 kDa
离心	Eppendorf	5424R
Polytron 匀浆器	运动学	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200