采用简单的均质化方法制备新型高密度、模拟高密度脂蛋白的纳米颗粒，用于包载神经生长因子。本文详细阐述了纳米颗粒制备过程中的挑战及具体实验方案， 体外 表征，以及 体内 本文描述了相关研究。
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摘要
摘要
本文旨在介绍载神经生长因子（NGF）的高密度脂蛋白（HDL）模拟纳米颗粒（NPs）的制备与表征方法。HDL 是内源性纳米颗粒，已被探索作为治疗剂的递送载体。目前已有多种方法用于制备 HDL 模拟纳米颗粒，但这些方法通常较为复杂、耗时，且难以实现工业化放大。本研究采用一步均质化法混合辅料并形成原型纳米颗粒。NGF 是一种分子量为 26 kDa 的水溶性蛋白。为促进 NGF 在 HDL 模拟纳米颗粒脂质环境中的包载，使用硫酸鱼精蛋白（protamine USP）与 NGF 形成离子对复合物，以中和 NGF 表面电荷。随后将 NGF/鱼精蛋白复合物引入原型纳米颗粒中，最后在纳米颗粒表面包被载脂蛋白 A-I。NGF HDL 模拟纳米颗粒在粒径、粒径分布、包封率等方面表现出较优的性能， 体外 释放、生物活性和生物分布。通过对高密度脂蛋白模拟纳米颗粒（HDL-mimicking NPs）中均质化过程的精心设计与探索，该制备工艺得以显著简化，并实现了纳米颗粒的可扩展生产。此外，诸多挑战也得以解决，例如未载入的神经生长因子（NGF）与纳米颗粒的分离，以及可靠地 体外 释放研究以及纳米颗粒生物活性的测定等难题得以解决。
引言
大分子物质，如蛋白质、多肽和核酸，近年来已逐渐成为极具前景的药物，并在过去几十年中受到广泛关注1,2由于其高效性及特异性作用机制，它们在癌症、免疫系统疾病、艾滋病及相关疾病的治疗中展现出巨大的治疗潜力3,4然而，其较大的分子尺寸、三维结构、表面电荷和亲水性等理化性质使得 体内 这些大分子的递送极具挑战性，这在很大程度上阻碍了其临床应用4近年来，药物递送系统取得了显著进展，如微粒、聚合物纳米颗粒（NPs）、脂质体和脂质纳米颗粒（NPs），这些技术克服了上述挑战并显著改善了 体内 大分子递送。然而，这些递送载体存在一些已知的缺陷，包括载药量低、包封效率低、半衰期短、生物活性丧失以及不良副作用5,6,7,8有效的载体系统仍是研究热点。此外，与小分子相比，针对载药纳米颗粒中大分子的分析方法开发更具挑战性。
高密度脂蛋白（HDL）是一种天然纳米颗粒（NP），由脂质核心构成，其表面包被载脂蛋白和一层磷脂单分子层。内源性HDL通过与靶受体（如SR-BI、ABCAI和ABCG1）相互作用，在脂质、蛋白质和核酸的转运过程中发挥关键作用。HDL已被探索作为递送多种治疗剂的载体9,10,11,12。目前已有多种方法用于制备模拟HDL的纳米颗粒。透析法是一种常用方法，该方法通过胆酸钠溶液水化脂质膜形成纳米颗粒，随后使用三种缓冲液进行为期两天的透析以去除盐分13。超声法通过在加热条件下对脂质混合物进行60分钟超声处理来制备纳米颗粒，之后再通过凝胶色谱法进行纯化14。微流控技术则利用微流控装置，通过在聚焦模式下产生微涡流，混合磷脂和载脂蛋白A-I（Apo A-I）溶液，从而生成纳米颗粒15。显然，这些方法可能耗时较长、条件剧烈，且难以实现工业化放大。
本文介绍了用于封装神经生长因子（NGF）的新型高密度脂蛋白模拟纳米颗粒（HDL-mimicking NPs）的制备与表征。NGF 是一种通过二硫键连接的多肽同源二聚体，包含两个 13.6-kDa 的多肽单体。本研究建立了一种通过均质化制备纳米颗粒并随后将 NGF 封装入其中的新型方法。对 NGF 负载的高密度脂蛋白模拟纳米颗粒进行了粒径、粒径分布、zeta 电位及 体外 释放。通过PC12细胞的神经突起生长实验评估其生物活性。在小鼠静脉注射后，比较NGF HDL模拟纳米颗粒与游离NGF的生物分布。
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方案
注意：所有操作中包含的动物实验均已获得北德克萨斯大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会的批准。
1. NGF HDL模拟纳米颗粒的制备
- 将辅料磷脂酰胆碱（PC）、鞘磷脂（SM）、磷脂酰丝氨酸（PS）、油酸胆固醇酯（CO）和D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）溶解于乙醇中，配制浓度为1 mg/mL的储备液。
注意：将储备液分装后于-20 °C保存。油酸胆固醇酯需储存在避光瓶中。PC、SM、PS和CO储备液在-20 °C下分别可稳定保存6、3、12和12个月。TPGS溶液在-20 °C下至少可稳定保存12个月。 - 在1.5 mL微量离心管中，加入10 µL神经生长因子（NGF）（1 mg/mL水溶液）和10 µL硫酸鱼精蛋白USP（1 mg/mL水溶液），室温静置10分钟，形成复合物。
注意：NGF和鱼精蛋白储备液均应分装后于-20 °C保存。NGF储备液不建议反复冻融。 - 取59 µL PC、11 µL SM、4 µL PS、15 µL CO和45 µL TPGS加入玻璃小瓶中。混合后，在温和氮气流下蒸发乙醇约5分钟，所有辅料应在玻璃瓶底部形成一层薄而油状的薄膜。
- 向小瓶中加入1 mL超纯水（一级水），在室温下以9,500 rpm（8,600 × g）均质5分钟，形成原型纳米颗粒（NPs）。
- 将步骤1.2中制备的复合物加入原型纳米颗粒中，于玻璃小瓶中使用小磁力搅拌子在37 °C下搅拌孵育30分钟。
- 继续在室温下搅拌30分钟使纳米颗粒冷却。冷却后，加入106 µL载脂蛋白A-I（Apo A-I）（1.49 mg/mL），室温下持续搅拌过夜，以形成最终的NGF高密度脂蛋白模拟纳米颗粒（HDL-mimicking NPs）。
2. NGF HDL模拟纳米颗粒的表征
- 根据制造商的说明，使用粒径分析仪（见材料表）测量颗粒大小和zeta电位。
- 使用交联琼脂糖凝胶过滤色谱柱分离未包载的NGF与NGF HDL模拟纳米颗粒，并测定NGF的包封率。
- 柱子制备时，将15 mL Sepharose 4B-CL悬浮液转移至50 mL烧杯中。用玻璃棒搅拌珠状悬浮液，并将其部分倒入色谱柱（30 cm长 × 1 cm内径，底部带有玻璃砂芯）。轻轻敲击柱体以去除气泡。让溶剂排出，使凝胶珠自然沉降数分钟。
- 继续加入剩余的悬浮液。用溶剂冲洗柱体内壁以清洁凝胶珠。排净溶剂，直至液面略高于固定相顶部。用20 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS，含137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na2HPO4和2 mM KH2PO4）洗涤并平衡柱子。
- 为确定含有未包载NGF的洗脱组分，将200 µL NGF溶液（10 µg/mL）上样至凝胶过滤柱（25 cm长 × 1 cm内径），并用1×PBS进行洗脱。
- 共收集12个组分（每管1 mL），使用NGF的夹心ELISA试剂盒测定每个组分中NGF的浓度。
- 使用夹心ELISA试剂盒检测第6至第10组分中的NGF，获得未包载NGF在柱上的洗脱图谱。用20 mL PBS清洗柱子。
- 为确定含有NGF HDL模拟纳米颗粒的组分，将200 µL纳米颗粒样品上样至柱中，并用1×PBS洗脱。共收集12个组分（每管1 mL），使用粒径分析仪测定每个组分中颗粒的强度。
注意：强度是粒径分析仪测量的一个参数，反映测试溶液中可能存在的纳米颗粒数量。溶液中纳米颗粒越多，强度越高。通过该方法可确认该色谱柱能够将NGF纳米颗粒与未包载的NGF分离。 - 为测定NGF的包封率，将200 µL NGF HDL模拟纳米颗粒上样至柱中，并用1×PBS洗脱。共收集12个组分（每管1 mL）。
- 使用夹心ELISA试剂盒测定第6至第10组分中未包载NGF的浓度。
- 将第6至第10组分中测得的NGF量相加，作为未包载NGF的总量，并根据以下公式计算NGF的包封率。
%EE = (1 - 未包载NGF / 加入纳米颗粒中的总NGF) × 100% 公式（1）
3. 体外 释放模拟高密度脂蛋白的NGF纳米颗粒
- 平行研究游离NGF（10 µg/mL，溶于水；n = 4）和NGF HDL模拟纳米颗粒（10 µg/mL；n = 4）。
- 按照制造商说明，预处理8根透析管（分子量截留值：300 kDa）。
- 用PBS配制5%牛血清白蛋白（BSA）作为释放介质。取30 mL释放介质加入50 mL离心管中，在摇床中以135 rpm转速加热至37 °C。另取50 mL释放介质置于摇床中备用更换。
- 向透析管中加入400 µL释放介质，迅速加入200 µL待测样品，以确保透析所需体积。
- 封闭透析管后，迅速将其放入释放介质（离心管）中。立即从透析管外吸取100 µL释放介质作为0时间点样品，迅速置于-20 °C保存以备后续分析。向离心管中加入100 µL新鲜释放介质以补充取出的体积。启动计时器。
- 在1、2、4、6、8、24、48和72小时时，分别吸取100 µL释放介质，并用100 µL新鲜介质替换。立即将取出的样品置于-20 °C保存以备后续分析。
- 72小时后，将所有样品从-20 °C取出，在室温下解冻。使用夹心ELISA试剂盒测定各释放样品中的NGF浓度。
4. NGF HDL模拟纳米颗粒的生物活性（神经突生长研究）
- 在补充有10%热灭活马血清、5%胎牛血清、100 µg/mL链霉素和100单位/mL青霉素的RPMI-1640培养基中培养PC12细胞。将细胞维持在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中。
- 当细胞融合度达到约70–80%时，移除培养基，并用1× PBS洗涤细胞（每10 cm2培养表面积约2 mL）。吸除洗涤液。加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（含0.25%胰蛋白酶和1 mM EDTA；每10 cm2培养表面积0.5 mL）进行消化，37 °C孵育至大多数细胞脱落。
- 加入两倍体积的培养基终止消化，180 × g离心5分钟。弃上清，将细胞沉淀重悬于5 mL培养基中。使用22 G、½英寸针头过滤细胞，以打散细胞团块。
- 按1:3比例将细胞传代至新的细胞培养瓶中。过夜培养后，移除未贴壁的PC12细胞。保留已贴壁细胞用于进一步扩增。
- 重复此操作连续传代3次，以筛选具有强贴附特性的PC12亚系。用鼠尾胶原I型（100 µg/mL）预先包被6孔板，每孔800 µL。
- 按照步骤4.2所述方法对筛选后的PC12细胞进行胰酶消化，并通过22 G、½英寸针头过滤以分散细胞团块。使用血细胞计数板计数细胞。在步骤4.5中预先包被的6孔板中，以每孔10,000个细胞的密度接种，过夜培养以使细胞充分贴壁。
- 用培养基（见步骤4.1）将游离NGF（10 µg/mL）和NGF HDL模拟纳米颗粒（10 µg/mL）稀释，配制为0.5、1、5、10、50和100 ng/mL的系列浓度。从每孔中移除2 mL培养基，替换为2 mL相应浓度的游离NGF或NGF HDL模拟纳米颗粒溶液。继续培养4天。
- 第4天时，更换为新鲜培养基（见步骤4.1），其中含有相应处理物，继续处理3天。
- 第7天时，使用倒置光学显微镜观察细胞，并在10倍物镜下随机选取视野对每个孔进行成像。
5. NGF HDL拟态纳米颗粒的生物分布
- 使用成年BALB/c小鼠（雄性，25–30 g）检测NGF NPs的组织分布。将小鼠随机分为三组，每组3只。使用锥形塑料固定装置例如， 使用 decapicone 固定小鼠，用乙醇擦拭尾部以促进血管扩张并增强静脉的可见度。
- 通过尾静脉向每组小鼠（共3组）分别注射100 µL生理盐水、游离NGF或NGF HDL-模拟纳米颗粒，NGF剂量为40 µg/kg。使用连接1 mL注射器的30½ G针头进行注射。
- 注射后30分钟，使用3%异氟烷（以2 L/min的流速与氧气混合吸入）对小鼠进行麻醉。通过尾部和脚趾夹捏反应判断麻醉深度。通过心脏穿刺采集血液。
- 从心脏中抽取约1 mL血液。通过颈椎脱位法处死每只小鼠。
- 将小鼠尸体置于仰卧位。使用手术剪刀打开腹腔，用棉签移开脂肪和肠道以暴露肝脏、脾脏和肾脏。采集这些组织并用1x PBS冲洗，以去除血液。
- 立即在3,400 x g、4 °C条件下离心血液样本5分钟，以获取血浆。将血浆和组织样本于-80 °C保存，直至进行分析。
- 将组织样本从 -80 °C 转移至 4 °C，取 100 mg 组织样本加入 10 倍体积的提取缓冲液（0.05 M 醋酸钠，1.0 M 氯化钠，1% Triton X-100，1% BSA，0.2 mM 苯甲基磺酰氟，0.2 mM 苯扎氯铵），在 4 °C、10,000 rpm 条件下匀浆 5 分钟。
- 处死两只未经处理的小鼠，收集空白血浆和组织，具体步骤如5.3和5.4所述。使用空白血浆或空白组织匀浆配制NGF标准溶液。
- 使用上述方法，采用双抗体夹心ELISA试剂盒测定血浆和组织匀浆中NGF的浓度。
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结果
通过离子对策略制备的模拟高密度脂蛋白、α-生育酚包被的神经生长因子纳米颗粒的工程化方案如图1所示。为中和神经生长因子（NGF）的表面电荷，采用美国药典级鱼精蛋白作为离子对试剂，与NGF形成复合物。为保护其生物活性，首先通过均质法制备了模拟高密度脂蛋白的原型纳米颗粒，随后将NGF/鱼精蛋白复合物包封入原型纳米颗粒中。均质过程提供了足够的能量，有效促进了辅料的混合。均质3分钟后，获得粒径均一的原型纳米颗粒（约170 nm）（图2）。在不同条件下将载脂蛋白A-I（Apo A-I）与原型纳米颗粒共同孵育，包括室温搅拌2小时；室温搅拌4小时；室温搅拌4小时后，4 °C过夜孵育；以及室温过夜搅拌。当在室温下过夜搅拌时，超过26%的Apo A-I被整合入纳米颗粒中。为加入NGF-鱼精蛋白复合物，先将该复合物于37 °C与原型纳米颗粒孵育30分钟，随后向混合物中加入Apo A-I，完成Apo A-I在纳米颗粒表面的最终包被。采用本方案制备的最终NGF模拟高密度脂蛋白纳米颗粒粒径为171.4 ± 6.6 nm（n = 3）...
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讨论
本研究展示了一种制备可包载神经生长因子（NGF）的高密度脂蛋白模拟纳米颗粒（HDL-mimicking NPs）的简便方法。已有多种纳米颗粒（NP）递送系统被研究用于蛋白质的递送。目前，许多纳米颗粒的制备方法涉及透析、溶剂沉淀和薄膜水化等步骤。这些过程通常较为复杂，且在放大生产时面临挑战。在本研究的纳米颗粒开发过程中发现，脂质对容器玻璃壁具有较强的黏附性，导致薄膜水化困难，辅料也无法有效混合。鉴于天然高密度脂蛋白纳米颗粒含有多种组分，混合过程在制备高密度脂蛋白模拟纳米颗粒时变得极为困难且至关重要。实验结果表明，提高温度和延长混合时间均未能促进纳米颗粒的形成。均质器是工业生产中常用的仪器，可提供高能量和强剪切力以实现充分混合。将该仪器应用于纳米颗粒的制备后，仅在3分钟内即成功制得粒径适宜且单一分散的纳米颗粒（图2 和 图3），显著缩短了制备时间，并简化了操作流程。
将大分子应用于治疗给药的主要挑战不仅在于递送，还在于制剂开发。蛋白质通常具有水溶性，且分子体积较大，表面带有电荷，这些特性会阻碍蛋白质被包封到基于脂质的纳...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号 R03 NS087322-01，资助对象为 Dong, X。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 重组人β-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-α-磷脂酰胆碱（PC） | Avanti | 131601P | 95%，鸡蛋，鸡 |
| 鞘磷脂（SM） | Avanti | 860062P | 猪脑 |
| 磷脂酰丝氨酸（PS） | Avanti | 840032P | 猪脑 |
| 油酸胆固醇酯（CO） | Sigma | C9253 | |
| D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS） | BASF | 9002-96-4 | 维生素E聚乙二醇琥珀酸酯 |
| 硫酸鱼精蛋白 | Sigma | P3369 | 符合美国药典（USP）检测标准 |
| 载脂蛋白 A1，人血浆 | 雅典研究 &科技 | 16-16-120101 | 1 毫克溶于 671 微升 µL 10 mM NH4HCO3，pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | 交联琼脂糖， 凝胶过滤层析柱填料 |
| 用于NGF的夹心ELISA试剂盒 | R&D系统 | DY008 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 培养基 | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| 马血清 | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10082147 | |
| PC12细胞 | ATCC | CRL-1721 | |
| 大鼠尾胶原蛋白 I 型 | Sigma | C3867 | |
| 乙酸钠 | Sigma | S2889 | |
| 氯化钠 | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | Sigma | P7626 | |
| 氯化苯扎托铵 | Sigma | B8879 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>仪器设备 | |||
| 匀浆器 | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC 粒子分析仪 | 贝克曼库尔特 | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 透析装置 | Spectrum Laboratories | G235036 | 分子截留量 300 kDa |
| 离心 | Eppendorf | 5424R | |
| Polytron 匀浆器 | 运动学 | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
参考文献
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