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方法文章

脂滴分离用于定量质谱分析

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DOI：

10.3791/55585

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2017年4月17日

 ,  ,  , 
1Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, 2Core Facility Mass Spectrometric Proteomics, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

本文内容

摘要

脂滴是多种病原体复制的重要细胞器，包括丙型肝炎病毒（HCV）。本文描述了一种用于分离脂滴并对其相关蛋白进行定量质谱分析的方法；该方法可用于多种实验条件，如病毒感染、环境应激或药物处理。

摘要

脂滴对多种病原体的复制至关重要，其中最显著的是丙型肝炎病毒（HCV），因其被认为是病毒颗粒形态发生的潜在位点。通过定量脂滴蛋白质组分析，可鉴定在病毒感染等条件下定位于脂滴或从脂滴上移位的蛋白质。本文描述了一种已成功用于表征HCV感染后脂滴蛋白质组变化的实验方案。我们采用细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记技术（SILAC），从而对一个细胞群体的完整蛋白质组进行标记 "重" 氨基酸，通过质谱法对蛋白质进行定量。对于脂滴分离，两种细胞群体（即 HCV 感染的/"光" 氨基酸和未感染对照/"重" 氨基酸）以1:1比例混合，并在低渗缓冲液中进行机械裂解。通过低速离心去除细胞核和细胞碎片后，利用两次连续的超速离心步骤富集脂滴相关蛋白，随后在等渗缓冲液中洗涤三次。通过针对不同亚细胞结构的抗体进行蛋白质印迹（Western blotting）分析，评估脂滴组分的纯度。脂滴相关蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，使用考马斯亮蓝染色。经胰蛋白酶消化后，采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）对肽段进行定量分析。利用该方法，我们鉴定了丙型肝炎病毒（HCV）感染后招募至脂滴的蛋白质，这些蛋白质可能代表促病毒或抗病毒的宿主因子。本方法可广泛应用于多种不同细胞类型及培养条件，例如病原体感染、环境应激或药物处理等情境。

引言

脂滴是高度动态的细胞质（以及细胞核）细胞器，由中性脂质（甘油三酯（TG）和胆固醇酯（CE））核心构成，外层包裹着含有嵌入蛋白的磷脂单分子层。1所有细胞类型均能产生脂滴，但其在大小、脂质组成和表面蛋白修饰方面存在差异。脂滴具有多种功能，包括作为能量和膜前体物质的储存库，或作为蛋白质的沉积场所。此外，通过摄取脂质，脂滴可保护细胞免受脂毒性损伤，释放脂质作为信号分子，并参与蛋白质降解以及内质网（ER）应激反应。2因此，多种蛋白质会结合到脂滴上，调控其生成、降解、转运以及与其他细胞器的相互作用。其中包括脂滴包被蛋白家族（perilipin family） 真正 脂滴结合蛋白（PLIN1-5）3.

脂滴的生成很可能起始于内质网（ER），在内质网中，定位于ER的酶催化中性脂质的合成，这些中性脂质在膜双分子层内积聚，形成中性脂质透镜结构，这一过程最近在酵母中得到了清晰的可视化展示4。随后，膜弯曲以及磷脂酸和二酰甘油水平的升高被认为会招募参与磷脂生物合成的蛋白质，因为核心中性脂质与包被性磷脂的同步合成是脂滴生成所必需的5。这一过程由含有跨膜结构域并定位于内质网的酶催化完成。脂滴进一步扩大为大型脂滴则需要另一类含有两亲性螺旋的脂质合成酶，这类酶能够从内质网转移至脂滴。脂滴中脂质的动员通过局部激活甘油三酯和二酰甘油脂肪酶——脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）和激素敏感性脂肪酶（HSL）——实现，也可通过不同的自噬途径进行，例如大脂噬、微脂噬或分子伴侣介导的自噬6。脂滴与其他细胞器存在相互作用，例如线粒体（用于β-氧化和脂质合成）和内质网（用于脂质合成和蛋白质运输），同时也与溶酶体、内体以及胞内细菌诱导形成的液泡相互作用7。事实上，细菌、病毒甚至寄生虫都会靶向脂滴以实现其复制与持续存在，其中就包括丙型肝炎病毒（HCV）8。

丙型肝炎病毒（HCV）感染是全球肝病相关发病和死亡的主要原因之一，每年约导致50万人死亡9。HCV感染的实际人数尚不明确，但近期估计显示，全球有1.3亿至1.5亿人处于慢性感染状态。目前尚无可用的疫苗，但近年来获批的直接抗病毒药物（direct-acting antivirals）相比传统的干扰素疗法显著提高了治疗应答率。然而，由于这些新药价格极为昂贵，全球范围内患者的治疗可能受到限制。约半数慢性HCV感染者会发展为脂肪肝疾病（脂肪变性），其特征是肝细胞内脂滴过度积聚。引人注目的是，脂滴也被发现是HCV复制所必需的重要细胞器，可能作为病毒组装的场所10,11。

在HCV感染的细胞中，病毒蛋白core和NS5A会定位于脂滴，该过程依赖于甘油三酯的生物合成；二酰甘油酰基转移酶1（DGAT1）抑制剂可阻碍病毒蛋白向脂滴的转运及后续HCV颗粒的产生12,13,14,15此外，核心蛋白或NS5A的脂滴结合结构域中的突变会抑制HCV的组装16,17核心蛋白和NS5A随后将所有其他病毒蛋白以及病毒RNA复制复合物募集到与脂滴密切相关的膜结构上16所有病毒蛋白的协同作用对于成功产生具有感染性的子代病毒至关重要10,11结构蛋白是病毒颗粒的组成部分，而非结构蛋白则促进此过程所需的蛋白质-蛋白质相互作用。有趣的是， 真正有效的 脂滴结合蛋白PLIN3/TIP47对丙型肝炎病毒RNA复制及病毒颗粒释放均是必需的18,19,20尽管近期取得了一些进展，但丙型肝炎病毒复制晚期阶段病毒与宿主相互作用的机制细节仍不明确，脂滴的确切功能亦不清楚。

本文介绍了一种用于相关蛋白定量质谱分析的脂滴分离方法。利用该方法，我们发现丙型肝炎病毒（HCV）感染期间脂滴蛋白质组发生显著变化，并鉴定出膜联蛋白A3是一种与脂滴共分离的宿主蛋白，对HCV的有效成熟至关重要21。

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方案

1. 细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）培养基的制备

注意：此处使用 SILAC 蛋白质定量试剂盒——DMEM 培养基中添加了 50 mg 的 13C6 L-盐酸精氨酸用于 SILAC 标记。透析胎牛血清（FCS）随 SILAC 蛋白质定量试剂盒提供。

  1. 从每瓶 DMEM 培养基中移除 50 mL，并加入 50 mL 透析过的 FCS。
  2. 将 50 mg 13C6 L-赖氨酸-2HCl 和 50 mg 13C6 L-精氨酸-HCl 溶解于 1 mL 培养基中。充分混匀后，将氨基酸加入 DMEM + FCS 培养基中。
  3. 添加 1× 青霉素-链霉素溶液和 1× L-谷氨酰胺替代物。使用 0.45 µm 滤器对培养基进行无菌过滤。将该瓶培养基标记为 "heavy" SILAC 培养基。
  4. 制备 "light" 培养基时，使用 50 mg L-精氨酸-HCl 和 50 mg L-赖氨酸-2HCl 重复步骤 1.1–1.3。将该瓶培养基标记为 "light" SILAC 培养基。

2. SILAC标记与氨基酸掺入控制

  1. 用胰蛋白酶（1× 胰蛋白酶-EDTA）消化细胞，并将 1 × 105 个 Huh7.5 细胞分别接种至 6 孔培养板的 2 个孔中，每孔加入 2 mL 培养基，其中一孔使用含“"heavy"”标记氨基酸的 SILAC 培养基，另一孔使用含“"light"”标记氨基酸的 SILAC 培养基。
  2. 将细胞连续培养至少 6 代（传代比例为 1:6）；经过 6 代培养后，“"heavy"”标记氨基酸的掺入率应超过 95%。
  3. 分别收集 1 × 106 个“"heavy"”和“"light"”标记的细胞群体，用于分析标记掺入效率。用 1× PBS 洗涤细胞，并在 160 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟以收集细胞沉淀。
  4. 将细胞沉淀重悬于 150 µL 质谱缓冲液（150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EDTA，并添加 1× 蛋白酶抑制剂混合物）中，冰上孵育 30 分钟。在 4 °C 条件下通过超声处理裂解细胞。
    注意：此处使用的超声参数如下：定时模式，保持；输出控制设为 8；占空比为 80%；进行 2 次，每次 30 个脉冲。
  5. 在 11,000 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟以去除细胞碎片。将上清液转移至新离心管中，并使用兼容去垢剂的蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
  6. 取 75 µg 蛋白质与 6× 上样缓冲液（375 mM Tris-HCl，pH 6.8，25.8% 甘油，123 mg/mL SDS，600 µg/mL 溴酚蓝，60 µL/mL β-巯基乙醇）混合，在 95 °C 煮沸 5 分钟，随后在 SDS 电泳运行缓冲液（3.02 g/L Tris 碱，18.8 g/L 甘氨酸，1 g/L SDS）中以 180 V 恒压电泳约 1 小时，或按照制造商说明书进行 SDS-PAGE 分离。
  7. 将凝胶转移至胶体考马斯亮蓝染色液中。从每条泳道中切取相同位置的蛋白条带。用胰蛋白酶消化蛋白质，并按照文献22所述方法通过质谱分析检测氨基酸掺入效率。

3. SILAC标记的Huh7.5细胞脂滴的分离

  1. 感染一组细胞（即 那些标记有 "光" 氨基酸）与HCV报告病毒通过与病毒储备液孵育例如， Jc1NS5AB-mKO2-BSD，于37 °C条件下以MOI 1感染4小时，具体方法如前所述21.
    注：Jc1NS5AB-mKO2-BSD 是一种携带荧光报告基因（单体Kusabira Orange 2，mKO2）的HCV病毒，用于监测感染率，其后接一个Blasticidin抗性基因（BSD），两者之间为重复的NS5A-NS5B切割位点，此前已有描述21,23. HCV 操作需要在 BSL2+（美国）或 S3**（德国）生物安全级别条件下进行。除 HCV 感染外，细胞也可被其他病原体感染。
  2. 扩增HCV感染 "光" 细胞与非感染细胞 "重" 细胞。在传代培养过程中，用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS固定一部分细胞，通过流式细胞术检测荧光标记蛋白以确定HCV感染率。例如， mKO2），如所述21；用于脂滴分离时，感染率应高于90%。注意： 若使用 Jc1NS5AB-mKO2-BSD HCV 毒株，加入 10 µg/mL 杀稻瘟菌素 S "光" 用于筛选HCV阳性细胞的培养基。
  3. 在脂滴分离前1天，用PBS洗涤细胞，胰酶消化，重悬于 "光" 和 "重" 培养基，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。接种 7 x 106 每种群体细胞在150 cm²培养瓶中2 细胞培养皿。每项实验至少准备5个培养皿 "光" 和 "重的" 细胞群体。将细胞在每皿30 mL培养基中过夜培养。
  4. 吸除培养基，用1x PBS洗涤细胞。使用细胞刮在1x PBS中刮下细胞。
  5. 使用血细胞计数板对两种细胞群体进行计数，并将等量细胞混合于50 mL离心管中。在160 × g、4 °C条件下离心5分钟，沉淀细胞。
  6. 移除 PBS，将细胞沉淀重悬于 1 mL 蔗糖缓冲液（0.25 M 蔗糖、1 mM EDTA 和 1 mM DTT，加入蛋白酶抑制剂混合物）中。将细胞悬液转移至严密切合的 Dounce 匀浆器中，在冰上进行 200 次研磨以裂解细胞。
    注意：使用台盼蓝染色确认细胞裂解完全。
  7. 将裂解液转移至1.5 mL离心管中，在4 °C、1,000 x g条件下离心10分钟，沉淀细胞核和细胞碎片。
  8. 离心后，取25 µL上清核后组分（PNS），于-20 °C保存，作为输入对照。
  9. 将剩余的PNS组分置于离心管（11 × 60 mm）底部，并覆盖脂滴洗涤缓冲液（约3 mL；总体积4 mL）（50 mM 磷酸钾缓冲液 pH 7.4，100 mM 氯化钾，1 mM EDTA 和 1 mM 苯甲基磺酰氟）。
  10. 在 100,000 × g、4 °C 条件下离心 2 小时。使用弯头钝针从离心管顶部收集漂浮的脂滴组分（约 250–500 µL，具体体积取决于脂滴量）。将脂滴组分转移至离心管（11 × 60 mm）中，上层覆盖脂滴洗涤缓冲液（约 3.5 mL，总体积 4 mL），重复离心步骤。
  11. 使用弯头钝性套管从管顶部收集漂浮的脂滴组分，并将脂滴转移至新的1.5 mL微量离心管中。加入500 µL脂滴洗涤缓冲液，在4 °C下以21,000 x g离心20分钟。
    注意：脂滴表现为漂浮在缓冲液上方的白色条带。
  12. 使用加样枪头移除底部的洗涤缓冲液，并重复此洗涤步骤三次。
  13. 使用加样枪头彻底移除洗涤缓冲液后 提示：将5 µL脂滴组分与10 µL NP-40裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl和1% NP-40，加入蛋白酶抑制剂混合物）混合。若处理的是感染性材料，将样品置于冰上孵育1小时以灭活病毒。使用可耐受去污剂的蛋白定量方法测定蛋白浓度；质谱分析至少需要35 µg蛋白。
  14. 将脂滴组分在 -20 °C 下保存。
  15. 将相应体积的脂滴组分与4倍上样染料混合。若处理的是具有感染性的材料，需在冰上孵育1小时以灭活病毒。然后在95 °C下煮沸5分钟。
  16. 使用 SDS-PAGE 按照生产商说明书分离蛋白质。将凝胶转移至胶体考马斯亮蓝染色液中。从凝胶中切下所有蛋白质条带。进行胶内胰蛋白酶消化后24，蒸发样品并用0.1%甲酸溶解，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。
    注意：此处的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析在四极杆-飞行时间质谱仪（Q-TOF）或线性离子阱轨道阱（LTQ Orbitrap）质谱仪上进行。两种仪器均通过电喷雾电离源（ESI）与纳米超高效液相色谱（nano-UPLC）系统联用。Q-TOF 和轨道阱质谱仪上的数据分析及 LC-MS/MS 分析均按所述方法进行21,22务必小心避免样本受到人类角蛋白的污染。始终使用无角蛋白的移液器吸头和离心管。在超净工作台内使用无角蛋白的试剂配制缓冲液。使用前，用蒸馏水和乙醇清洁所有表面和设备。操作时必须佩戴手套和实验服。

4. 脂滴纯度的分析

  1. 用 NP-40 裂解缓冲液将脂滴组分等分试样稀释 1:2，输入组分（见步骤 3.9）稀释 1:10。如果处理的是感染性材料，将样品置于冰上孵育 1 小时以灭活病毒。使用与去垢剂兼容的蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。
  2. 将等量蛋白与 6× 上样缓冲液混合，如果处理的是感染性材料，则将样品置于冰上孵育 1 小时以灭活病毒。随后进行 SDS-PAGE 电泳，并在 80 V 条件下电转 90 分钟，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。
    注意：将膜在封闭缓冲液（含 5% 脱脂奶粉的 TBS-T 缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.6、150 mM NaCl 和 0.05% Tween20））中封闭后，依次与针对脂滴标志物（e.g., PLIN1、PLIN2 或 PLIN3）以及其他亚细胞结构标志物（e.g., CALR、MnSOD 或 tubulin）的一抗孵育，再孵育 HRP 偶联的二抗。采用化学发光法检测蛋白信号。

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结果

脂滴在丙型肝炎病毒（HCV）感染中至关重要，被认为是病毒颗粒组装的潜在位点，但病毒颗粒形态发生与释放的分子机制在很大程度上仍不清楚。为了鉴定参与该过程的新型宿主依赖因子，我们对HCV感染细胞进行了定量脂滴蛋白质组分析21 (图1A）。我们建立了一种纯化脂滴的实验方案，常规检测到脂滴结合蛋白PLIN2/ADRP和PLIN3/TIP47显著富集，而其他细胞区室的标志物则明显减少，例如微管标志物β-tubulin、线粒体标志物MnSOD以及内质网标志物calreticulin/calnexin（图1B、C）。我们整理了一份在Huh7.5细胞中稳定与脂滴共分离的蛋白质列表（图1D）并利用同位素标记，鉴定了在丙型肝炎病毒（HCV）感染细胞中被特异性招募至脂滴或从脂滴上被置换的蛋白质（图1E我们的结果表明，丙型肝炎病毒（HCV）使脂滴脱离其正常的代谢功能和/或调控，并鉴定了潜在的宿主依赖因子和限制因子。...

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讨论

本文介绍了一种用于分离脂滴并进行定量脂滴蛋白质组分析的实验方案，以比较不同培养条件下（如病毒感染时）与脂滴相关蛋白的富集与耗竭情况。作为一种替代方法，也可采用基于总峰强度的无标记定量技术进行蛋白质组分析。该方法无动态范围限制，且可避免代谢标记相关的问题。SILAC方法的优势在于，样品在脂滴分离前即被混合，因此结果不受样品制备、酶解及液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）分析过程中操作误差的影响。我们强烈推荐将此方法用于定量脂滴蛋白质组分析。

由于质谱分析中观察到的脂滴相关蛋白的富集或减少可能反映了蛋白表达的诱导或抑制，因此建议通过定量RT-PCR和（优先选择）蛋白质印迹法分析其表达水平。此外，可采用两种方法验证特定蛋白在脂滴中的富集或减少：一是分离脂滴后进行蛋白质印迹分析，二是使用亲脂性染料（如BODIPY或LD540）对脂滴进行染色，并结合免疫荧光分析，具体方法如文献21所述。

进行交换标记条件的实验，以确保使用"重"同位素氨基酸标记不会影响蛋白质表达或脂滴定...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢海德堡大学的 R. Bartenschlager 提供 Jc1 载体，洛克菲勒大学的 C.M. Rice 提供 Huh7.5 细胞，英国医学研究理事会病毒学分部的 J. McLauchlan 提供 JFH1 载体，日本国立传染病研究所的 T. Wakita 提供 JFH1，以及格拉德斯通病毒学与免疫学研究所的 B. Webster 和 W.C. Greene 提供 HCVcc 报告载体。本研究得到了德国研究基金会（DFG）的资助（项目编号：HE 6889/2-1（EH）、INST 337/15-1 2013 和 INST 337/16-1 2013（HS））。海因里希·佩特研究所——莱布尼茨实验病毒学研究所——由汉堡自由汉萨市和德国联邦卫生部资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未参与。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SILAC 蛋白质定量试剂盒 - DMEM赛默飞世尔科技89983 
13C6 L-精氨酸盐酸盐 50 mg赛默飞世尔科技88210
Roti-Load 1Roth GmbHK929.1
Roti-Blue 5x 浓缩液Roth GmbHA152.2 
10x SDS-Tris-甘氨酸缓冲液Geyer Th. GmbH & Co.KG A1415,0250 
GlutaMAX（100倍浓缩液）Life Technologies GmbH 350500038 
细胞培养用青霉素/链霉素溶液Sigma-Aldrich Chemie GmbH P4333-100ml 
DPBS 1x 消息氏磷酸盐缓冲液Sigma-Aldrich Chemie GmbH D8537 
胰蛋白酶-EDTASigma-Aldrich Chemie GmbH T3924-100ML 
氯化钠 生物化学AppliChem GmbHA1149,1000
Tris 超纯  AppliChem GmbHA1086,5000A 
EDTA BioChemicaAppliChem GmbHA1103,0250
蛋白酶抑制剂混合物 5 mLSigma-Aldrich Chemie GmbH P8340-5ML 
D(+)-蔗糖 BioChemicaAppliChem GmbHA3935,1000
盐酸（HCl）37% 纯度，Ph. Eur.，NFAppliChem GmbHA0625
DC 蛋白测定 Bio-Rad Laboratoris GmbH 500-0116 
甘油AppliChem GmbH151339
SDS 超纯AppliChem GmbHA1112
溴酚蓝AppliChem GmbHA2331
ββ-巯基乙醇 AppliChem GmbHA4338
杀稻瘟菌素Invivogenant-bl-1 
氯化钾 AppliChem GmbHA1039
苯甲基磺酰氟 AppliChem GmbHA0999
磷酸二氢钾Sigma-Aldrich Chemie GmbH 221309
磷酸氢二钾Sigma-Aldrich Chemie GmbH P3786 
DTT AppliChem GmbHA2948
NP-40AppliChemA1694
TWEEN 20AppliChemA4974
脱脂奶粉AppliChemA0830
抗ADFP/ADRP abcamab52355
M6PRB1/TIP47 100 µgabcamab47639
钙网蛋白，多克隆抗体 200 µgEnzo Life Science GmbH ADI-SPA-600-F 
抗-β-微管蛋白 Sigma-Aldrich Chemie GmbH T6074 200µl  
乙醇（绝对）（EtOH）Geyer Th. GmbH & Co.KG A3678,0250  
抗MnSODEnzo Life Science GmbH ADI-SOD-110-F
抗小鼠 HRP赛默飞世尔科技皮尔斯32430
抗兔 HRP赛默飞世尔科技  皮尔斯32460
Amersham Hyperfilm ECLGE Healthcare28906836
Lumi-Light 蛋白质印迹底物Sigma-Aldrich Chemie GmbH 12015196001
96孔细胞培养板Greiner Bio-One GmbH 655 180 
Terumo 注射器 1 mL泰尔茂SS-01T
Filtropur BT 50，500 mL，0.45 µm SARSTEDT 83.1823.100 
Mini-PROTEAN TGX 预制胶，任意kD分离胶Bio-Rad Laboratoris GmbH 456-9034 
6孔细胞培养板Greiner Bio-One GmbH 657160 
Nunclon 培养皿 150/20 Fisher Scientific GmbH 10098720 - 168381 
细胞刮刀neoLab Migge GmbH C-8120 
50 mL 离心管Greiner Bio-One GmbH 227261 
SafeSeal 管，无 RNase SARSTEDT 72.706.400 
超透明离心管 11 x 60 mm贝克曼库尔特有限公司 344062 
吸液针Transcodent6482
Biosphere Fil. Tip 1000 SARSTEDT 70.762.211 
Biosphere Fil. Tip 200SARSTEDT 70.760.211 
Biosphere Fil. Tip 10SARSTEDT 70.1130.210 
Dounce 组织研磨器Fisher Scientific GmbH 11883722
Dounce 全玻璃组织研磨器用研杵Fisher Scientific GmbH 10389444
Orbitrap Fusion
Branson 超声破碎仪 450
Thermomixer comfort，配备 Thermoblock 1.5 mLEppendorf5355 000.127
Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽、Mini Trans-Blot 转印模块和 PowerPac Basic 电源供应器， 伯乐（BioRad）165-8033
Mini-PROTEAN 3 多用制胶室伯乐（BioRad）165-4110
PowerPac HC 电源供应器伯乐（Biorad）164-5052
离心 Eppendorf5424R
离心 Eppendorf5424
Optima L-90KBeckman Coulter GmbH 365670
SW 60 Ti 转子Beckman Coulter GmbH 335649
Infinite M1000 PROTecan

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