脂滴是多种病原体复制的重要细胞器，包括丙型肝炎病毒（HCV）。本文描述了一种用于分离脂滴并对其相关蛋白进行定量质谱分析的方法；该方法可用于多种实验条件，如病毒感染、环境应激或药物处理。
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摘要
摘要
脂滴对多种病原体的复制至关重要，其中最显著的是丙型肝炎病毒（HCV），因其被认为是病毒颗粒形态发生的潜在位点。通过定量脂滴蛋白质组分析，可鉴定在病毒感染等条件下定位于脂滴或从脂滴上移位的蛋白质。本文描述了一种已成功用于表征HCV感染后脂滴蛋白质组变化的实验方案。我们采用细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记技术（SILAC），从而对一个细胞群体的完整蛋白质组进行标记 "重" 氨基酸，通过质谱法对蛋白质进行定量。对于脂滴分离，两种细胞群体（即 HCV 感染的/"光" 氨基酸和未感染对照/"重" 氨基酸）以1:1比例混合，并在低渗缓冲液中进行机械裂解。通过低速离心去除细胞核和细胞碎片后，利用两次连续的超速离心步骤富集脂滴相关蛋白，随后在等渗缓冲液中洗涤三次。通过针对不同亚细胞结构的抗体进行蛋白质印迹（Western blotting）分析，评估脂滴组分的纯度。脂滴相关蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，使用考马斯亮蓝染色。经胰蛋白酶消化后，采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）对肽段进行定量分析。利用该方法，我们鉴定了丙型肝炎病毒（HCV）感染后招募至脂滴的蛋白质，这些蛋白质可能代表促病毒或抗病毒的宿主因子。本方法可广泛应用于多种不同细胞类型及培养条件，例如病原体感染、环境应激或药物处理等情境。
引言
脂滴是高度动态的细胞质（以及细胞核）细胞器，由中性脂质（甘油三酯（TG）和胆固醇酯（CE））核心构成，外层包裹着含有嵌入蛋白的磷脂单分子层。1所有细胞类型均能产生脂滴，但其在大小、脂质组成和表面蛋白修饰方面存在差异。脂滴具有多种功能，包括作为能量和膜前体物质的储存库，或作为蛋白质的沉积场所。此外，通过摄取脂质，脂滴可保护细胞免受脂毒性损伤，释放脂质作为信号分子，并参与蛋白质降解以及内质网（ER）应激反应。2因此，多种蛋白质会结合到脂滴上，调控其生成、降解、转运以及与其他细胞器的相互作用。其中包括脂滴包被蛋白家族（perilipin family） 真正 脂滴结合蛋白（PLIN1-5）3.
脂滴的生成很可能起始于内质网（ER），在内质网中，定位于ER的酶催化中性脂质的合成，这些中性脂质在膜双分子层内积聚，形成中性脂质透镜结构，这一过程最近在酵母中得到了清晰的可视化展示4。随后，膜弯曲以及磷脂酸和二酰甘油水平的升高被认为会招募参与磷脂生物合成的蛋白质，因为核心中性脂质与包被性磷脂的同步合成是脂滴生成所必需的5。这一过程由含有跨膜结构域并定位于内质网的酶催化完成。脂滴进一步扩大为大型脂滴则需要另一类含有两亲性螺旋的脂质合成酶，这....
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方案
1. 细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）培养基的制备
注意：此处使用 SILAC 蛋白质定量试剂盒——DMEM 培养基中添加了 50 mg 的 13C6 L-盐酸精氨酸用于 SILAC 标记。透析胎牛血清（FCS）随 SILAC 蛋白质定量试剂盒提供。
- 从每瓶 DMEM 培养基中移除 50 mL，并加入 50 mL 透析过的 FCS。
- 将 50 mg 13C6 L-赖氨酸-2HCl 和 50 mg 13C6 L-精氨酸-HCl 溶解于 1 mL 培养基中。充分混匀后，将氨基酸加入 DMEM + FCS 培养基中。
- 添加 1× 青霉素-链霉素溶液和 1× L-谷氨酰胺替代物。使用 0.45 µm 滤器对培养基进行无菌过滤。将该瓶培养基标记为 "heavy" SILAC 培养基。
- 制备 "light" 培养基时，使用 50 mg L-精氨酸-HCl 和 50 mg L-赖氨酸-2HCl 重复步骤 1.1–1.3。将该瓶培养基标记为 "light" SILAC 培养基。
2. SILAC标记与氨基酸掺入控制
- 用胰蛋白酶（....
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结果
脂滴在丙型肝炎病毒（HCV）感染中至关重要，被认为是病毒颗粒组装的潜在位点，但病毒颗粒形态发生与释放的分子机制在很大程度上仍不清楚。为了鉴定参与该过程的新型宿主依赖因子，我们对HCV感染细胞进行了定量脂滴蛋白质组分析21 (图 1A）。我们建立了一种纯化脂滴的方案，常规检测到脂滴结合蛋白PLIN2/ADRP和PLIN3/TIP47显著富集，而其他细胞器标志物则明显减少，例如微管标志物β-tubulin、线粒体标志物MnSOD，以及内质网标志物calreticulin/calnexin（图 1B、C）。我们整理了一份在Huh7.5细胞中稳定与脂滴共分离的蛋白质列表（图1D）并利用同位素标记，鉴定了在丙型肝炎病毒（HCV）感染细胞中被特异性招募至脂滴或从脂滴上被置换的蛋白质（图1E我们的结果表明，丙型肝炎病毒（HCV）使脂滴脱离其正常的代谢功能和/或调控机制，并鉴定了潜在的宿主依赖因子和限制因子.......
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讨论
本文介绍了一种用于分离脂滴并进行定量脂滴蛋白质组分析的实验方案，以比较不同培养条件下（如病毒感染时）与脂滴相关蛋白的富集与耗竭情况。作为一种替代方法，也可采用基于总峰强度的无标记定量技术进行蛋白质组分析。该方法无动态范围限制，且可避免代谢标记相关的问题。SILAC方法的优势在于，样品在脂滴分离前即被混合，因此结果不受样品制备、酶解及液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）分析过程中操作误差的影响。我们强烈推荐将此方法用于定量脂滴蛋白质组分析。
由于质谱分析中观察到的脂滴相关蛋白的富集或减少可能反映了蛋白表达的诱导或抑制，因此建议通过定量RT-PCR和（优先选择）蛋白质印迹法分析其表达水平。此外，可采用两种方法验证特定蛋白在脂滴中的富集或减少：一是分离脂滴后进行蛋白质印迹分析，二是使用亲脂性染料（如BODIPY或LD540）对脂滴进行染色，并结合免疫荧光分析，具体方法如文献21所述。
进行交换标记条件的实验，以确保使用"重"同位素氨基酸标记不会影响蛋白质表达或脂滴定.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢海德堡大学的 R. Bartenschlager 提供 Jc1 载体，洛克菲勒大学的 C.M. Rice 提供 Huh7.5 细胞，英国医学研究理事会病毒学分部的 J. McLauchlan 提供 JFH1 载体，日本国立传染病研究所的 T. Wakita 提供 JFH1，以及格拉德斯通病毒学与免疫学研究所的 B. Webster 和 W.C. Greene 提供 HCVcc 报告载体。本研究得到了德国研究基金会（DFG）的资助（项目编号：HE 6889/2-1（EH）、INST 337/15-1 2013 和 INST 337/16-1 2013（HS））。海因里希·佩特研究所——莱布尼茨实验病毒学研究所——由汉堡自由汉萨市和德国联邦卫生部资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未参与。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SILAC 蛋白质定量试剂盒 - DMEM | 赛默飞世尔科技 | 89983 | |
| 13C6 L-精氨酸盐酸盐 50 mg | 赛默飞世尔科技 | 88210 | |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 | |
| Roti-Blue 5x 浓缩液 | Roth GmbH | A152.2 | |
| 10x SDS-Tris-甘氨酸缓冲液 | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 | |
| GlutaMAX（100倍浓缩液） | Life Technologies GmbH | 350500038 | |
| 细胞培养用青霉素/链霉素溶液 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml | |
| DPBS 1x 消息氏磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML | |
| 氯化钠 生物化学 | AppliChem GmbH | A1149,1000 | |
| Tris 超纯 | AppliChem GmbH | A1086,5000A | |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 5 mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML | |
| D(+)-蔗糖 BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 | |
| 盐酸（HCl）37% 纯度，Ph. Eur.，NF | AppliChem GmbH | A0625 | |
| DC 蛋白测定 | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 | |
| 甘油 | AppliChem GmbH | 151339 | |
| SDS 超纯 | AppliChem GmbH | A1112 | |
| 溴酚蓝 | AppliChem GmbH | A2331 | |
| ββ-巯基乙醇 | AppliChem GmbH | A4338 | |
| 杀稻瘟菌素 | Invivogen | ant-bl-1 | |
| 氯化钾 | AppliChem GmbH | A1039 | |
| 苯甲基磺酰氟 | AppliChem GmbH | A0999 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 | |
| 磷酸氢二钾 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 | |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 | |
| NP-40 | AppliChem | A1694 | |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 | |
| 脱脂奶粉 | AppliChem | A0830 | |
| 抗ADFP/ADRP | abcam | ab52355 | |
| M6PRB1/TIP47 100 µg | abcam | ab47639 | |
| 钙网蛋白，多克隆抗体 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F | |
| 抗-β-微管蛋白 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl | |
| 乙醇（绝对）（EtOH） | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 | |
| 抗MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F | |
| 抗小鼠 HRP | 赛默飞世尔科技皮尔斯 | 32430 | |
| 抗兔 HRP | 赛默飞世尔科技 皮尔斯 | 32460 | |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 | |
| Lumi-Light 蛋白质印迹底物 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 | |
| 96孔细胞培养板 | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 | |
| Terumo 注射器 1 mL | 泰尔茂 | SS-01T | |
| Filtropur BT 50，500 mL，0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 | |
| Mini-PROTEAN TGX 预制胶，任意kD分离胶 | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 | |
| 6孔细胞培养板 | Greiner Bio-One GmbH | 657160 | |
| Nunclon 培养皿 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 - 168381 | |
| 细胞刮刀 | neoLab Migge GmbH | C-8120 | |
| 50 mL 离心管 | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| SafeSeal 管，无 RNase | SARSTEDT | 72.706.400 | |
| 超透明离心管 11 x 60 mm | 贝克曼库尔特有限公司 | 344062 | |
| 吸液针 | Transcodent | 6482 | |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 | |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 | |
| Dounce 组织研磨器 | Fisher Scientific GmbH | 11883722 | |
| Dounce 全玻璃组织研磨器用研杵 | Fisher Scientific GmbH | 10389444 | |
| Orbitrap Fusion | |||
| Branson 超声破碎仪 450 | |||
| Thermomixer comfort，配备 Thermoblock 1.5 mL | Eppendorf | 5355 000.127 | |
| Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽、Mini Trans-Blot 转印模块和 PowerPac Basic 电源供应器， | 伯乐（BioRad） | 165-8033 | |
| Mini-PROTEAN 3 多用制胶室 | 伯乐（BioRad） | 165-4110 | |
| PowerPac HC 电源供应器 | 伯乐（Biorad） | 164-5052 | |
| 离心 | Eppendorf | 5424R | |
| 离心 | Eppendorf | 5424 | |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 | |
| SW 60 Ti 转子 | Beckman Coulter GmbH | 335649 | |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
参考文献
- Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Brasaemle, D. L.
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