利用超常光学透射技术定量检测人血清中的心脏生物标志物

摘要

本研究描述了一种纳米压印光刻技术，用于制备基于异常光学透射原理的高质量传感阵列。该生物传感器成本低、稳定性好、操作简便，可在临床相关浓度下检测血清中的心肌肌钙蛋白I（99^th 百分位数截断值 ∼10–400 pg/mL，具体取决于检测方法。

摘要

为了使生物传感平台在即时检测（POC）环境中具有临床相关性，检测的灵敏度、可重复性以及在人血清背景中可靠监测分析物的能力至关重要。

纳米压印光刻技术（NIL）被用于低成本制备面积达1.5 mm × 1.5 mm的传感区域。传感表面由高保真度的纳米孔阵列构成，每个纳米孔的面积约为140 nm²NIL 的高度可重复性使得在 12 个独立制造的表面上采用“单芯片、单次测量”策略成为可能，芯片间的差异极小。这些纳米压印局域表面等离子体共振（LSPR）芯片在复杂生物流体（此处为人类血清）背景下，对浓度范围为 2.5 至 75 ng/mL 的生物分析物进行了广泛测试，验证了其可靠检测能力。NIL 的高保真特性可实现大面积传感区域的制备，从而无需使用显微镜，因为该生物传感器可轻松与实验室常见的光源耦合。这些生物传感器对血清中心肌肌钙蛋白的检测具有高灵敏度，检出限（LOD）达 0.55 ng/mL，具有临床相关性。同时，芯片间变异率低（归因于高质量的制备工艺）。检测结果与广泛使用的酶联免疫吸附测定（ELISA）法相当，但该技术仍保留了基于 LSPR 传感平台的各项优势。即， 易于微型化和多重检测，使其在即时检测（POC）应用中更具可行性。

引言

自埃贝森首次报道纳米孔阵列的异常光学透射（EOT）现象以来，基于纳米孔阵列的化学传感器已成为众多研究的课题 等 1998年¹当光照射到亚波长尺度的纳米孔周期性阵列时，会在特定波长处出现增强的透射现象。这种现象发生在入射光与布洛赫波表面极化激元（BW-SPP）和/或局域表面等离激元（LSP）发生耦合时。².

利用此类周期性阵列进行生物传感时所依赖的基本物理原理十分简单。当分子吸附到金属界面或其附近时，会改变与金属接触的介质的介电常数，从而导致光谱中透射带位置发生偏移。通过纳米级的结构设计，可对纳米结构的形状、尺寸及间距进行调控，进而调节光谱特性^3,4,5。基于异常光学透射（EOT）的传感器在设计上具有特定的光谱特征峰，便于在研究分子结合事件时进行明确指认^6,7,8，这一特性相较于市面上现有的表面等离子体共振（SPR）平台具有显著优势。

使用EOT的传感器通常需要一个光学对准的光源，使准直光束照射到传感表面。用于制备大面积纳米孔表面的技术，如共聚物模板法、干涉光刻法和纳米球光刻法，其重复性较差⁹。由于在精确制备表现出EOT现象的大面积表面方面存在这些限制，因此需要使用光学显微镜来准确定位光源和探测器。为了简化该技术，采用了高质量的纳米压印光刻技术（NIL）¹⁰，从而实现了大面积传感器表面¹¹（毫米级）的制备，不再需要借助显微镜在芯片上寻找传感区域。相反，该传感器可轻松与标准光纤电缆连接。

由于该纳米孔阵列的透射峰位于可见光到近红外区域（NIR），因此非常适用于在水相环境中检测生物分子的结合事件。研究人员对该纳米孔阵列预期的光学行为进行了模拟，并通过标准折射率（RI）液体的实验研究验证了模拟结果。随后，利用该阵列在人血清的复杂背景下检测了心肌肌钙蛋白I（cTnI）的浓度。cTnI是临床诊断急性心肌梗死的金标准。

利用该传感器，可在人血清中检测并定量心肌肌钙蛋白I（cTnI），检测限（LOD）为0.55 ng/mL，具有临床相关性。该检测速度明显快于该领域最常用的酶联免疫吸附测定（ELISA）技术。此外，传感表面易于再生，因而可重复使用。因此，本研究展示了纳米孔阵列作为在复杂生物流体中进行生物传感的一种可行的即时检测（POC）技术的前景。

方案

1. 传感器的制备与数据采集

1. 镍模具的制备
   1. 在厚度为600 µm的4英寸硅片上涂覆一层220 nm厚的负性电子束抗蚀剂。使用电子束光刻系统在该硅片上写入设计的纳米孔阵列。
      1. 为加快电子束曝光速度，每个300 µm的场尺寸（A）采用20k的低点阵图（N）进行图形曝光（即， 每300 µm映射有4亿个点² 区域，每个点根据图案设计将被电子束曝光或不被曝光）。设定电子束抗蚀剂的曝光剂量为 110 µC/cm²⁻² 并以800 pA的电流（I）进行记录。
         注意：在电子束光刻中，曝光剂量（D）由每个点的曝光时间（T）控制_点），通过计算得出 . 对于110 µC cm处的曝光剂量⁻²，每个曝光点的电子束停留时间为0.5 µs¹². 由于该阵列捕获的区域为1.8 mm²，共有36个300-µm的补丁² 将多个区域拼接在一起，形成一个大型的金纳米孔阵列。
   2. 将4英寸硅片浸入显影液中10秒进行显影，随后让硅片在空气中自然干燥。
   3. 在硅片上沉积一层金属种子层，例如镍、铜或铝。
   4. 在镀镍磺胺酸盐溶液中，使用电镀系统对晶圆进行电镀。电镀过程分两步进行：第一步持续95分钟，电流密度为0.7 A dm⁻²；⁻²；这将使镍完全填充纳米图案。在第二步中，持续125分钟，使用12 A dm⁻²⁻² 使最终镍模具厚度达到300 µm（20 nm）。确保pH值为3.5 - 3.8，温度为52 - 54 °C。
   5. 通过施加轻微的机械力将镍模具从硅基底上分离。将镍模具浸泡在约100 mL的正性光刻胶去除剂中过夜，以清除电子束光刻胶的残留物。
   6. 将镍模具放入烘箱中，在100 °C下干燥3小时。随后在等离子体刻蚀系统中用O₂进行清洗。₂ 气体以10 sccm流速和100 W功率处理3分钟。
2. 金纳米结构的制备
   1. 在自组装单分子层（SAM）镀膜机中，于80 °C下将150 µL十七氟-1,1,2,2-四氢癸基三氯硅烷（FDTS）涂覆于镍模具表面。
      注意：这将形成一层防粘层，可在纳米压印步骤完成后实现模具与光刻胶的分离（“脱模”）。汽化时间应为 180 s，反应时间应为 900 s。
   2. 使用纳米压印机在已涂覆300 nm厚光固化纳米压印光刻胶的4英寸玻璃晶圆上压印纳米图案，压印条件为压力10 bar、温度40 °C，持续10 min。
   3. 将模具、光刻胶和玻璃晶圆转移至紫外光固化系统中，用 75 mW cm 的光照进行光固化^-2 紫外线照射30秒。
      注意：如果所有步骤均正确执行，镍模具应能轻松从光刻胶上脱模。
   4. 在反应离子刻蚀（RIE）系统中，对玻璃基底上的光刻胶执行空白刻蚀，使用 O₂ 10 sccm 气体流量下，50 W 功率处理 2 秒，以暴露凹陷区域的玻璃。
   5. 在电子束沉积设备中，在玻璃晶圆上沉积一层5 nm厚的铬（Cr）以增强金属附着力，并沉积一层100 nm厚的金（Au）作为等离子体传感器。沉积速率为1 Å/s。⁻¹ 对于 Cr 为 2 Å/s⁻¹ 用于 Au。
   6. 通过O进行光刻胶的剥离₂ 等离子体刻蚀3分钟，随后在丙酮中超声处理15秒。
   7. 将样品切成 5 mm × 5 mm 的小片。纳米孔阵列将位于芯片中央的 2 mm × 2 mm 区域。
3. 数据采集
   1. 搭建光学测量装置，使白光光束从发射端光纤末端射出后被准直，并以90°垂直入射到传感器表面（纳米孔阵列）上。
      注意：光会穿过整个纳米孔阵列。
   2. 使用接收光纤收集透射信号，并用波长范围为300至1,000 nm的紫外-可见分光光度计记录。
   3. 将每帧的采集时间设置为20 ms，对100帧进行平均以获得最终光谱，从而降低测量中的噪声。
   4. 使用绘图软件，基于先前已识别的透射峰（采用洛伦兹拟合法）对数据进行分析。

2. 传感器体相灵敏度测试

1. 将折射率（RI）从1.31到1.39的标准RI液体注入液体池中。
2. 将传感器芯片浸入标准RI液体中，并与白光光束对准，获取透射光谱。
3. 每次测量后，使用表面活性清洗剂清洁传感器芯片，并用氮气吹干。

3. 传感器表面修饰

1. 在进行任何化学修饰之前，依次将传感器芯片浸入异丙醇、丙酮和去离子水中进行清洗。在室温下用干燥氮气流吹干。
2. 将传感器芯片置于含有0.4 mM 10-羧基-1-癸硫醇和1.6 mM 1-辛硫醇的乙醇溶液中，在室温下孵育12小时。
   注意：这将形成一种可与胺基反应的自组装单分子层（SAM）。
3. 用乙醇充分冲洗，并在室温下干燥。
4. 配制含有75 mM 磺基-N-羟基琥珀酰亚胺（sulfo-NHS）和15 mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）的混合溶液。将芯片浸入该混合液中15分钟。
   注意：此步骤将活化SAM中的羧基。
5. 在传感器表面点加50 µL用pH 4.5醋酸缓冲液配制的200 µg/mL抗肌钙蛋白抗体溶液，孵育30分钟。
6. 将传感器芯片浸入1 M乙醇胺盐酸盐溶液中15分钟，以封闭未反应的酯基。
7. 用去离子水冲洗芯片，并在室温下用干燥氮气流吹干。

4. cTnI 检测

1. 通过在表面点样 100 µL 的 1% 牛血清白蛋白（BSA）溶液，封闭任何非特异性结合位点。孵育 15 分钟。
2. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液将传感器芯片冲洗三次。将芯片插入测量池中，记录透射光谱。
   注意：此为参考光谱。
3. 在芯片表面点样 50 µL 的 cTnI 标准品，于湿润环境中孵育 30 分钟。
4. 用 PBS 溶液将传感器芯片冲洗三次，然后将其插入测量池中，记录透射光谱。
   注意：此为结合后的光谱。
5. 将芯片浸入 50 mM 甘氨酸-盐酸（pH 2）溶液中 1 分钟，随后用 PBS 溶液冲洗三次，以再生芯片表面。在 PBS 中测量透射光谱，以验证再生步骤是否成功。

5. 表面等离子体共振（SPR）检测

1. 使用 PBS-T 缓冲液在 SPR 系统上运行多重 SPR 传感器芯片。
   注：PBS-T 缓冲液的组成为 20 mM 磷酸钠、150 mM 氯化钠和 0.05% Tween 20，pH 值为 7.4。
2. 使用步骤 4 中所述的 cTnI 标准品和抗体。
3. 使用 EDC（0.2 M）和 sulfo-NHS（0.05 M）的混合物活化 6 个可用通道中的 3 个，持续 5 分钟。随后进行 50 µg/mL 抗体 560 的 5 分钟注射，以及 1 M 盐酸乙醇胺溶液的 5 分钟注射。
4. 将传感器芯片旋转 90°，然后注入不同浓度的 cTnI 标准品（75、30、7.5 和 2.5 ng/mL）。
5. 通过 SPR 读数实时观察芯片上相互作用位点处抗体与目标物的结合情况。
6. 通过注入 50 mM 盐酸甘氨酸（pH 2）溶液 1 分钟来再生芯片。

结果

用于测量的光学装置如图1A所示。纳米孔阵列的实际图像见图1B。为了理解驱动传感过程的物理机制，使用COMSOL仿真软件模拟了水环境中等离激元场的分布，并将仿真结果与实际测量结果进行了关联。此前发表的一项研究详细说明了仿真中所采用的假设和参数^11,13。用于模拟纳米孔阵列等离激元场的物理尺寸如下：p = 400 nm，D = 150 nm，T = 100 nm。在计算透射光谱时，还考虑了吸收和散射效应¹⁴。模拟光谱与实验测得的光谱在图1C中进行了比较。模拟光谱和实测光谱均显示出在450至850 nm范围内存在四个吸收带。位于495 nm处的吸收带对应于金的带间跃迁。随后的三个吸收带按波长递增顺序分别称为I-III带，其位置分别为560...

讨论

模拟入射光与纳米结构之间的相互作用，可以确定透射光谱中合适的特征峰，其峰位偏移可记录为分析物浓度的函数。需要注意的是，相对于传感器结构的能带局域化特性，对于选择可用于追踪分析物的合适能带至关重要。这种可视化可通过模拟实现，对设计能够实现生物传感的最优结构也具有关键意义。如图所示，能带 I 和 III 局域在玻璃-金界面处，因此不适合用于生物传感。而能带 II 表现出显著的局域表面等离子体共振（LSPR）成分，具有较短的衰减长度，并局域于纳米孔边缘，因此非常适合用于检测分析物浓度。整个阵列中所制备纳米结构的质量也对采集光谱的质量至关重要，结构不均匀会引入伪影。

散射和不可避免的吸收会在水相测量中产生伪影。水相介质的存在也会干扰整体的信噪比。如果存在多个可用于监测生物传感信号位移的合适谱带，则必须考虑以下几点。在波长低于600 nm时，观测到的透射光谱会显著受到蛋白质吸收和颗粒散射的影响。另一方面，使用大于900 nm的波长可能会掩盖来自结合事件的重要底层信号，从而造成干扰，因为在该区域水的吸收随波长增加而增强。因此，对于在水相环境中检测分析物，谱带II在波长位置上处于最优范围。在谱带...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电子束光刻设备	Elionix ELS 700
邻二甲苯	Sigma Aldrich	95662
电子束光刻胶	住友化学	NEB-22A2
显影液试剂	Shipley 公司	Microposit MF 321
电镀设备	Technotrans AG RD 50
光刻胶剥离剂	Rohm and Haas 电子材料 有限责任公司	Microposit Remover 1165
刻蚀系统	Trion Phantom
十七氟-1,1,2,2-四氢癸基三氯硅烷	Gelest (宾夕法尼亚州, 美国)	78560-44-8
自组装单分子层涂覆仪	Sorona 公司	AVC 150M
光固化纳米压印光刻胶	micro resist technology GmbH	mr-UVCur21-300nm
光固化系统	Dymax	Model 2000 Flood
电子束蒸发设备	Denton Explorer
紫外-可见光谱仪	Ocean Optics HR2000+ (佛罗里达州邓迪, 美国)
标准折射率液体	Cargill 公司 (新泽西州雪松格罗夫, 美国)	18032
绘图软件	Origin	Origin Pro 9
10-羧基-1-癸硫醇	Dojindo 实验室 (日本)	C385-10
1-辛硫醇	Sigma-Aldrich, 密苏里州, 美国	471386
磺基-N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺	BioRad (加利福尼亚州, 美国)	1762410
抗肌钙蛋白抗体 560	Hytest (芬兰)	4T21
乙醇胺盐酸盐溶液	BioRad (加利福尼亚州, 美国)	1762450
表面等离子体共振设备	BioRad XPR36 (以色列海法)
多通道 SPR 芯片	BioRad	GLC
人cTnI标准品	Phoenix Pharmaceuticals	EK -311-05
甘氨酸盐酸盐	BioRad (加利福尼亚州, 美国)	1762221