一种制备昆虫细胞并用杆状病毒感染以生产重组mCD1d蛋白及生成mCD1d四聚体的方法。
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本文内容
摘要
摘要
CD1蛋白构成了一类第三种抗原提呈分子。它们是细胞表面糖蛋白，以分子量约为50 kDa的糖基化重链形式表达，并与β2-微球蛋白非共价结合。这类分子结合脂类而非肽类。尽管其结构证实CD1蛋白与MHC I类和II类抗原提呈分子具有相似性，但小鼠CD1d（mCD1d）的抗原结合槽相对较窄、较深，且高度疏水，具有两个结合口袋，而经典的由MHC编码的抗原提呈分子则具有多个较浅的结合口袋。根据其氨基酸序列，这种疏水性结合槽为脂类抗原的结合提供了理想的环境。
自然杀伤T细胞（NKT细胞）通过其T细胞受体（TCR）识别由CD1d分子结合或呈递的糖脂。对由CD1分子呈递的脂质产生反应的T细胞，已证实参与了对自身免疫性疾病和感染性疾病的防护，以及肿瘤排斥反应。因此，识别、纯化并追踪CD1反应性NKT细胞应答的能力具有重要意义。由α-半乳糖基神经酰胺（a-Galcer）与CD1d构成的四聚体的开发，极大地促进了人们对NKT细胞生物学特性的理解。其他基于不同CD1分子构建的四聚体也已被成功制备，这些新型试剂显著拓展了人们对脂质反应性T细胞功能的认识，在监测脂质疫苗应答、自身免疫性疾病诊断及其他治疗应用中具有潜在价值。
方案
一、解冻细胞
取一管冻存的 TN5 细胞，在 37°C 水浴中解冻。向 25 cm2 组织培养瓶中加入 5 ml 昆虫 Express 培养基（Invitrogen，货号-10486）。注意：Express 培养基不含谷氨酰胺，需向每升培养基中添加 10 ml 100X 谷氨酰胺-青霉素-链霉素混合液或单独的谷氨酰胺。将 TN5 细胞加入培养瓶中，在 27°C 培养箱中孵育 30 分钟。随后，轻轻吸除含 DMSO 的培养基，注意不要扰动贴壁于瓶底的细胞。加入 5 ml 新鲜培养基。
二、细胞的培养与扩增
每天观察细胞生长情况。当培养瓶中细胞融合度接近70%时，通过轻敲培养瓶两侧使细胞脱落悬浮，加入21 ml昆虫表达培养基和5 ml细胞培养物，将细胞转移至175 cm2培养瓶中。每个T175培养瓶的终体积应约为25–30 ml培养基。 根据需要，将融合生长的培养瓶（细胞浓度约为100万个/ml）以1/4或1/5比例传代。切勿让细胞过度生长。记录细胞传代次数。传代次数不得超过30代，以免导致细胞老化并引发细胞裂解。当细胞达到目标体积且浓度为100万个/ml时，进行细胞感染操作。
我通常培养至2到2.5升，这通常相当于七十个175 cm2的培养瓶，每瓶约25至30 ml，或五个1升的锥形瓶，每瓶约400至500 ml
注意：您可以在 T-175 密封插头培养瓶或 Corning 锥形瓶中培养细胞。在锥形瓶中培养细胞速度更快，操作更简便。
三、通过终点稀释法测定病毒滴度
- 在96孔平底培养板中，每孔加入200 µl Express Five SFM培养基，接种3000-5000个细胞。将细胞置于27°C环境中静置，至少30分钟使其贴壁。
- 对杆状病毒原液进行系列稀释。在96孔U型底培养板的一排孔中，用多通道移液器以每孔250 µl的Express Five SFM培养基进行10倍梯度稀释。
- 使用多通道移液器，将不同稀释度的病毒液各取固定体积（通常为20 µl），加入已接种细胞的孔中。
- 在27°C培养7天。为防止边缘孔液体蒸发，需用封口膜将培养板边缘密封。
- 培养7天后，观察培养板，确定引起50%感染率的病毒稀释度（即在此病毒浓度下，约一半孔中的细胞被感染）。随后使用公式计算病毒滴度，结果以pfu/ml（pfu：空斑形成单位）表示。该计算公式可在大多数杆状病毒操作手册中找到。
四、感染细胞
准确了解病毒的滴度非常重要。加入所需量的病毒。在制备病毒储备液时，应以不超过1的感染复数（MOI）（每1个High Five细胞感染1个pfu）感染细胞。较高的MOI会导致病毒突变的产生。在蛋白表达时，通常使用的MOI为5-10。
示例：
mCD1d 杆状病毒的滴度 = 1×10⁸ pfu/mL
加入MOI=1（用于扩增病毒）= 每瓶20×10⁶个细胞 / 1×10⁸ pfu / ml = 每瓶200 µl
MOI = 5 至 10（用于蛋白质生产）= 每 20×10⁶ 个细胞/烧瓶加入 1 ml 至 2 ml
感染后第4天，观察感染的细胞。此时细胞应已脱落、漂浮、肿胀，并呈香肠状。
五、回收上清液
取出感染的培养瓶中的培养基，转移至250 ml蓝色瓶盖Falcon旋转瓶中。这些瓶子可高压灭菌后重复使用。将瓶子均匀装满，在Sorvall GSA转子中以200 rpm、4°C离心20分钟。收集上清液，并进行后续纯化步骤。
六、重组 mCD1d 的纯化
- 在150 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中透析并浓缩
- 通过Ni-NTA琼脂糖层析，用150 mM磷酸钠 + 200 mM咪唑洗脱蛋白mCD1d+b2m
- 使用20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8）通过脱盐柱去除咪唑
- 使用MonoQ柱进行阴离子交换层析，以去除残留杂质
- 使用YM 30浓缩器（Millipore）浓缩至1 mg/ml
- 根据生产商说明书（Avidity），利用BirA酶对mCD1d进行生物素化标记
- 通过S200柱（凝胶过滤层析）使用磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）去除游离生物素。平均每2升上清液可获得2至3 mg的生物素化蛋白
- mCD1d-α-GalCer四聚体的制备
为了将CD1d分子与α-GalCer结合，将可溶性生物素标记的CD1d-β2m与三倍摩尔过量的α-GalCer在含0.5% Tween-20的PBS（0.9%氯化钠）溶液中于室温孵育过夜。通过将负载α-GalCer的CD1d单体与四倍摩尔过量的PE标记链霉亲和素混合，并在室温孵育4小时，生成四聚体。储存于48°C。
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讨论
本实验步骤介绍了如何启动、培养昆虫细胞，以及如何利用这些细胞感染并测定杆状病毒的滴度。该实验最关键的部分在于细胞的维持以及准确测定杆状病毒的滴度。一旦制备出CD1四聚体，便可作为分析糖脂反应性T细胞的有力工具。杆状病毒系统还被广泛用于表达重组蛋白，包括MHC II类分子四聚体，因此本实验方法具有更广泛的适用性。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | 无血清培养基 | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | 昆虫细胞 | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | 抗生素 | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25 cm² TC 培养瓶 | 塑料培养瓶 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm² TC 培养瓶 | 带塞密封培养瓶 | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| 锥形瓶 | 细胞培养用锥形瓶 | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 浓缩器 | 30,000 分子量截留值（MWCO） | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC 设备 | GE Healthcare | |||
| BrA 酶与缓冲液 | 生物素化试剂盒 | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA 琼脂糖柱 | His标签蛋白纯化柱 | GE Healthcare | ||
| 脱盐柱 | 用于去除蛋白中的盐分 | GE Healthcare | ||
| MonoQ 柱 | 阴离子交换色谱柱 | GE Healthcare | ||
| S200 柱 | 尺寸排阻色谱柱 | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | 糖脂 | |||
| PE-链霉亲和素 | 用于蛋白偶联 | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
参考文献
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
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