一种在昆虫细胞中生产重组mCD1d蛋白的方法

摘要

一种制备昆虫细胞并用杆状病毒感染以生产重组mCD1d蛋白及生成mCD1d四聚体的方法。

摘要

CD1蛋白构成了一类第三种抗原提呈分子。它们是细胞表面糖蛋白，以分子量约为50 kDa的糖基化重链形式表达，并与β2-微球蛋白非共价结合。这类分子结合脂类而非肽类。尽管其结构证实CD1蛋白与MHC I类和II类抗原提呈分子具有相似性，但小鼠CD1d（mCD1d）的抗原结合槽相对较窄、较深，且高度疏水，具有两个结合口袋，而经典的由MHC编码的抗原提呈分子则具有多个较浅的结合口袋。根据其氨基酸序列，这种疏水性结合槽为脂类抗原的结合提供了理想的环境。

自然杀伤T细胞（NKT细胞）通过其T细胞受体（TCR）识别由CD1d分子结合或呈递的糖脂。对由CD1分子呈递的脂质产生反应的T细胞，已证实参与了对自身免疫性疾病和感染性疾病的防护，以及肿瘤排斥反应。因此，识别、纯化并追踪CD1反应性NKT细胞应答的能力具有重要意义。由α-半乳糖基神经酰胺（a-Galcer）与CD1d构成的四聚体的开发，极大地促进了人们对NKT细胞生物学特性的理解。其他基于不同CD1分子构建的四聚体也已被成功制备，这些新型试剂显著拓展了人们对脂质反应性T细胞功能的认识，在监测脂质疫苗应答、自身免疫性疾病诊断及其他治疗应用中具有潜在价值。

方案

一、解冻细胞

取一管冻存的 TN5 细胞，在 37°C 水浴中解冻。向 25 cm² 组织培养瓶中加入 5 ml 昆虫 Express 培养基（Invitrogen，货号-10486）。注意：Express 培养基不含谷氨酰胺，需向每升培养基中添加 10 ml 100X 谷氨酰胺-青霉素-链霉素混合液或单独的谷氨酰胺。将 TN5 细胞加入培养瓶中，在 27°C 培养箱中孵育 30 分钟。随后，轻轻吸除含 DMSO 的培养基，注意不要扰动贴壁于瓶底的细胞。加入 5 ml 新鲜培养基。

二、细胞的培养与扩增

每天观察细胞生长情况。当培养瓶中细胞融合度接近70%时，通过轻敲培养瓶两侧使细胞脱落悬浮，加入21 ml昆虫表达培养基和5 ml细胞培养物，将细胞转移至175 cm²培养瓶中。每个T175培养瓶的终体积应约为25–30 ml培养基。 根据需要，将融合生长的培养瓶（细胞浓度约为100万个/ml）以1/4或1/5比例传代。切勿让细胞过度生长。记录细胞传代次数。传代次数不得超过30代，以免导致细胞老化并引发细胞裂解。当细胞达到目标体积且浓度为100万个/ml时，进行细胞感染操作。

我通常培养至2到2.5升，这通常相当于七十个175 cm²的培养瓶，每瓶约....

讨论

本实验步骤介绍了如何启动、培养昆虫细胞，以及如何利用这些细胞感染并测定杆状病毒的滴度。该实验最关键的部分在于细胞的维持以及准确测定杆状病毒的滴度。一旦制备出CD1四聚体，便可作为分析糖脂反应性T细胞的有力工具。杆状病毒系统还被广泛用于表达重组蛋白，包括MHC II类分子四聚体，因此本实验方法具有更广泛的适用性。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Express Five SFM	无血清培养基	Invitrogen	10486025
High Five TM	昆虫细胞	Invitrogen	B855-02
Glutamine Pen strep	抗生素	Invitrogen	10378-016
25 cm² TC 培养瓶	塑料培养瓶	Fisher Scientific	10-126-28
175 cm² TC 培养瓶	带塞密封培养瓶	Fisher Scientific	10-126-8
锥形瓶	细胞培养用锥形瓶	Fisher Scientific	07 200 672
YM 30 浓缩器	30,000 分子量截留值（MWCO）	EMD Millipore	UFC 903096
FPLC 设备		GE Healthcare
BrA 酶与缓冲液	生物素化试剂盒	Avidity	BIRA500
Ni-NTA 琼脂糖柱	His标签蛋白纯化柱	GE Healthcare
脱盐柱	用于去除蛋白中的盐分	GE Healthcare
MonoQ 柱	阴离子交换色谱柱	GE Healthcare
S200 柱	尺寸排阻色谱柱	GE Healthcare
alpha-Galcer	糖脂
PE-链霉亲和素	用于蛋白偶联	Molecular Probes, Life Technologies	S-866