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方法文章

用于建立斑马鱼急性肾损伤模型的精确细胞消融方法

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DOI：

10.3791/55606

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2017年6月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, NYITCOM, 2Department of Basic Sciences, NYITCOM-A-State

本文内容

摘要

本研究提出了一种利用肾脏GFP转基因斑马鱼建立的新型体内节段性肾损伤模型。该模型可诱导靶向性肾上皮细胞消融，用于展示肾单位损伤与修复的细胞机制。

摘要

急性肾损伤（AKI）是一种常见的临床病症，具有较高的死亡率。由于肾脏具备一定的自我修复能力，经过支持性治疗后有可能恢复足够的肾功能。然而，为了最大限度地减少细胞死亡并促进再生过程，仍需更深入地理解肾单位细胞在细胞水平上的死亡与修复机制。斑马鱼的前肾是一个理想的模型系统，可用于实现这一目标，因其包含与哺乳动物肾单位结构相似的解剖节段。以往研究鱼类肾脏损伤最常用的模型是药理学诱导的庆大霉素模型。然而，该模型无法实现对损伤时空位置的精确控制，因此难以系统研究肾脏修复过程中涉及的细胞与分子机制。为克服这一局限性，本研究提出一种新方法：与庆大霉素模型不同，该方法可利用紫光激光（405 nm）对特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）的肾单位节段进行光消融。这一新型急性肾损伤模型具备其他上皮损伤方法所不具备的多种优势，其主要优点在于能够 "透析" 损伤程度以及在稳健性中的精确定时空控制 体内 动物模型。这一新方法有望显著提升对肾脏损伤与修复机制的理解水平。

引言

急性肾损伤（AKI）1,2，也可称为急性肾功能衰竭，广义上定义为肾功能的突然受损3。尽管近年来对该疾病的认识已显著提高，但其发病率和死亡率仍居高不下1,2。目前对该疾病的治疗主要为支持性治疗，因为多种药物治疗的临床试验结果均为阴性4,5。肾脏的独特之处在于其具有自我修复的能力。因此，在早期诊断急性肾损伤后进行支持性治疗是降低发病率的最佳方法6。然而，急性肾损伤的早期检测较为困难，需要透析的患者死亡率高达50-80%5。鉴于肾脏具有自我修复能力且目前缺乏有效的治疗方法，开发能够增强肾单位再生过程的方法显得尤为重要。

在急性肾损伤（AKI）研究中，已使用多种不同的模型，包括不同的损伤因子和动物模型。在导致肾脏损伤的因素方面，氨基糖苷类抗生素庆大霉素已被用作一种可引发AKI的肾毒性物质7,8。然而，多个研究团队发现，庆大霉素处理对斑马鱼胚胎具有致死性9。它引起的肾小管损伤过于严重，导致胚胎难以恢复，使得在无任何干预措施的情况下研究肾脏再生变得困难。哺乳动物模型，如小鼠和大鼠，也被认为具有重要研究价值，但在AKI研究中仍面临诸多局限。其中，啮齿类动物模型最主要的一个缺点是难以对肾脏进行可视化观察，从而无法准确确定上皮细胞死亡与修复过程中的时空动态变化。

Johnson 等 报道了一种基于激光消融的技术，用于在胚胎期和幼体期斑马鱼中诱导急性肾损伤9。他们采用脉冲激光消融法，在肌肉注射葡聚糖偶联物后对肾脏进行损伤。葡聚糖偶联物的荧光信号可用于观察肾小管上皮细胞的损伤与再生过程9。该模型克服了上述两个局限性，但无法实现损伤程度的梯度控制，且难以在大范围任意细胞群中实施。

本文所述的基于激光消融的急性肾损伤（AKI）新型斑马鱼模型克服了上述所有局限性。斑马鱼幼体的前肾是一个成熟且具有功能的器官，其结构包含与哺乳动物肾单位相似的区段，包括肾小球、近端小管和远端小管，以及集合管10。斑马鱼幼体还具有光学透明的特性，使得通过荧光技术观察肾脏成为可能。因此，斑马鱼是研究急性肾损伤的宝贵活体（in vivo）模型，其幼体前肾（受精后5–12天）可用于研究肾脏损伤与修复过程中的细胞与分子机制。

本文介绍了一种利用低能量（相较于脉冲激光系统）紫光激光（405 nm）对表达绿色荧光蛋白（GFP）的特定肾单位节段进行光消融的方法。GFP的荧光特性可用于精确定位目标细胞群，通过观察GFP的光漂白现象即可直观地识别所发生的改变。此外，GFP在吸收紫光的过程中可作为能量吸收体，增强对表达GFP的肾细胞的损伤效应。随后可通过延时显微成像技术研究肾脏的修复过程。已有研究发现，细胞增殖、细胞迁移和细胞化生11,12,13均可能是参与肾脏修复的重要生物学过程。然而，由于现有急性肾损伤（AKI）模型的局限性，这些过程的相对重要性及其相互作用的详细机制尚不明确。利用本项创新性方法，研究人员得以证实细胞迁移在急性肾损伤后的修复过程中发挥着核心作用14。

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方案

本研究严格遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。实验方案经纽约理工学院骨科医学院机构动物护理与使用委员会（NYITCOM IACUC）批准。所有手术及 体内 实验在三卡因麻醉下进行，且所有努力均旨在尽量减少动物痛苦。

1. 胚胎的获取与维持

  1. 通过交配肾脏表达GFP荧光的斑马鱼获得胚胎。
    注：荧光标记的斑马鱼转基因品系示例见表1。
  2. 将胚胎置于E3溶液中，在28.5 °C条件下培养至受精后24小时。
  3. 24小时后，更换为含有0.003% 1-苯基-2-硫脲（PTU）的E3溶液。
    注：PTU可阻断黑色素生成过程中依赖酪氨酸酶的步骤，从而抑制色素形成。此处该溶液简称为E3-PTU。
  4. 在28.5 °C条件下继续培养受精胚胎，直至其发育超过6天（>6 dpf），此时肾脏已发育成熟。
    注：建议使用7–9 dpf阶段的幼鱼。
  5. 在40倍放大条件下，使用配备绿色荧光发射滤光片的荧光体视显微镜，筛选肾脏GFP荧光强烈的幼鱼。

2. 活体成像用斑马鱼的制备

  1. 若在3 dpf之前对胚胎进行光消融，需在将斑马鱼固定用于成像前，移除未孵化斑马鱼的卵膜。
    1. 使用镊子手动去膜（推荐）或使用蛋白酶混合液进行化学处理。
      注：去膜可获得最佳成像效果。
  2. 使用E3-PTU溶液冲洗培养皿中的卵膜碎片，并重新加满E3-PTU溶液。
  3. 准备含0.2 mg/mL三卡因溶液的1-2%低熔点（LMP）琼脂糖，用于固定斑马鱼以进行肾脏光消融和活体成像。
    1. 若LMP琼脂糖已预先配制，可在微波炉中重新加热融化。
  4. 琼脂糖制备完成后，将一个35 mm塑料培养皿置于解剖显微镜下。在附近放置一根拉制的玻璃探针，以便正确调整麻醉后幼鱼的方向。
    注：此步骤需及时完成并确保所有物品就位，因为必须在琼脂糖约1-3分钟内凝固前完成胚胎的定位。
  5. 在将胚胎转移至琼脂糖前，确保琼脂糖已冷却（即 接近体温）。使用塑料或玻璃移液管将胚胎放入已冷却的熔融琼脂糖-三卡因溶液中。
    注：此操作的原因是过热的琼脂糖可能对胚胎有害，导致心脏骤停或死亡。
  6. 使用移液管重新吸取含胚胎的琼脂糖溶液，并将胚胎/幼鱼置于35 mm培养皿中央。
  7. 迅速将含有胚胎/幼鱼的琼脂糖均匀铺展至35 mm培养皿底部；最佳用量约为1-1.1 mL。
  8. 使用玻璃探针将胚胎调整至最适合光消融和成像的位置。
    注：视频1展示了单侧光消融时胚胎/幼鱼的最佳方位。此步骤时间最为敏感，必须在琼脂糖开始凝胶化前迅速完成，因为一旦凝胶开始形成，再调整鱼体位置将造成不利影响。
    1. 调整幼鱼方向，使目标肾脏节段垂直于光束路径，而对侧节段远离激光束（见视频1）。
      注：可通过如视频1所示方式旋转幼鱼实现该位置。
  9. 静置约15分钟，使琼脂糖完全凝固。覆盖培养皿以减少蒸发。琼脂糖凝固后，胚胎或幼鱼即可进行光消融。

3. 激光消融

  1. 操作共聚焦成像系统。
    注意：使用所引用的成像平台（见材料表）时，推荐设置包括 40X 放大倍数、0.8 NA 的水浸物镜，并将第一块二向色镜设置为允许 488 & 405 nm 光同时照射样品。检测应在绿色通道进行。
  2. 将含有固定斑马鱼的培养皿放置在共聚焦显微镜的载物台上。
    注意：该程序针对直立式显微镜配置并使用 40–60X 水浸物镜进行了优化。然而，也可对程序进行适当修改以适用于倒置显微镜。
  3. 在直立式配置中，将含有胚胎的培养皿置于载玻片上，并使用模型黏土（例如，油泥）固定其位置。将带有培养皿的载玻片放置在共聚焦显微镜的载物台上。
  4. 加入 3 mL 成像溶液 E3-PTU（见步骤 1.3），其中含 0.2 mg/mL 三卡因。
    注意：成像溶液也可在将载玻片放置于载物台前立即加入。添加成像溶液时应格外小心，防止琼脂糖从培养皿底部漂起。
  5. 切换至水浸物镜（40 或 60X）。缓慢升高载物台，确保物镜略微倾斜，以避免光路中产生气泡。当物镜以一定角度接触溶液后，将其居中，使其位于胚胎视野范围内。
  6. 使用荧光光源找到目标节段。将拟损伤的分支调整至浅表位置，以最小化光散射（见 视频 1）。
    注意：后续步骤使用所引用的软件（见材料表），但该程序可轻松适配其他平台。
  7. 打开软件。依次导航至 "View"| "Acquisition Control"| "C2plus Compact GUI"，并将 "pixel dwell time" 设置为 "1.9 µs," "frame size" 设置为 "512 x 512 pixels," 以及 "pinhole size" 设置为 "90 µm." 将 "405 nm（或某些系统中的 408 nm）激光强度" 设为零，将 "488 激光强度" 设为 "low"（优选 <1%）。调节 "gain" 以获得良好的动态范围，但避免信号饱和。
    注意：这些数值并非关键，仅用于保持一致性。当使用 405 nm 激光时，会导致 GFP 荧光增强。为避免在光漂白过程中（步骤 3.11）信号饱和，应降低绿色通道的信号增益值。蓝色通道增益可保持为零，因其不用于采样。
  8. 在软件界面中点击 "Scan"，使用 488 nm 激光扫描肾脏。找到垂直于光路且 GFP 荧光清晰可见的目标节段。确定该区域后，使用椭圆形感兴趣区域（ROI）绘制感兴趣区域。
    1. 依次导航至 "ROI" | "Draw Elliptic ROI."
      注意：该区域将用于在光漂白过程中持续测量平均 GFP 强度，从而实现精确的激光处理剂量控制。
  9. 依次导航至 "View" | "Acquisition controls"| "C2plus Scan Area"，并选择 "Band Scan Area." 矩形掩膜将出现在该界面中。使用光标手动定义一个矩形扫描窗口（即 拖动、调整大小并旋转掩膜），以覆盖拟进行激光消融的节段。在掩膜区域内右键单击以确认选择。
    注意：仅所选区域将被扫描。
  10. 开始时间测量，同时仅使用 488 nm 激光监测绿色通道以激活 GFP。确保 488 nm 激光强度相对较低（约 1%）。通过选择 "Measure" | "Time Measurement." 来测量感兴趣区域内 GFP 的平均强度。使用 "Graph" 或 "Data" 选项卡监测 ROI 内的平均强度值。
    注意：采集速率由像素驻留时间及步骤 3.9 中设定的矩形窗口大小决定，通常允许快速监测信号（约 2–10 帧/秒）。
  11. 通过将 "laser power" 控件完全向右滑动，将紫光激光（405 nm）强度增至 100%，以诱导肾细胞损伤。若 488 nm 激光强度较低，可保持其开启状态。
    1. 使用 "Graph" 选项卡观察曲线图，或使用 "Data" 选项卡查看 GFP 强度的数值，并等待其降至目标水平（例如基线值的 50%，如 图 1 所示）。
      注意：所引用的激光装置（见 材料表）中使用了 20 mW 激光；最大强度可能因系统而异。较低的强度可通过延长曝光时间来补偿（即 以 GFP 漂白百分比作为总曝光量的衡量指标）。
  12. 一旦椭圆形 ROI（步骤 3.8）内的 GFP 强度降至目标水平，立即通过将软件控制面板中的 "laser power" 滑块完全向左滑动，将紫光（405 nm）激光强度降至 "0"。
    1. 获取新的 GFP 荧光基线。通过计算 X/Y 比值确认消融效果。
      注意：见 图 1B；Y = 消融前的平均强度，X = 消融后的平均强度，使用 ROI 内连续 4 个样本的平均值。确切的目标比值（50%、60%、等）取决于特定实验所需的损伤程度。

4. 使用碘化丙啶染色进行活细胞成像

  1. 应用一般时间序列成像的注意事项（如先前研究中所述15），以可视化碘化丙啶染色，作为光消融后肾细胞损伤的关联指标。
  2. 在包埋和光消融前，将幼鱼预先孵育于含30 µM碘化丙啶的溶液（1% DMSO溶于E3-PTU）中3小时，具体操作分别如步骤2和3.7所述。
    注意：琼脂糖或成像溶液中无需额外添加碘化丙啶。
  3. 诱导节段性肾损伤，操作如步骤3.1–3.12所述。
  4. 获取时间序列图像堆栈，具体方法如先前研究中所述14，使用488 nm激光（GFP）和461 nm激光（碘化丙啶，PI）。
    注意：在共聚焦图像堆栈中，将两种荧光信号叠加，以关联GFP信号的消失与碘化丙啶染色的出现。
  5. 设置获取时间序列图像堆栈的参数如下：虚拟切片厚度 = 4 µm，z轴堆栈间隔 = 2 µm，像素驻留时间 = 1.9 µs，图像尺寸 = 512 × 512，平均扫描次数 = 2。
    注意：这些参数可实现对最多4条幼鱼进行持续、每10  至15分钟一次的记录，并确保样品的光漂白程度最小。
  6. 使用与记录文件格式兼容的成像软件来可视化和分析数据。

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结果

请注意，本实验方案已成功应用于多种肾脏GFP转基因品系，包括ET(krt8:EGFP)sqet11-9、ET(krt8:EGFP)sqet33-d10和Tg(atp1a1a.4:GFP)。此处展示的示例结果使用的是ET(krt8:EGFP)sqet11-9品系。

图1展示了光消融实验的示例方案。在感兴趣区域内部监测平均GFP荧光强度（图1A和视频1）。图1B显示了一条典型的平均强度变化曲线。

如图2所示，在暴露于405 nm激光照射后，GFP荧光逐个细胞逐渐消失，...

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讨论

需要注意的是，不同系统的总激光功率存在差异。然而，通过使用GFP荧光漂白百分比作为指标，可以反映荧光肾脏所接收的总能量，从而消除激光功率差异的影响，并通过调整曝光时间进行补偿。但需注意，不同组织对此类光消融方法的反应存在差异。即使在肾脏发育过程中，与成熟幼虫相比，在较年轻的胚胎中实现50%的GFP荧光降低也明显更为困难。在修改和调整本实验方案以适用于不同应用场景时，应充分考虑组织对光消融反应性的这些差异。因此，监测GFP荧光降低的百分比对于准确评估损伤程度以及预测受损肾上皮的反应至关重要。

与斑马鱼肾损伤的其他方法相比，该方法的主要优势在于能够精确控制损伤发生的时间和空间位置。此外，研究人员可以灵活调节损伤程度的高低。这种对损伤量的控制能力有助于研究上皮细胞的反应，并有助于判断细胞是走向修复、凋亡还是坏死。例如，可以证明细胞迁移是存活上皮组织对节段性消融的初始反应，而细胞增殖是一个继发过程，可能由细胞迁移产生的机械力所驱动14。

除了能够在细胞水平上研究修复过程外，该方法还具有其...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢 Iain Drummond 博士和 Vladimir Korzh 博士分享肾脏 GFP 转基因品系。我们还要感谢 NYITCOM 为开展本项工作提供了必要的资源。本研究部分得到了以下资助：K08DK082782、R03DK097443（NIH）以及 HSCI 先导资助（AV）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养皿，35 × 10 mmGenesee Scientific32-103操作步骤用途：步骤 2.4、2.7
培养皿，100 × 15 mmMidwest Scientific910操作步骤用途：步骤 1
去膜镊子 - 电子显微镜科学公司 Dumont 镊子 5 型 DumostarFischer Scientific50-241-57操作步骤用途：步骤 2.1.1
塑料移液管Globe Scientific135030操作步骤用途：步骤 2.5、3.6
TricaineSigma AldrichA5040-25G操作步骤用途：步骤 2.3、3.4
琼脂糖Fischer ScientificBP165-25操作步骤用途：步骤 2.3
拉制玻璃探针（由玻璃毛细管手工制备）Fischer Scientific21-1640-2C操作步骤用途：步骤 2.4
体视显微镜NikonSMZ1270操作步骤用途：步骤 1.5
SOLA 光源引擎LumencorSOLA SM-5-LCR-SB操作步骤用途：步骤 1.5
Eclipse C2 Plus 共聚焦显微镜系统Nikon操作步骤用途：步骤 3
1× E3 溶液配方组成：5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4；操作步骤用途：1.2、1.3、2.2、2.3
PTUSigmaP7629-10G操作步骤用途：1.3、2.2、3.4、4.2
NIS Elements 软件NikonC2+操作步骤用途：步骤 3
激光单元AgilentMLC 400操作步骤 3.11
碘化丙啶（PI）Sigma AldrichP4170-100MG操作步骤用途：4.2

参考文献

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