用于建立斑马鱼急性肾损伤模型的精确细胞消融方法

摘要

本研究提出了一种利用肾脏GFP转基因斑马鱼建立的新型体内节段性肾损伤模型。该模型可诱导靶向性肾上皮细胞消融，用于展示肾单位损伤与修复的细胞机制。

摘要

急性肾损伤（AKI）是一种常见的临床病症，具有较高的死亡率。由于肾脏具备一定的自我修复能力，经过支持性治疗后有可能恢复足够的肾功能。然而，为了最大限度地减少细胞死亡并促进再生过程，仍需更深入地理解肾单位细胞在细胞水平上的死亡与修复机制。斑马鱼的前肾是一个理想的模型系统，可用于实现这一目标，因其包含与哺乳动物肾单位结构相似的解剖节段。以往研究鱼类肾脏损伤最常用的模型是药理学诱导的庆大霉素模型。然而，该模型无法实现对损伤时空位置的精确控制，因此难以系统研究肾脏修复过程中涉及的细胞与分子机制。为克服这一局限性，本研究提出一种新方法：与庆大霉素模型不同，该方法可利用紫光激光（405 nm）对特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）的肾单位节段进行光消融。这一新型急性肾损伤模型具备其他上皮损伤方法所不具备的多种优势，其主要优点在于能够 "透析" 损伤程度以及在稳健性中的精确定时空控制 体内 动物模型。这一新方法有望显著提升对肾脏损伤与修复机制的理解水平。

引言

急性肾损伤（AKI）^1,2，也可称为急性肾功能衰竭，广义上定义为肾功能的突然受损³。尽管近年来对该疾病的认识已显著提高，但其发病率和死亡率仍居高不下^1,2。目前对该疾病的治疗主要为支持性治疗，因为多种药物治疗的临床试验结果均为阴性^4,5。肾脏的独特之处在于其具有自我修复的能力。因此，在早期诊断急性肾损伤后进行支持性治疗是降低发病率的最佳方法⁶。然而，急性肾损伤的早期检测较为困难，需要透析的患者死亡率高达50-80%⁵。鉴于肾脏具有自我修复能力且目前缺乏有效的治疗方法，开发能够增强肾单位再生过程的方法显得尤为重要。

在急性肾损伤（AKI）研究中，已使用多种不同的模型，包括不同的损伤因子和动物模型。在导致肾脏损伤的因素方面，氨基糖苷类抗生素庆大霉素已被用作一种可引发AKI的肾毒性物质^7,....

方案

本研究严格遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。实验方案经纽约理工学院骨科医学院机构动物护理与使用委员会（NYITCOM IACUC）批准。所有手术及 体内 实验在三卡因麻醉下进行，且所有努力均旨在尽量减少动物痛苦。

1. 胚胎的获取与维持

1. 通过交配肾脏表达GFP荧光的斑马鱼获得胚胎。
   注：荧光标记的斑马鱼转基因品系示例见表1。
2. 将胚胎置于E3溶液中，在28.5 °C条件下培养至受精后24小时。
3. 24小时后，更换为含有0.003% 1-苯基-2-硫脲（PTU）的E3溶液。
   注：PTU可阻断黑色素生成过程中依赖酪氨酸酶的步骤，从而抑制色素形成。此处该溶液简称为E3-PTU。
4. 在28.5 °C条件下继续培养受精胚胎，直至其发育超过6天（>6 dpf），此时肾脏已发育成熟。
   注：建议使用7–9 dpf阶段的幼鱼。
5. 在40倍放大条件下，使用配备绿色荧光发射滤光片的荧光体视显微镜，筛选肾脏GFP荧光强烈的幼鱼。

2. 活体成像用斑马鱼的制备

1. 若在3 dpf之前对胚胎进行光消融，需在将斑马鱼固....

结果

请注意，本实验方案已成功应用于多种肾脏GFP转基因品系，包括ET(krt8:EGFP)sqet11-9、ET(krt8:EGFP)sqet33-d10和Tg(atp1a1a.4:GFP)。此处展示的示例结果使用的是ET(krt8:EGFP)sqet11-9品系。

图1展示了光消融实验的示例方案。在感兴趣区域内部监测平均GFP荧光强度（图1A和视频1）。图1B显示了一条典型的平均强度变化曲线。

如图2所示，在暴露于405 nm激光照射后，GFP荧光逐个细胞逐渐消失，.......

讨论

需要注意的是，不同系统的总激光功率存在差异。然而，通过使用GFP荧光漂白百分比作为指标，可以反映荧光肾脏所接收的总能量，从而消除激光功率差异的影响，并通过调整曝光时间进行补偿。但需注意，不同组织对此类光消融方法的反应存在差异。即使在肾脏发育过程中，与成熟幼虫相比，在较年轻的胚胎中实现50%的GFP荧光降低也明显更为困难。在修改和调整本实验方案以适用于不同应用场景时，应充分考虑组织对光消融反应性的这些差异。因此，监测GFP荧光降低的百分比对于准确评估损伤程度以及预测受损肾上皮的反应至关重要。

与斑马鱼肾损伤的其他方法相比，该方法的主要优势在于能够精确控制损伤发生的时间和空间位置。此外，研究人员可以灵活调节损伤程度的高低。这种对损伤量的控制能力有助于研究上皮细胞的反应，并有助于判断细胞是走向修复、凋亡还是坏死。例如，可以证明细胞迁移是存活上皮组织对节段性消融的初始反应，而细胞增殖是一个继发过程，可能由细胞迁移产生的机械力所驱动¹⁴。

除了能够在细胞水平上研究修复过程外，该方法还具有其.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养皿，35 × 10 mm	Genesee Scientific	32-103	操作步骤用途：步骤 2.4、2.7
培养皿，100 × 15 mm	Midwest Scientific	910	操作步骤用途：步骤 1
去膜镊子 - 电子显微镜科学公司 Dumont 镊子 5 型 Dumostar	Fischer Scientific	50-241-57	操作步骤用途：步骤 2.1.1
塑料移液管	Globe Scientific	135030	操作步骤用途：步骤 2.5、3.6
Tricaine	Sigma Aldrich	A5040-25G	操作步骤用途：步骤 2.3、3.4
琼脂糖	Fischer Scientific	BP165-25	操作步骤用途：步骤 2.3
拉制玻璃探针（由玻璃毛细管手工制备）	Fischer Scientific	21-1640-2C	操作步骤用途：步骤 2.4
体视显微镜	Nikon	SMZ1270	操作步骤用途：步骤 1.5
SOLA 光源引擎	Lumencor	SOLA SM-5-LCR-SB	操作步骤用途：步骤 1.5
Eclipse C2 Plus 共聚焦显微镜系统	Nikon		操作步骤用途：步骤 3
1× E3 溶液			配方组成：5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4；操作步骤用途：1.2、1.3、2.2、2.3
PTU	Sigma	P7629-10G	操作步骤用途：1.3、2.2、3.4、4.2
NIS Elements 软件	Nikon	C2+	操作步骤用途：步骤 3
激光单元	Agilent	MLC 400	操作步骤 3.11
碘化丙啶（PI）	Sigma Aldrich	P4170-100MG	操作步骤用途：4.2