高分辨率成像与分析酿酒酵母中单个星体微管的动力学行为

摘要

芽殖酵母是研究微管动态的有利模型 体内 由于其强大的遗传学特性和微管细胞骨架的简单性。以下实验方案描述了如何转化和培养酵母细胞，获取共聚焦显微镜图像，以及在活体酵母细胞中对微管动态进行定量分析。

摘要

动态微管对许多细胞过程至关重要，准确测量微管动力学可揭示细胞如何调控这些过程，以及基因突变如何影响这种调控。在后生动物模型中对微管动力学进行定量分析面临诸多挑战，包括微管密度高以及遗传操作受限。相比之下，芽殖酵母模型具有克服这些挑战的优势。本实验方案描述了一种在活酵母细胞中测量单个微管动力学的方法。表达荧光标记微管蛋白的细胞被固定在组装好的载玻片腔室中，从而实现稳定的时程成像。本文还提供了高速四维成像的详细操作指南，以及在共聚焦图像序列中定量分析动态微管特性的实验流程。该方法结合传统的酵母遗传学手段，特别适用于对微管调控因子或改变微管蛋白亚基活性的突变体进行定量评估。

引言

微管是由αβ-微管蛋白亚基组成的细胞骨架多聚体，在多种细胞过程中发挥重要作用，包括细胞内运输、细胞分裂、形态发生和细胞运动。为了构建适用于这些不同功能的微管网络，细胞必须精确调控微管形成的位置和时间。这种调控通过控制αβ-微管蛋白亚基组装成微管多聚体，或将微管解聚为游离亚基的反应来实现；这一过程被称为微管动力学。

微管研究领域的一个主要目标是阐明调控微管动态的分子机制，包括对αβ-微管蛋白亚基以及结合微管蛋白和/或微管的外源性调节因子的研究。一种成熟的实验方法是重建该系统 体外 使用纯化的αβ-微管蛋白，通常与纯化的外源性调节因子联合使用。尽管这是一种有效的研究方法，但重建系统中的微管动态与活细胞中观察到的动态存在显著差异。例如，微管的生长速度更快，而缩短速度更慢 体内 比 体外这些差异可能归因于已知的外源性调控因子的可获得性¹以及细胞中尚未明确的因素。因此，在天然的细胞环境中确定微管调节因子及其破坏微管动态的突变体活性至关重要。

尽管后生动物模型已被证明是研究微管功能和高级结构的主要体系，但一些实际问题严重限制了这些模型在精确测量微管动态方面的应用。首先，每个细胞中微管数量众多，从几十到数千不等，这使得长时间可靠追踪单个微管变得困难。许多研究通过成像特异性定位于微管末端的蛋白质（例如末端结合蛋白（EB）家族成员）来应对....

方案

1. 准备-LEU缺陷型平板

1. 向一个2 L的烧瓶中加入800 mL无菌去离子水（DiH₂O）。加入26.71 g dropout基础培养基（DOB）粉末、0.69 g CSM-Leu和20 g琼脂。用磁力搅拌子混匀，再用DiH₂O定容至1 L。
2. 在121 °C、19 psi条件下高压灭菌30分钟。
3. 将烧瓶从高压灭菌器中取出，在轻轻搅拌下冷却至约65 °C。
4. 将培养基以每皿30 mL分装至直径100 mm的培养皿中。室温静置36–48小时后，于4 °C保存。

2. 整合GFP-Tub1以实现GFP标记微管蛋白的组成型表达

1. 将单链DNA（ssDNA）储备液（浓度为10 mg/mL）煮沸3分钟。
2. 取2 µL煮沸后的ssDNA与400 ng纯化的GFP-Tub1质粒DNA混合¹¹。
   注意：有多种质粒可用于酵母中微管的稳定荧光标记，这些质粒使用不同的荧光蛋白和可筛选标记。部分替代方案在讨论部分有所描述。
3. 将DNA混合物加入50 µL感受态酵母细胞中。
   注意：使用山梨醇溶液（SORB；100 mM LiOAc、10 mM Tris-HCl pH 8、1 mM EDTA pH 8和1 M山梨醇，用稀乙酸调节至pH....

结果

在活体酵母细胞中测量微管动态为评估编码微管调节因子或微管蛋白亚基的基因突变如何影响聚合与解聚速率以及两者状态间转换频率提供了有力的工具。图1展示了一个野生型细胞和一个β-微管蛋白突变（tub2-430Δ）细胞中星体微管动态的时间序列。微管通过GFP标记的α-微管蛋白进行标记以观察微管长度。红色箭头标示了每幅图像中星体微管的长度（图1A和1C）。在8分钟内对每个时间点的微管长度进行测量，这些汇总的长度以寿命图形式呈现（图1B和1D）。这些数据用于确定聚合速率、解聚速率、聚合持续时间、解聚持续时间、恢复频率、灾变频率以及动态性。

讨论

芽殖酵母模型在获取微管动力学高分辨率测量数据方面具有显著优势 体内 包括随时间成像单个微管的能力，以及利用酵母遗传学工具操纵微管蛋白和微管调节因子的能力。

与先前描述的装置（包括熔融琼脂垫）相比，刀豆蛋白A包被的培养室具有多项优势。带有培养室的载玻片可预先制备并长期保存，也可立即使用。此外，刀豆蛋白A包被的培养室能够在细胞最初培养的相同培养基中持续培养酵母细胞超过>6小时。需要注意的是，培养室内的细胞数量将决定该培养室可进行成像的时间长短。包被后的培养室可确保仅有一层酵母细胞黏附于盖玻片表面。最后，通过制备多个培养室，可在同一载玻片上对多种不同的酵母菌株进行成像。

在芽殖酵母中对微管动态进行成像存在诸多挑战，包括信号水平相对较低以及该过程的高度动态性。宽场显微镜适用于捕获标记微管的单时间点图像。然而，由于曝光时间较长以及样品受到非焦平面光线的持续照射，宽场显微镜会导致更快的光漂白。同样，激光扫描共聚焦显微镜也因光漂白速度较快而不适用。旋转盘共聚焦显微镜则特别适合用于芽殖酵母中微管动态的成像。本研究所采.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DOB（缺失碱基）	Sunrise science	1650
CSM-Leu	Sunrise science	1005
琼脂	Ameresco	N833
100 mm 聚苯乙烯培养皿	Fisher Scientific	FB0875713
单链DNA（鲑鱼精子） 溶于无菌DiH2O	Sigma-Aldrich	D7656	用DiH2O配制成10 mg/mL溶液，分装后于-20 ºC保存
合成完全培养基	Sunrise science	1459-100
刀豆蛋白A	Sigma-Aldrich	L7647	用DiH2O配制成2 mg/mL溶液，分装后于-20 ºC保存
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-544-1
显微镜盖玻片	Fisher Scientific	12-541-B
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	石蜡膜
VALAP（等量凡士林、羊毛脂和石蜡混合物）			使用前于75 ºC熔化
镊子	Fisher Scientific	16-100-106
聚乙二醇（PEG）3350	Sigma-Aldrich	202444
名称	公司	目录编号	备注
显微镜
Ti E 倒置完美聚焦显微镜	Nikon Instruments	MEA53100
1.45 数值孔径 100X CFI Plan Apo 物镜	Nikon Instruments	MRD01905
压电载物台	Physik Instrumente	P-736
转盘扫描器	Yokogawa	CSU10
激光组合模块	Agilent Technologies	MCL400B
EMCCD相机	Andor Technology	iXon Ultra 897
名称	公司	目录编号	备注
软件
NIS Elements 软件	Nikon Instruments	MQS31100
Microsoft Excel 软件	Microsoft
MATLAB 软件	MathWorks, Inc
ImageJ64	NIH		Rasband, W.S., ImageJ, 美国国立卫生研究院（NIH），马里兰州贝塞斯达，美国，http://imagej.nih.gov/ij/，1997-2016。
Bio-Formats 导入插件	Open Microscopy Environment
名称	公司	目录编号	备注
质粒
pUC19-LEU2::GFP-TUB1		pSK1050	参考文献：Song, S. 和 Lee, K. S. 酿酒酵母CDC5在胞质分裂中的新功能。J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)