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方法文章

一种全芯片式快速中性粒细胞趋化分析方法：直接从一滴血样中完成检测

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DOI：

10.3791/55615

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2017年6月23日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, 2University of Science and Technology of China, 3Department of Physics and Astronomy, University of Manitoba, 4Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, 5Seven Oaks General Hospital, 6Department of Immunology, University of Manitoba, 7Department of Biological Sciences, University of Manitoba

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文详细介绍了通过在单个微流控芯片上整合全血中性粒细胞分离和趋化实验，进行快速中性粒细胞趋化功能检测的方法。

摘要

中性粒细胞的迁移和趋化作用对机体免疫系统至关重要。由于微流控装置具有实时可视化、精确控制化学浓度梯度生成以及减少试剂和样品消耗等优势，其在研究中性粒细胞迁移与趋化方面的应用日益广泛。近年来，微流控领域的研究人员正不断努力开发可直接从全血出发、集成化且操作简便的微流控趋化分析系统。在此方向上，首个全芯片集成方法已被建立，用于从小体积血液样本中同步实现中性粒细胞的磁性阴性纯化及趋化实验。该新方法可在25分钟内完成从样本到结果的快速中性粒细胞趋化性检测。本文详细介绍了该全芯片趋化实验的构建方法、操作流程与数据分析方法，并讨论了故障排除策略、局限性及未来发展方向。文中展示了利用该全芯片方法检测确定性趋化因子N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）以及慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者痰液样本的代表性趋化实验结果。该方法适用于多种与细胞迁移相关的研究及临床应用。

引言

趋化性是指细胞向可溶性化学浓度梯度定向迁移的过程，在多种生物学过程中发挥关键作用，包括免疫反应1,2,3、组织发育4以及癌症转移5。中性粒细胞是最丰富的白细胞亚群，在机体固有免疫防御功能中起核心作用，同时也参与调节适应性免疫应答6,7。中性粒细胞具备高度调控的趋化机制，使其能够通过趋化性响应病原体来源的趋化因子（例如 fMLP）和宿主来源的趋化因子（例如 白细胞介素-8）8。中性粒细胞的迁移与趋化性参与调控多种生理问题及疾病过程，如炎症和癌症1,9。因此，对中性粒细胞趋化性的准确评估为研究中性粒细胞生物学及其相关疾病提供了重要的功能读出指标。

与广泛使用的传统趋化性检测方法（例如 transwell 检测10）相比，微流控装置由于能够精确控制化学梯度的生成并实现小型化，在细胞迁移和趋化性的定量评估方面展现出巨大潜力11,12,13。在过去的二十年左右，已开发出多种微流控装置用于研究不同类型生物细胞的趋化性，尤其是中性粒细胞11。研究人员投入大量精力，利用微流控装置构建时空上复杂的化学梯度，以表征中性粒细胞的迁移行为14,15。此外，还发展出一些新颖的策略，利用微流控装置研究中性粒细胞的方向性决策过程16。除了面向生物学的基础研究外，微流控装置的应用已拓展至临床样本检测，用于疾病评估17,18,19。然而，许多微流控装置目前仅限于专业研究实验室使用，且需要从大量血液样本中耗时较长地分离中性粒细胞。因此，近年来逐渐兴起了一类新型集成式微流控装置，可直接从小滴全血中快速进行中性粒细胞趋化性分析20,21,22,23,24。

为此，开发了一种全芯片集成方法，将磁性阴性中性粒细胞纯化及后续趋化实验整合在单一微流控装置上25。该全芯片方法具有以下新颖特性：1）与以往基于细胞黏附捕获或基于细胞大小过滤从血液中分离中性粒细胞的芯片内策略20,22不同，该新方法可在小体积全血中实现高纯度的芯片内磁性分离中性粒细胞，并可在趋化因子刺激下进行趋化性检测；2）细胞停靠结构有助于将中性粒细胞的初始位置对齐至化学梯度通道附近，从而无需单细胞追踪即可实现简便的趋化性分析；3）将中性粒细胞分离与趋化实验集成于单一微流控装置，使得在实验步骤无中断的情况下，可在25分钟内完成从样本到结果的快速趋化性分析。

本文提供了该全芯片趋化实验的构建、操作及数据分析方法的详细方案。通过测试已知的重组趋化因子以及来自患者的复杂趋化样本，本文展示了所开发方法在中性粒细胞趋化实验中的有效应用，并进一步讨论了故障排除策略、方法局限性及未来发展方向。

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方案

所有人类样本采集方案均经曼尼托巴大学温尼伯校区联合研究伦理委员会批准。

1. 微流控装置的制备（图1A）

  1. 设计并打印透明掩膜。
    1. 按照先前所述详细设计器件25。参见图1A。
      注：该器件包含两层。第一层（高4 µm）定义用于捕获细胞的细胞停靠屏障通道，使细胞位于梯度通道旁。第二层（高60 µm）定义梯度生成通道、细胞加载的端口和通道、化学试剂入口储液池以及废液出口。两层均设计有对准标记。对于第二层，上游蛇形输入通道的长度和宽度分别为60 mm和200 µm；下游蛇形输入通道的长度和宽度分别为6 mm和280 µm。
    2. 使用高分辨率打印机将第一层和第二层的图形打印至透明掩膜上。
      注：打印分辨率取决于设计中的最小特征尺寸。在当前设计中，最小特征尺寸为10 µm，选择的分辨率为32,000 dpi。
  2. 清洗硅片。
    1. 将一片3英寸硅片放入等离子清洗机中，抽真空3分钟。
    2. 开启等离子电源，将功率调至高（HIGH）档，使用氧气等离子体处理硅片30分钟。
    3. 关闭等离子清洗机，取出硅片；硅片现已准备好用于制作器件模具。
  3. 在洁净室设施中通过光刻工艺制作第一层。
    注：具体制作参数可能因制作设施而异。
    1. 在玻璃烧杯中将10 mL SU-8 2025与10 mL SU-8 2000混合，配制所需光刻胶。将混合液置于通风橱中静置10分钟，直至气泡完全消失。
    2. 小心地将已清洗的硅片放置于匀胶机上合适的卡盘中，并抽真空以固定硅片。
    3. 小心地将3 mL光刻胶混合液倒入硅片中心，先以500 rpm转速旋转5秒，再以3,000 rpm转速旋转30秒，最终在硅片上形成厚度为4 µm的光刻胶涂层。
    4. 小心地从匀胶机上取下硅片，并在热板上于95 °C烘烤4分钟。
    5. 小心地将硅片放置于掩膜对准器上，设定紫外光曝光时间为6秒。使用胶带将第一层的透明掩膜固定在透明玻璃板上。
    6. 轻柔地将附有掩膜的玻璃板放置于对准器上，对齐掩膜与硅片。用紫外光照射硅片，以形成细胞停靠结构图案。
    7. 小心地取下玻璃板并取出已曝光的硅片，在热板上于95 °C再次烘烤4分钟。
    8. 将硅片转移至通风橱，放入盛有SU-8显影液的玻璃盘中，轻轻摇晃30秒。
    9. 在通风橱内用新鲜的SU-8显影液清洗硅片，随后用异丙醇（IPA）冲洗。在通风橱内用氮气吹干硅片；第一层制作完成。
  4. 在第一层基础上制作第二层。
    1. 使用胶带覆盖第一层上的对准标记。小心地将带有第一层的硅片放置于匀胶机的真空卡盘上，并抽真空以固定硅片。
    2. 在硅片上倒入3 mL SU-8 2025光刻胶，先以500 rpm转速旋转5秒，再以2000 rpm转速旋转30秒，最终在硅片上形成厚度为60 µm的光刻胶涂层。
    3. 小心地从匀胶机上取下硅片并转移至热板，在65 °C下烘烤2分钟。
    4. 轻轻撕去胶带，暴露出第一层的对准标记。将硅片置于热板上，在95 °C下烘烤6分钟。
    5. 小心地将硅片放置于掩膜对准器上，设定紫外光曝光时间为18秒。
    6. 使用胶带将第二层的透明掩膜固定在透明玻璃板上。
    7. 小心地将附有掩膜的玻璃板放置于对准器上，利用对准器的显微镜通过交叉对准标记，将掩膜与硅片上的第一层对齐。
    8. 用紫外光照射涂有光刻胶的硅片，以形成细胞加载通道和梯度通道的图案。
    9. 小心地取下玻璃板并取出硅片，在65 °C热板上烘烤2分钟，然后转移至另一块95 °C热板上继续烘烤6分钟。
    10. 将硅片转移至通风橱，放入盛有SU-8显影液的玻璃盘中，轻轻摇晃6分钟。
    11. 在通风橱内用新鲜的SU-8显影液清洗硅片，随后用异丙醇（IPA）冲洗。
    12. 在通风橱内用氮气吹干硅片。将硅片置于热板上，在150 °C下硬烘30分钟；第二层制作完成。
  5. 母模表面修饰。
    注：对SU-8模具进行硅烷化表面修饰，以利于在软光刻过程中聚二甲基硅氧烷（PDMS）从模具中脱模。
    1. 用移液枪吸取10 µL十三氟-1,1,2,2-四氢辛基（三氯硅烷）溶液，滴入一个15 mL塑料管的管尖内，并略微松开管盖。
    2. 将该塑料管和带有SU-8图案的硅片一同放入干燥器中，抽真空1小时；此时模具已准备好用于制作PDMS器件。
  6. 制作PDMS器件。
    1. 在塑料烧杯中将40 g PDMS基体与4 g固化剂混合，配制成PDMS溶液。将制备好的SU-8母模放入培养皿中，小心地将44 g PDMS溶液倒入模具上。
    2. 将培养皿放入干燥器中抽真空20分钟以去除气泡，然后放入烘箱中于80 °C固化2小时。
    3. 固化完成后，取出培养皿并置于洁净台面上。小心地切割并剥离PDMS块体与SU-8模具。
    4. 使用直径为3 mm的打孔器打出细胞加载口。使用直径为6 mm的打孔器打出化学试剂入口储液池和废液出口。
    5. 用胶带去除PDMS块体表面的灰尘。将PDMS块体和一片洁净的载玻片一同放入等离子机中，抽真空3分钟。
    6. 开启等离子电源，将功率调至高（HIGH）档，轻轻调节空气阀门，对PDMS块体和载玻片进行3分钟的等离子处理。
    7. 关闭等离子电源，释放真空，用镊子小心取出PDMS块体和载玻片。
    8. 立即将PDMS块体（通道面朝下）贴合在载玻片上，轻轻按压使其与玻璃键合。立即向微流控通道中注入去离子水；微流控器件的制作与组装完成。

2. 微流控细胞迁移实验准备

  1. 微流控装置准备。
    1. 在生物安全柜内，将50 µL储存浓度为1 mg/mL的纤连蛋白原液用950 µL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释，配制成50 µg/mL的纤连蛋白溶液。
    2. 通过混合9 mL RPMI-1640培养基（Roswell Park Memorial Institute培养基）和1 mL含4%牛血清白蛋白（BSA）的RPMI-1640培养基，制备迁移培养基。
    3. 从装置中移除去离子水。
    4. 从出口端向装置中加入100 µL纤连蛋白溶液，等待3分钟以确保所有通道均被溶液填充。将微流控装置置于加盖的培养皿中，在室温下孵育1小时。
    5. 从装置中移除纤连蛋白溶液，从出口端加入100 µL迁移培养基，等待3分钟以确保所有通道均被迁移培养基填充。
    6. 再于室温下孵育装置1小时；此时装置已准备好用于趋化实验。
  2. 趋化实验用趋化因子溶液的制备。
    1. 在总共1 mL迁移培养基中配制100 nM fMLP溶液。在1.5 mL离心管中，将5 µL储存浓度为1 mM的FITC-葡聚糖（10 kDa）与fMLP溶液混合。
      注：FITC-葡聚糖用于梯度测定。也可使用罗丹明作为梯度指示剂。fMLP趋化因子溶液现已可用于趋化实验。
  3. 痰液样本制备。
    注：本研究测试了慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者痰液样本梯度诱导的中性粒细胞趋化作用，作为该全芯片方法的一种临床诊断应用。
    1. 获取人类伦理审批，用于从COPD患者收集痰液样本。
      注：我们已获得在温尼伯七橡树综合医院（Seven Oaks General Hospital）采集样本的批准（由曼尼托巴大学批准）。
    2. 从所有受试者处获取书面知情同意书。
    3. 收集COPD患者的自发咳痰样本。将500 µL痰液样本置于1.5 mL离心管中。
    4. 向1.5 mL离心管中加入500 µL 0.1%二硫苏糖醇（DTT），轻轻混匀。将离心管置于37 °C水浴中15分钟。
    5. 以753 × g离心10分钟，收集上清液；再以865 × g离心5分钟，收集最终上清液。将所得上清液储存于-80 °C冰箱中，待用。
    6. 进行趋化实验前，将痰液溶液解冻；在生物安全柜内，将900 µL迁移培养基转移至1.5 mL离心管中，并与100 µL痰液溶液混合；此时痰液溶液已准备好用于趋化实验。
  4. 血液样本采集。
    1. 获取人类伦理审批，用于从健康供体采集血液样本。从所有献血者处获取书面知情同意书。
      注：本研究样本采集于温尼伯维多利亚综合医院（Victoria General Hospital）（由曼尼托巴大学联合学院研究伦理委员会批准）。
    2. 通过静脉穿刺采集血液样本，并将样本注入EDTA抗凝管中。实验前将样本管置于生物安全柜内保存。

3. 全芯片化学趋化性实验操作

  1. 芯片上的细胞分离（图1B）。
    1. 在生物安全柜内，将10 µL全血置于1.5 mL离心管中。
      注意：血液样本采集的详细信息见第2.4节。
    2. 从中性粒细胞分离试剂盒（见材料表）中取2 µL抗体混合物（Ab）和2 µL磁性颗粒（MP），加入1.5 mL离心管中，轻轻混匀；此步骤将标记血液中除中性粒细胞外的其他细胞。
    3. 将血液-抗体-磁性颗粒混合物在室温下孵育5分钟。
      注意：此步骤将使血液中被抗体标记的细胞带上磁性标签。
    4. 将两个小型磁铁盘分别固定在装置的细胞加样口两侧。吸出装置所有端口中的液体。
    5. 从细胞加样口缓慢加入2 µL血液-抗体-磁性颗粒混合液至微流控装置中。
      注意：被磁性标记的细胞将被捕获在细胞加样口的侧壁上，而中性粒细胞则流入装置，并在细胞停靠结构处被捕获。
    6. 等待数分钟，直至在细胞停靠区域捕获到足够数量的中性粒细胞。
  2. 趋化实验（图1C）。
    1. 将微流控装置置于37 °C控温的显微镜载物台上。
    2. 使用两个移液器，分别向指定的入口储液池中加入100 µL趋化因子溶液（fMLP或痰液溶液）和100 µL迁移培养基；通过基于连续层流的化学混合，并借助压力平衡结构，将在梯度通道中形成趋化因子浓度梯度。
      注意：慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者痰液采集的详细信息见第2.3节。
      1. 在培养基对照实验中，仅向两个入口储液池中加入迁移培养基。
    3. 获取梯度通道中FITC-葡聚糖的荧光图像。
    4. 使用“文件|打开”命令将图像导入ImageJ软件。
    5. 使用“分析|轮廓分析”命令测量梯度通道中的荧光强度分布。
    6. 将测量数据导出至电子表格，用于进一步绘图分析。
    7. 将装置在控温显微镜载物台或常规细胞培养孵育箱中孵育15分钟。
    8. 使用10倍物镜对梯度通道成像，记录细胞的最终位置，用于数据分析。
    9. 如需，可通过延时显微镜记录装置中细胞的迁移过程。

4. 细胞迁移数据分析（图1C）

  1. 通过计算细胞从对接结构迁移的距离来分析趋化性实验，具体方法如下所述。参见图1C。
  2. 将图像导入NIH ImageJ软件（版本1.45）。
  3. 选择迁移至浓度梯度通道中的每个细胞的中心位置。
  4. 测量所选细胞最终位置的坐标，并测量对接结构边缘某一点的坐标作为初始参考位置。
  5. 将测得的坐标数据导出至电子表格软件（例如 Excel）。沿浓度梯度方向，计算每个细胞最终位置与初始参考位置之间的差值，即为细胞迁移距离。
  6. 将距离校准为微米单位。计算所有细胞迁移距离的平均值和偏差，作为趋化性的量化指标。
  7. 使用Student's t-检验，比较存在趋化因子梯度条件下的细胞迁移距离与培养基对照实验的迁移距离。
  8. 若已记录细胞迁移的时间序列图像，则可进一步通过细胞轨迹分析对细胞迁移和趋化性进行分析15。
    注：构建和实施芯片上完整趋化性实验所需的材料详见材料表。

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结果

中性粒细胞通过微流控芯片装置直接从少量全血中进行阴性筛选分离。芯片内吉姆萨染色验证了分离所得中性粒细胞的纯度，结果显示中性粒细胞典型的环状和分叶状细胞核结构（图2A）25。这表明该方法能够从小体积全血中高效、高纯度地在芯片上完成中性粒细胞的分离。此外，在施加化学梯度之前，对接结构可有效将细胞排列至梯度通道旁（图2B）25。

浓度梯度的生成基于连续层流化学混合，流体由进样端和出样端溶液之间的液位差所产生的压力驱动，无需使用外接泵。在几分钟内，微流控装置中即可建立化学浓度梯度，并通过FITC-葡聚糖在梯度通道中的荧光强度分布进行表征。该梯度至少可稳定维持1小时，足以完成当前的中性粒细胞趋化实验（图1C<...

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讨论

本文描述了一种在单个微流控芯片上直接从全血中分离中性粒细胞并随后进行趋化性检测的详细实验方案。该方法具有操作简便、通过阴性筛选获得高纯度中性粒细胞、样本到结果的趋化检测速度快、试剂和样本消耗量少以及细胞迁移数据精确分析等优点。粗略估计，输入的全血样本中至少有25%的中性粒细胞有效进入芯片中的对接结构，且通过芯片上吉姆萨染色发现中性粒细胞纯度较高。

这种全芯片集成的趋化性分析方法在各种细胞迁移研究和临床应用中具有巨大潜力。本方法的一个研究应用实例是通过比较中性粒细胞在仅含培养基条件下与fMLP浓度梯度下的趋化性来展示的。类似地，该方法可用于检测中性粒细胞在慢性阻塞性肺疾病（COPD）痰液中的趋化性，作为开发用于临床诊断的细胞功能生物标志物的示例。利用该方法，研究人员可轻松地单独或联合测试中性粒细胞对不同趋化因子的趋化反应。研究人员还可以利用该方法测试患者来源的复杂趋化因子对中性粒细胞的趋化作用，或检测来自患病个体的中性粒细胞是否存在趋化反应的潜在改变。这种集成化的全芯片方法特别适用于缺乏专业细胞培养和活细胞成像设施的研究或临床实验室开展检测。研究人员或临床医生可依据本方案轻松操作该检...

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披露

不存在需要披露的利益冲突。

致谢

本工作部分得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）和加拿大卫生研究院（CIHR）资助项目的支持。感谢温尼伯维多利亚综合医院临床应用研究与教育研究所和温尼伯七橡综合医院对来自人类受试者的临床样本管理工作提供的支持。感谢Hagit Peretz-Soroka博士在检测操作策略方面提供的有益讨论。 感谢滑铁卢大学的Carolyn Ren教授和Xiaoming (Cody) Chen博士在拍摄过程中提供的大力支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
器件制备
掩模对准器ABMN/A
匀胶机Solitec5000
加热板VWR11301-022
等离子清洗机Harrick PlasmaPDC-001
真空干燥器Fisher Scientific08-594-15A
电子天平OhausCS200
SU-8 2000 稀释剂MicrochemSU-8 2000
SU-8 2025 光刻胶MicrochemSU-8 2025
SU-8 显影液MicrochemSU-8 显影液
硅片Silicon, IncLG2065
异丙醇Fisher ScientificA416-4
(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷Gelest78560-45-9
聚二甲基硅氧烷
(PDMS)		Ellsworth Adhesives2065622
培养皿Fisher ScientificFB0875714
载玻片Fisher Scientific12-544-4
切割垫N/AN/A定制
打孔器N/AN/A定制
名称来源目录编号备注
芯片上细胞分离与趋化实验
RPMI 1640Fisher ScientificSH3025502
DPBSFisher ScientificSH3002802
牛血清白蛋白
(BSA)		Sigma-AldrichSH3057402
纤连蛋白VWRCACB356008
fMLPSigma-AldrichF3506-10MG
磁性圆盘Indigo Instruments44202-1直径 5 mm，
厚度 1 mm
FITC-葡聚糖Sigma-AldrichFD10S
罗丹明
Sigma-Aldrich		R4127-5G
吉姆萨染色液Rowley Biochemical Inc.G-472-1-8OZ
EasySep 直接人
中性粒细胞分离
试剂盒		STEMCELL
Technologies Inc		19666
二硫苏糖醇Sigma-AldrichD0632
尼康 Ti-U 倒置荧光显微镜NikonTi-U
显微镜环境培养箱InVivo ScientificN/A
CCD 相机NikonDS-Fi1

参考文献

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