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单分子水平高精度FRET用于生物大分子结构测定

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DOI：

10.3791/55623

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2017年5月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于单分子水平高精度FRET实验的方案。此外，该方法还可用于鉴定N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体配体结合域中的三种构象状态。精确测定距离是基于FRET实验构建结构模型的第一步。

摘要

本文介绍了一种在多参数荧光检测（MFD）模式下单分子水平上利用荧光共振能量转移（FRET）进行高精度染料间距离测量的实验方案。MFD充分利用荧光的所有"维度"，以减少光物理和实验中的伪影，从而在刚性生物大分子中实现精度高达约1 Å的染料间距离测量。该方法已被用于鉴定N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体配体结合域的三种构象状态，进而解释受体在配体结合后的激活机制。在将已知的晶体结构与实验测量结果进行比较时，对于更具动态性的生物大分子，两者差异小于3 Å。若能获得覆盖生物大分子全部构象维度的一组距离约束数据，则有望构建出动态生物大分子的结构模型。

引言

结构生物学研究的一个基本目标是揭示生物大分子机器结构与功能之间的关系。20世纪50年代，随着X射线晶体学的发展，人们首次获得了生物大分子（例如蛋白质和核酸）的可视化图像1,2。X射线晶体学可提供高分辨率的静态结构信息，但这些信息受到晶体堆积的限制。因此，X射线结构模型固有的静态特性忽略了生物大分子的动态本质，而这种动态特性对大多数生物学功能具有重要影响3,4,5。核磁共振（NMR）6,7,8通过在水溶液中解析结构模型，为这一问题提供了另一种解决方案。NMR的一大优势在于能够揭示生物大分子的内在动态特性和构象集合，有助于阐明结构、动力学与功能之间的内在联系3,4,5。然而，NMR受限于样品尺寸和所需样品量较大，对于较大的体系需要复杂的标记策略。因此，结构生物学领域迫切需要发展替代性方法。

从历史上看，由于人们误认为荧光共振能量转移（FRET）9 只能提供低精度的距离测量，因此它在结构生物学中并未发挥重要作用。本实验方案的目的在于重新审视 FRET 在纳米尺度距离测定方面的能力，使得这些距离数据可用于构建生物大分子的结构模型。1967 年，Stryer 通过测量不同长度的多聚脯氨酸作为“"光谱尺"”，首次在实验上验证了 FRET 效率与距离的 R-6 依赖关系10。类似实验于 2005 年在单分子水平上得以实现11。然而，多聚脯氨酸分子被证明并非理想材料，因此后续改用双链 DNA 分子进行研究12。这为精确的距离测量打开了新的窗口，也推动了利用 FRET 鉴定生物大分子结构特性的理念发展。

当染料间距离范围为约0.6–1.3时，FRET效果最佳 R0，其中 R0 是 Förster 距离。对于单分子 FRET 实验中常用的典型荧光染料， R0 约为50 Å。通常，与其他方法相比，FRET在解析和区分异质系统中的结构与动力学方面具有诸多优势：（i）由于荧光具有极高的灵敏度，单分子FRET实验13,14,15,16 可通过对单个组分直接计数并同时表征其结构，解析异质性集合体。（ii）单分子FRET研究能够直接解析复杂的反应路径，因为无需对集合体进行同步。（iii）FRET可覆盖时间尺度跨越10个数量级的广泛时域，适用于多种生物学相关的动态过程。（iv）FRET实验可在任意溶液条件下进行， 体外 以及 体内将FRET与荧光显微镜结合，可直接在活细胞中研究分子结构和相互作用15,16,17,18,19，即使具有高精度20. (v) FRET 可应用于几乎任意大小的体系（例如， 聚脯氨酸寡聚物21,22,23,24Hsp9025HIV逆转录酶26和核糖体27（vi）最后，可利用包含生物大分子所有维度信息的距离网络，来推导静态或动态分子的结构模型。18,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37.

因此，单分子FRET光谱可用于获得足够精确的距离数据，进而用于距离限制的结构建模26这可以通过利用多参数荧光检测（MFD）实现。28,38,39,40,41,42，利用八维荧光信息（即， 激发光谱、荧光光谱、各向异性、荧光寿命、荧光量子产率、宏观时间、荧光强度以及荧光团之间的距离）以准确且精确地提供距离限制。此外，脉冲交错激发（PIE）与多参数荧光检测（MFD）相结合（PIE-MFD）42 用于监测直接受激的受体荧光，并筛选出具有1:1供体-受体化学计量比样品中的单分子事件。典型的PIE-MFD装置采用两束脉冲交错激发激光器，连接至共聚焦显微镜主体，光子检测被分为四个不同光谱窗口和偏振特性的检测通道。更多细节见于 图1.

需要注意的是，必须将FRET与计算方法相结合，才能获得与FRET结果一致的原子级结构模型26,30。本实验方案的目的并非详述利用FRET衍生的距离构建结构模型的相关方法。然而，这些方法已与其他技术（例如，小角X射线散射或电子顺磁共振）结合使用，由此催生了整合结构生物学这一领域43,44,45,46。当前的目标是推动FRET成为结构生物学中一种定量分析工具。例如，该方法已被用于识别N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体配体结合域（LBD）中的三种构象状态。最终目标是克服上述局限性，通过提供高精度的测量距离，使FRET成为生物大分子结构解析中常用的整合方法之一。

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方案

1. PBS缓冲液配制与腔室处理

注意：进行湿化学实验时需穿戴实验服和一次性手套。调整激光器时需佩戴护目镜。

  1. PBS缓冲液的配制
    1. 将4.5 g Na2HPO4、0.44 g NaH2PO4和3.5 g NaCl溶解于400 mL蒸馏水中。调节pH至7.5，并在液体循环模式下高压灭菌1小时（根据高压灭菌器系统而定）。
    2. 取15 mL PBS溶液，加入0.1 g活性炭，混匀。使用普通的20 mL注射器滤器（孔径0.2 µm）过滤混合液。密封后于室温保存PBS缓冲液。
  2. 显微镜用带腔盖玻片的处理
    1. 向带腔盖玻片系统（见材料列表）中加入500 µL蒸馏水和5 µL非离子表面活性剂聚山梨酯20（见材料列表），充分混匀。浸泡30分钟。吸除聚山梨酯20溶液，用蒸馏水冲洗腔体两次。让其自然干燥。
      注意：此时腔体已可使用。

2. DNA 样本制备

注意：使用设计好的带标记DNA链（参见材料列表）来制备双链DNA（dsDNA）标准样品。设计的寡核苷酸序列末端不得带有染料，以避免产生可能影响测定距离的伪影。DNA序列应选择能够表现为刚性结构的序列。

  1. 取1.5 µL标记的供体DNA链和4.5 µL互补（受体标记或未标记）DNA链加入微量离心管中，并用24 µL无核酸酶水混匀。
    注意：根据所选寡核苷酸的组合，将生成无FRET、低FRET或高FRET的双链DNA。
  2. 使用热循环仪按照以下程序进行DNA杂交：95 °C孵育10分钟，90 °C孵育10分钟，80 °C孵育10分钟，70 °C孵育10分钟，60 °C孵育10分钟，50 °C孵育10分钟，40 °C孵育10分钟，30 °C孵育10分钟，20 °C孵育10分钟，10 °C孵育10分钟，最后维持在5 °C。
    注意：制备的双链DNA标准品可长期保存于-20 °C冰箱中，也可立即使用。

3. 蛋白质样品制备

注意：从用于在细菌系统中表达目标蛋白的重组DNA开始，可将需要测量距离的残基突变为半胱氨酸。为此，使用标准的定点突变技术。47为便于蛋白质纯化，将重组及突变的DNA克隆至含有纯化标签的载体中（例如， 一个His标签）。来自NMDA谷氨酸离子型受体（GluN1）的谷氨酸亚基1配体结合域（LBD）即， NMDA GluN1 LBD 克隆至 pET-22b (+) 载体中。

  1. 蛋白质表达
    1. 将构建的DNA质粒转化至选定的表达系统48.
      注意：以下步骤假设可溶性蛋白的表达已在 大肠杆菌例如，从转染的哺乳动物细胞中进行纯化49 或转导的昆虫细胞50，也是可行的，详细步骤可参见其他文献。确保 E. coli 所选菌株应适合目标蛋白的表达。例如，含有二硫键的蛋白表达需要使用具有较低还原性胞内环境的感受态细胞菌株（参见材料列表）。
    2. 接种预培养物 E. coli 使用无菌移液器吸头挑取单个转化菌落进行培养48将其放入100 mL选择性LB培养基（见材料列表）中，并于37 °C过夜培养。
    3. 制备LB肉汤（参见材料列表），高压灭菌。
    4. 接种转化后的大量培养物 E. coli 通过以1:500的比例将过夜培养物加入2 L选择性LB培养基中。
    5. 在接下来的几个小时内，通过监测培养物在600 nm波长处的吸光度（Abs），有时也称为600 nm处的光密度（OD），来评估培养物的生长情况。600），或使用细胞密度计进行测量。请注意，读数会随时间增加。
    6. 当菌液培养至 OD 值达到指定范围时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为 0.5 mM 以诱导蛋白表达600 0.7。震荡诱导 E. coli 在20 °C下孵育20-24小时。
    7. 蛋白诱导后，离心收集菌体 E. coli 通过在 3,000 × g 和 4 °C 条件下离心 20 分钟。弃去上清液并储存沉淀 E. coli 将含有胞内蛋白的沉淀物于 -80 °C 保存至使用。
  2. 蛋白质纯化
    1. 裂解 E. coli 使用一种可选的裂解方法（例如， 超声处理，法国压，氮气空化 等等。)51.
    2. 通过在 4 °C 条件下以 185,000 x g 离心 1 小时，沉淀膜组分和细胞碎片。
    3. 对于带有 His 标签的蛋白，使用快速蛋白液相色谱系统（FPLC）将上清液上样至已平衡并载有镍离子的固定化金属亲和层析柱（IMAC）中（参见 材料表)52.
      注意：NMDA GluN1 LBD 平衡缓冲液：200 mM NaCl、20 mM Tris、1 mM 甘氨酸，pH 8。NMDA GluN1 LBD 洗脱缓冲液：200 mM NaCl、20 mM Tris、1 mM 甘氨酸、400 mM 咪唑，pH 8。
      1. 用含有低浓度（约 12 mM）咪唑的缓冲液洗涤 IMAC 柱。
      2. 使用咪唑浓度从12 mM到400 mM的线性梯度从IMAC柱上洗脱蛋白。
    4. 将蛋白在不含咪唑的平衡缓冲液中透析过夜53 通过将3.2.3.2步骤的洗脱液置于透析袋中，并浸入平衡缓冲液中持续搅拌2-3小时。至少重复一次。
      注意：步骤 3.2.3–3.2.6 假设纯化的是带有 His 标签的蛋白。若采用其他方法进行纯化，需相应调整实验方案。
    5. 通过测定透析后蛋白质在280 nm处的吸光度，并利用比尔定律定量蛋白质含量吸光度单位 = ε L c，其中 ε 是摩尔消光系数（M⁻¹·cm⁻¹）-1cm-1），可在此处获取54; L 是光程长度（cm）；以及 c 是蛋白质浓度（M）。
      注意：可采用多种蛋白质定量检测方法，包括 Bradford 法和二辛可宁酸法，二者均可提供准确的检测结果。
  3. 蛋白质标记
    1. 将供体（马来酰亚胺反应性青绿色染料）和受体（马来酰亚胺反应性远红染料）荧光团以1:1:8的蛋白质:供体:受体摩尔比加入纯化的蛋白质中。
    2. 将蛋白质与荧光染料混合物置于冰上孵育30分钟。也可进行更长时间的孵育。
    3. 用与步骤 3.2.3 相同的平衡缓冲液对 0.5 mL 镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）琼脂糖柱（参见材料列表）进行装柱并平衡，同时继续孵育蛋白。
      注意：上样蛋白量需符合树脂的结合能力。
    4. 孵育30分钟后，将蛋白质/荧光染料混合物上样至步骤3.3.3中制备的层析柱，通过重力流进行纯化。
    5. 用5 mL平衡缓冲液洗去多余的荧光染料。
    6. 用0.5 mL洗脱缓冲液通过重力作用从柱子中洗脱标记蛋白，共洗脱四次。由于该蛋白已从其他蛋白中纯化出来，无需使用梯度洗脱。
    7. 使用紫外-可见分光光度计检测每个洗脱组分，以确定哪个组分含有标记蛋白。扫描230–700 nm范围内的吸光度，确保在洗脱液中可观察到蛋白（280 nm）以及每种荧光染料的吸光度峰（青绿色荧光染料为493 nm，远红荧光染料为651 nm）。
      注意：蛋白通常在第2个组分中洗脱。
    8. 平衡脱盐柱（参见 材料表用炭处理的 PBS（步骤 1.1）
    9. 通过重力流将标记的蛋白质上样至脱盐柱中。
      注意：上样蛋白的量需符合所选脱盐柱的载样容量55.
    10. 使用3.5 mL经活性炭处理的PBS进行重力流洗脱，并收集0.5 mL的洗脱液组分。
    11. 使用紫外-可见分光光度计对每份洗脱液在230-700 nm波长范围内进行吸光度扫描，以确定含有标记蛋白的组分。
      注意：步骤 3.3.8–3.3.11 基本上是缓冲液置换步骤。也可采用其他具有相同目的的实验方案（例如， 广泛透析）。或者，可以从步骤 3.3.2 直接进入步骤 3.3.8。

4. 集体条件（比色皿中）下所需的测量

  1. Förster 常数的测定
    1. 扫描 fD，使用荧光分光光度计，在比供体最大吸收波长低15 nm的波长处激发，以获得完整的发射光谱，检测荧光团的荧光发射（计数每秒，cps）。从激发波长后5 nm处开始监测发射信号，至150 nm后结束。通过将发射光偏振器设置为54.7°，采用魔角条件进行测量。 并将激发偏振片调至0°56.
      注意：本实验所用的供体荧光团，其吸收峰位于490 nm；激发波长选用475 nm，并监测480-650 nm范围内的发射光。对于受体，其吸收峰位于645 nm；激发波长选用630 nm，并监测635-735 nm范围内的发射光。
    2. 使用荧光计对受体荧光团（AbsA）范围为400-700 nm，并通过将发射偏振器设置为54.7°来使用魔角条件 并将激发偏振片调至0°56将发射单色器设置在最大发射波长后15 nm处。以最大激发值为基准进行归一化。
    3. 在已发表的表格中，查找受体的消光系数 εA （M-1 厘米-1)56，或使用制造商提供的数值。
      注意：本文中所用受体荧光团的发表值为 εA647 = 270,000 厘米-1 M-1 56.
    4. 使用 J = Σf 计算光谱重叠D ·（吸收度A · εA) · λ4，其中 fD，吸光度A，和 εA 上述已定义 λ 为波长（nm）。使用工作表将步骤 4.1.1–4.1.3 中获得的所有波长依赖性数值按列列出，并按波长对齐。从供体发射的最小波长（λ分钟) 至受体吸收光谱的最大波长（λ最大).
    5. 计算福斯特常数（Ro）使用以下公式 Ro6 = 8.79 × 10-5 · J · κ2 · ΦF,D · n-4，其中 J 为步骤 4.1.4 中先前计算的光谱重叠，κ2 是取向因子，ΦF,D 是供体荧光团的荧光量子产率，n 是荧光团所处介质的折射率。
      注意：使用 n = 1.33（若使用水性缓冲液）和 κ2 = 2/3.
    6. 找到供体荧光团的量子产率值（ΦF,D, 根据已发表的表格（参见参考文献57）确定环境依赖性参数，并利用步骤4.1.4中获得的光谱重叠值，结合步骤4.1.5中的公式计算福斯特常数的最终值。
      注意：如果量子产率不可用，请按照下文步骤 4.2 计算。在此情况下，使用 ΦF,D = 0.8，对应供体寿命 τD,r = 4.0 ns
  2. 荧光量子产率的测定
    注意：以下步骤仅假设为动态猝灭。若需考虑静态猝灭，请参考文献56。然而，即使在静态猝灭的情况下，PIE-MFD实验也有助于确定量子产率（见结果部分）。
    1. 为受体和供体荧光团选择具有相似吸收和发射光谱的参考荧光团，用于测定量子产率（Φr已确定。
      注意：对于供体，Φr = 0.8 且 τr = 4 ns，而对于受体，Φr = 0.32 且 τr = 1.17 ns, 对应于 Φr 和 τr 分别为青绿色荧光团和远红荧光团标记的寡核苷酸57.
    2. 在魔角条件下，采用时间相关单光子计数法（TCSPC）测量时间分辨荧光衰减曲线（f(t)）。
    3. 用单指数或多指数衰减函数对荧光衰减进行拟合，函数形式为 f(t) = Σixie-t/τi，其中 xi 是群体比例，τi 为群体荧光寿命。
    4. 计算物种的平均寿命〈τ〉x = Σxiτi, 其中 xi 是群体比例，τi 为群体荧光寿命。
    5. 使用公式 ΦF,D = 〈τD〉x Φr / τr 通过代入参比物质的荧光寿命和量子产率，以及供体荧光团的荧光寿命，来计算供体荧光团的荧光量子产率。
      注意：本方法假设为动态猝灭。对于其他 ΦF,D 测定，遵循 Lakowicz 的方法56.

5. 用于 PIE-MFD 单分子检测（SMD）的实验校准

注意：测量时最好关闭灯光。

  1. 仪器调整（图1）
    注意：图示为自制的MFD装置 setup 图1，采用配备两个脉冲激光器和4个检测通道的倒置显微镜系统进行本实验。存在类似的商业系统。
    1. 打开MFD装置的485 nm和640 nm激光器及所有探测器。启动控制TCSPC采集和激光器的软件。确保激光器重复频率为40 MHz。
    2. 将485 nm脉冲激光功率在60倍1.2数值孔径水浸物镜的成像平面上设置为60 µW，将640 nm脉冲激光功率在脉冲交错激发模式（PIE-MFD）下设置为23 µW42.
      注意：设置PIE-MFD时，两个激光脉冲的延迟在激光控制器软件中进行调节。对于485 nm激光激发，检测的TCSPC通道（TAC通道）为1-12,499（“prompt”通道）；对于640 nm激光激发，检测的TCSPC通道（TAC通道）为12,499-50,000（“delay”通道）。
    3. 在显微镜物镜与盖玻片之间加入物镜浸液（一滴双蒸水）。为确保成像平面位于溶液内部且远离玻璃表面，在找到由激光在玻璃-液体界面反射产生的第二个明亮焦点后，再将调焦旋钮转动一圈半。
    4. 向盖玻片中心加入1 µL 100 nM Rhodamine 110和50 µL蒸馏水。确保溶液也位于显微镜物镜的中心位置。
    5. 调节针孔（大小：70 µm）的位置（每次一个方向，x 和 y 方向），同时在采集软件中监测光子计数率，以最大化检测到的光子数量。
  2. 标准测量SMD（在暗室中操作）
    1. 使用步骤 5.1.4 中的样品，点击时间标记时间分辨（TTTR）控制面板上的“开始”按钮，以“*.ht3”格式记录 120 秒的计数率58 在采集软件上。
    2. 离线计算荧光相关光谱（FCS）59,60,61 (即， 通过FCS测量确定扩散的特征时间、共聚焦体积内的分子数量、三重态动力学以及分子亮度62.
      1. 打开FCS软件（Kristine，MFD suite）。通过点击“Options”选择实验设置。> 选择“设置”。选择一个具有相似实验条件的文件，然后点击“从文件获取参数”以读取该文件中的标题信息。
      2. 选择“Operate” -> “关联”以执行FCS。
        注意：确保正确指定通道编号，并选中“TAC门控”（TCSPC通道），以相应地选择激发或延迟通道。
      3. 选择“Operate” -> “全局拟合相关曲线”以打开拟合程序。在软件中选择“方程 #24”，然后点击“开始”。
        注意：软件中的公式 #24 描述了自相关函数（Gc在三维高斯照明轮廓下自由扩散的荧光分子的）61:
        Fluorescence correlation spectroscopy equation, G(tc) formula, analytical method.
        其中 N 是检测体积内的分子平均数量， xT 处于三重态动力学的分子所占比例，其特征时间为 tT, tc，是相关时间， t差异 扩散时间是否与几何参数相关 ω，以及 ω 描述高斯照明轮廓。拟合后，记录扩散时间和共聚焦体积内的分子数。
         
    3. 将10 µL的100 nM罗丹明101加入50 µL蒸馏水中，充分混匀。将混合液滴加至盖玻片表面，确保液滴位于物镜中心。点击TTTR控制面板上的“开始”按钮，以TTTR格式记录120秒数据。
    4. 向50 µL蒸馏水中加入1 µL的100 nM远红荧光染料，充分混匀。将该混合液置于物镜中心。点击“开始”按钮，以TTTR格式记录120秒数据。
    5. 在物镜中心滴加50 µL蒸馏水。点击“开始”按钮，以TTTR格式记录300秒数据。
    6. 将50 µL PBS缓冲液置于物镜中心。点击“开始”按钮，以TTTR格式记录300秒数据。
    7. 取步骤5.1.4中的混合液1 µL，与50 µL蒸馏水混合。将此混合液滴加至盖玻片上。首先点击“开始”按钮，以TTTR模式采集10秒数据。然后按照步骤5.3所述，使用Burst Integration Fluorescence Lifetime（BIFL）分析软件（Paris，MFD suite）分析TTTR模式文件。
      注意：请通过脉冲选择与分析软件核实每秒的脉冲次数26,61如果每10秒的爆发水平约为35，则适合进行单分子测量。
    8. 以TTTR格式继续记录计数率1.5小时（即， 将SMD下的TCSPC作为单分子测量标准使用。
      注意：由于文件较大，需将原始的“*.ht3”文件分割为较小的文件，以便使用 BIFL 加载和处理。
  3. 使用BIFL分析标准样品
    1. 打开 BIFL 软件（Paris）。
    2. 在“确认设置”自动弹出窗口中选择PIE的设置，并通过选择具有相似实验条件的文件来读取标题。点击“从文件获取参数”。点击“确定”。注意弹出窗口将关闭并集成到Paris前端界面中。在“下一步”下方点击“确定”。
    3. 通过点击“数据路径数组”中的“选择”来选定要分析的文件，以选择待分析的测量数据。
      1. 单击“Green scatter”（用于水样测量）、“Green BG”（用于缓冲液测量）、“Green thick”（用于2 nM 罗丹明110测量）、“Red scatter”（用于水样测量）、“Red BG”（用于缓冲液或水样测量）、“Red thick”（用于20 nM 罗丹明101测量）、“Yellow scatter”（用于水样测量）、“Yellow BG”（用于缓冲液测量）和“Yellow Thick”（用于2 nM 远红荧光染料测量）。
      2. 在“下一步”下方点击“确定”
        注意：“绿色”通道对应于“即时”TCSPC通道中绿色探测器的信号。“红色”通道对应于“即时”TCSPC通道中红色探测器的信号。“黄色”通道对应于延迟TCSPC通道中红色探测器的信号。
    4. 单击“按爆发模式裁剪数据”旁边的“调整”以设置单分子选择参数。在弹出的新窗口中，通过修改“阈值”下的光子间到达时间（“dt”）和“最小数量#”下的每单分子事件最低光子数，选择与平均光子间到达时间相差两个标准差的单分子事件。单击“返回”关闭弹出窗口，然后单击“下一步”下方的“确定”。
      注意：阈值（单位为 ms）取决于背景计数率。通常使用的光子最小数量为 60。
    5. 调整初始荧光寿命“颜色拟合参数”(例如“绿色”、“红色”和“黄色”颜色的生成荧光衰减参数（包括“来自”、“至”和卷积）。在同一窗口中，调整“Prompt”和“Delay”的“from”和“to”值。单击“Return”关闭弹出窗口。单击“Next”下方的“OK”。
      注意：确保选中双色激发复选框。“从”和“到”分别对应荧光衰减直方图（TAC 通道号）上的起始和终止通道。如果初始拟合参数选择恰当，拟合函数将被添加到每个通道的荧光衰减曲线中。
    6. 选择硬盘上的位置，用于在父文件夹中保存所有处理后的 ASCII 文件。
      注意：Paris 会处理所有选定的脉冲，并生成多个 ascii 输出文件，这些文件可被其他程序用于可视化例如， Margarita MFD 套件

6. 双链DNA标准品与样品测量

  1. 向腔室盖玻片中加入 500 µL PBS 缓冲液，并在腔室与物镜之间滴加一滴蒸馏水。点击控制脚踏板上的“Start”按钮，以 TTTR 模式采集 5 分钟数据用于分析。
  2. 取少量双链DNA标准品（通常约为0.1 µL，浓度约为1 µM），加入PBS缓冲液中，充分混匀。首先，点击“开始”采集10秒数据。然后，检查脉冲信号，确保每10秒获得35个脉冲（如步骤5.2.7和5.3所述）。最后，继续采集 >2小时的TTTR格式数据，如上所述。
  3. 按照步骤 5.3.3 对收集的 dsDNA 样本数据进行分析。
  4. 使用 MFD 套件（Margarita）可视化突发直方图，并绘制 FRET 效率相对于〈τD(A)〉f 或 FD/A 与 〈τD(A)〉f.
    1. 打开 Margarita 软件，选择“文件”-> 导入所有 *.??4 和 *.mti 文件。选择包含多个子文件夹的父文件夹。
    2. 选择要显示的参数，方法是点击从Paris获得的某个参数旁边的“X”（横坐标）例如， tau green 或 τD(A)〉f）；同样地，对纵坐标“Y”重复此操作，以选择要可视化的参数（例如， FRET 效率，FD/A，或 SPIE PIE
      注意：本例中，FRET 效率，FD/A，或 SPIE 校正绿色、红色和黄色通道的本底计数率；校正供体和受体的量子产率；校正检测效率比（gG/gR）；以及串扰（α）。此处，gG/gR = 3.7 且 α = 0.017，仅取决于仪器。本底计数率取决于所用缓冲液，量子产率值为先前测定。
    3. 通过点击“Display”打开“Overlay Equation”窗口，添加一条FRET曲线> “叠加方程”：从弹出菜单中选择静态FRET曲线。选择适当的供体寿命和量子产率参数，以生成正确的FRET曲线。
      注意：可生成用于关联各种FRET指示剂的FRET曲线。
  5. 通过展示FRET效率与化学计量比（S）的关系，利用化学计量参数确定供体激发光源对受体激发的校正因子（β）。PIE）代入马尔加里塔公式（见下方公式1）。
    注意：选择 β 使得供体样品在 S 处出现峰值PIE 在化学计量学尺度上为1.0；受体-only 样品的化学计量学值应为SPIE = 0.0，而同时带有两种标记的双链DNA应具有S的化学计量比PIE ~0.5.
    注意：仪器现已准备就绪，可测量FRET标记的样品。
  6. 按照步骤6.3–6.4测量并分析第3节中制备的FRET标记样品。

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结果

在使用MFD装置的典型单分子FRET实验中（激光波长：485 nm，功率60 µW；640 nm，功率23 µW，见第5.1节），荧光样品被稀释至低皮摩尔浓度（10-12 M = 1 pM）并置于共聚焦显微镜中，通过亚纳秒激光脉冲激发在激发体积内自由扩散的标记分子。典型的共聚焦体积为 <4飞升（fL）。在如此低的浓度下，每次仅能检测到单个分子。标记分子发出的荧光通过物镜收集，并利用针孔进行空间滤波。此步骤定义了一个有效的共聚焦检测体积。随后，信号在两个（或多个）不同的光谱窗口被分为平行和垂直分量。例如， “绿色”和“红色”）。每个光子探测器通道随后连接至时间相关单光子计数（TCSPC）电子系统，用于数据采集（图1).

完成MFD装置的校准（该步骤总结于表1中的第5–6步）后，即可开始对dsDNA标准品进行测量。随后，采用PIE-MFD分析多...

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讨论

本研究介绍了利用 PIE-MFD 单分子 FRET 实验对染料间距离进行高精度对齐、校准和测量的实验方案。通过精确校准所有仪器参数，可提高所测距离的准确性，并达到埃级精度。为此，采用多种多维直方图来分析并识别待进一步表征的群体。利用平均宏时间验证所测样品的稳定性，可对供体和受体的光漂白进行校正，并根据化学计量参数选择 FRET 群体。然而，受体的光物理性质可能随标记位置的不同而发生变化。因此，可利用 SPIE 分布对受体量子产率进行准确校正。准确的光物理表征对于确定伽马因子（ƴ）至关重要，该因子结合其他校正因子（例如，用于串扰的 α 因子和用于供体激光激发受体的 β 因子），可提高所测染料间距离的准确性。该方法通过两种设计的双链 DNA 标准样品进行了验证，与预期值相比，测得距离的准确性达到约 1 Å。

不同的染料选择需要调整显微镜的光学元件，例如二向色镜和带通滤光片，以匹配所选染料的合适光谱窗口。相应地，也需要选择合适的脉冲激光器。更重要的是，染料的选择至关重要，因为可能存在多种光物理伪影，例如受体和供体漂白、三重态或染料...

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披露

所有作者声明，他们对本文内容不存在任何竞争性经济利益。

致谢

VJ 和 HS 感谢美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM094246 项目对 VJ 的资助。HS 感谢克莱姆森大学创意探究项目（Creative Inquiry Program）以及克莱姆森大学光学材料科学与工程技术创新中心（Center for Optical Materials Science and Engineering Technologies）提供的启动资金。本项目还获得了墨西哥湾海岸联盟（Gulf Coast Consortia）跨学科生物科学培训凯克中心（Keck Center for Interdisciplinary Bioscience Training）培训奖学金（NIGMS 资助编号：1 T32GM089657-05）以及 Schissler 基金会常见人类疾病转化研究奖学金对 DD 的资助。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
活性炭Merck KGaAK42964486 320
注射器滤器Fisherbrand09-719C孔径：0.20 µm
多孔盖玻片Fisher Scientific1554091.5 硼硅酸盐玻璃，8 孔
显微镜盖玻片Fisher Scientific063014-9尺寸：24 × 60-1.5
无核酸酶水Fisher Scientific148859无核酸酶
吐温-20Thermo Scientific2832010% 聚山梨酯 20 溶液
受体 DNA 链（高 FRET）Integrated DNA Technologies1781248955´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
受体 DNA 链（低 FRET）Integrated DNA Technologies1779564245´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
供体 DNA 链Integrated DNA Technologies1779514375´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA 链（无 FRET）Integrated DNA Technologies5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
PCR 仪EppendorfE6331000025nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 MaleimideThermo ScientificA10254文中称为青绿色荧光团
Alexa Fluor 647 C2 MaleimideThermo ScientificA20347文中称为远红荧光团
罗丹明 110Sigma-Aldrich83695-250MG
罗丹明 101Sigma-Aldrich83694-500MG
LB 培养基（Miller 配方）Fisher ScientificBP1426用于培养 E. coli
氨苄青霉素Sigma-AldrichA0166在选择性 LB 培养基中终浓度为 100 µg/mL，用于维持质粒筛选
四环素 Calbiochem58346在选择性 LB 培养基中终浓度为 12.5 µg/mL，用于维持 Origami B(DE3) 菌株中的 gor（谷胱甘肽还原酶）突变，以促进二硫键氧化
卡那霉素Fisher ScientificBP906-5在选择性 LB 培养基中终浓度为 15 µg/mL，用于维持 B(DE3) 菌株中的 trxB（硫氧还蛋白还原酶）突变，以促进二硫键氧化
Origami B(DE3) 感受态细胞Millipore70837-3适用于表达含二硫键蛋白的 E. coli 感受态细胞
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）Fisher ScientificBP1755用于诱导 E. coli 蛋白表达
HiTrap Chelating HPGE Life Sciences17-0409-01用于大规模 FPLC 纯化带 His 标签的蛋白
咪唑Sigma-Aldrich56749
Ni-NTA 琼脂糖 Qiagen30210
PD-10 脱盐柱GE Life Sciences17-0851-01
AktaPurifierGE Life Sciences28406264FPLC 仪器
透析袋Spectrum labs132562截留分子量 15 kD，扁平宽度 24 mm，10 米/卷
二向色镜SemrockFF500/646-Di01-25x36500/646 BrightLight
50/50 偏振分光棱镜Qioptiq Linos G33 5743 00010 × 10 薄膜偏振片
绿色通滤光片ChromaET525/50mET525/50m，25 mm 直径安装座
红色通滤光片ChromaET720/150mET720/150m，25 mm 直径安装座
功率计ThorLabdPM200
紫外-可见分光光度计VarianCary300Bio
Fluorolog 3 荧光计HoribaFL3-22-R3
Fluorohub TCSPC 控制器HoribaFluorohub-B用于整体测量的 TCSPC 电子设备
NanoLed 485LHoriba485L蓝色二极管激光器
NanoLed 635LHoriba635L红色二极管激光器
Olympus IX73 显微镜OlympusIX73P2F显微镜主体
PMA 40 混合探测器PicoQuant GmbH932200, PMA 40优化用于绿色荧光检测
PMA 50 混合探测器PicoQuant GmbH932201, PMA 50优化用于红移灵敏度检测
485 nm 激光器PicoQuant GmbHLDH-D-C-485
640 nm 激光器PicoQuant GmbHLDH-D-C-640
Hydraharp 400 及 TTTR 采集软件PicoQuant930021皮秒事件计时器及时间相关单光子计数单元，包含 TTTR 采集软件
SEPIA II SLM 828 及 SEPIA 软件PicoQuant910028用于皮秒脉冲的激光驱动器，包含 SEPIA 软件控制器
计算机Delloptiplex 7010CPU：i7-3770，内存：16 GB
FRET 定位与筛选（FPS）软件Heinrich Heine University包含可在 http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html 获取的可及体积计算器
MFD 套件Heinrich Heine University包含 BIFL 软件包 Paris；Margarita 用于多参数直方图可视化，以及可在 http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html 获取的概率分布分析软件

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NMDA

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