方法文章

全细胞电压钳记录的电生理学方法 果蝇 光感受器

17K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/55627

⸱

2017年6月13日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

Drosophila melanogaster 光感受器的全细胞记录可用于测量在不同条件下产生的自发性暗脉冲、量子脉冲、对光的宏观反应以及电流-电压关系。结合 D. melanogaster 的遗传操作工具，该方法可用于研究普遍存在的肌醇脂质信号通路及其靶标——TRP 通道。

摘要

全细胞电压钳记录 黑腹果蝇 光感受器已经彻底改变了无脊椎动物视觉转导领域，使得利用 D. melanogaster 分子遗传学用于在单分子水平上研究肌醇脂质信号传导和瞬时受体电位（TRP）通道。少数实验室已掌握这一强大技术，可在高度受控条件下分析光引起的生理反应。该技术可精确控制细胞内和细胞外溶液环境、膜电压，以及快速向细胞内和细胞外环境施加药理学化合物，例如多种离子或pH指示剂。由于具有极高的信噪比，该方法能够检测暗态下的自发性及光诱导的单通道电流。即 自发量子脉冲和宏观光诱导电流（LIC）来自单个 D. melanogaster 感光细胞。本方案详细阐述了执行该技术所需的全部关键步骤，包括电生理记录和光学记录。用于获取完整且具有活性的果蝇视网膜的解剖步骤 离体 描述了将分离的单个小眼置于浴槽室中的方法。同时详细说明了进行全细胞记录和荧光成像测量所需的设备。最后，解释了在长时间实验中使用这种精细制备样本时可能遇到的困难。

引言

对果蝇的广泛遗传学研究 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）黑腹果蝇（D. melanogaster），始于100多年前，已确立了 D. melanogaster 果蝇作为解析复杂生物过程的遗传机制的一种极为有用的实验模型。以下所述方法结合了已积累的强大遗传工具之力 D. melanogaster 分子遗传学与高信噪比的全细胞膜片钳记录技术相结合。这种组合方法可用于研究 D. melanogaster 将光转导作为肌醇脂质信号传导以及TRP通道调控与激活的模型，研究其在天然环境及单分子最高分辨率下的机制。

全细胞记录法的应用 D. melanogaster 光感受器的研究极大地推动了无脊椎动物光转导机制的探索。该方法由 Hardie 建立。1 以及由 Ranganathan 及其同事独立完成2 约26年前设计，旨在利用广泛存在的遗传操作工具 D. melanogaster 并利用它们揭示光转导和肌醇脂质信号传导的机制。最初，该技术存在光照敏感性迅速下降以及解剖过程中小眼单位（ommatidia）得率较低的问题，限制了深入的定量研究。随后，在膜片钳电极内添加ATP和NAD后，显著提高了样本用于长时间定量记录的适用性。自此，得以在分子水平上对信号转导机制进行系统而深入的表征。

目前， D. melanogaster 光转导是少数几个可以研究磷脂酰肌醇信号通路和TRP通道的系统之一 离体 在单分子分辨率下。这使得 D. melanogaster 光转导及其研究该机制所开发的方法是一种高度敏感的模型系统。本方案描述了如何解剖该 D. melanogaster 视网膜，并从周围的色素（胶质）细胞中机械分离出单个小眼。这有助于在感光细胞体上形成吉伽封接和全细胞膜片钳记录。幸运的是，大多数信号蛋白局限于小眼体，不会发生扩散。此外，存在一种不移动的 Ca2+ 位于信号区室与细胞体之间的一种名为calphotin的缓冲区3,4，以及Na的高表达水平+/Ca2+ 微绒毛中的交换蛋白（CalX）5蛋白在小网膜中的限制性定位、钙调蛋白缓冲系统以及CalX的高表达共同作用，使得相对较长的（即 长达约20分钟的全细胞记录，同时不丢失光转导过程的关键组分，并保持对光的高敏感性。以下方案描述了如何获取分离的单个小眼并进行全细胞记录，该记录方法似乎可保留光转导级联反应的天然特性。对分离的蟑螂（Periplaneta americana)6 和蟋蟀（Gryllus bimaculatus)7 小眼的处理方法与所描述的方法类似 D. melanogaster此外，对锉蛤（file clam）离体感光细胞进行的膜片钳实验表明，Lima scabra）和扇贝（Pecten irradians) 的操作方式与之前进行的略有不同 D. melanogaster，允许全细胞8 和单通道测量9. 本文综述了在该领域取得的主要成果 D. melanogaster 使用该技术的注意事项进行了描述。讨论部分包含了对该技术一些潜在问题和局限性的说明。

方案

1. 试剂制备

注意：请根据表1-4中的说明配制所有溶液。

  1. 用细胞外液（ES 或 ES-0Ca）填充一支 10 mL 注射器2+；根据需要；参见 表1并将它置于冰上保存。
  2. 准备一管裂解液（Trituration Solution，TS；参见 表 2; 即 ES 或 ES-0Ca2+ + FBS 和蔗糖），并置于冰上。
  3. 为实验准备足够的ES，并将其置于冰上保存，直至使用。
    注意：无需持续灌流，因此ES的体积无需超过几十毫升。
  4. 使用一个 22 µm PVDF滤膜，加入细胞内液（参见 表3 或 表 4) 转移至带有电极填充细长尖端的1 mL注射器中，置于冰上保存。

2. 解剖工具的通用设置

实验室显微注射装置：移液管、工具、体视显微镜、精密操作设备
图1：制备分离的小眼所需工具与装置 图片展示了如上述详细方案中所述，制备分离小眼所需的各类设备。两个烧杯，其中一个盛有水 (A）另一个装有乙醇（B用于清洗吹打移液管的）D），连接至导管（C）。解剖工具包括：2 把精细镊子和 1 把粗镊子（F）和视网膜刮匙（retina scooper）E）。为了制备视网膜刮取器，需使用显微解剖针（H）被夹在两个作为虎钳使用的车床工具之间（G）以压平针头的顶端（I）。然后使用胶水将其连接到一块细长的金属上（J）并安装到针持上（E）。刀片碎片及刀片架：使用刀片架折断并安装一小块三角形的刀片碎片（K）。解剖工作区域由一个双目（L）和一个冷红光源（（M)）配有两个导光管（N）。解剖工具包括镊子（F），视网膜刮匙（E），烧杯（A 和 B），带红色滤光片的手电筒（Q）以及精密擦拭纸（R) 置于双目镜两侧。一个冰桶内装有 ES、FBS-ES、细胞内液注射器以及 60 mm 培养皿（S）以及电极夹持器（P）也放置在桌面上。使用水平拉制仪制备记录电极。T). 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 构建视网膜刮取器以分离视网膜。
    1. 将显微解剖针（昆虫学用针，12 mm 长，0.1 mm 直径）的尖端（1–4 mm）插入两个虎钳钳口之间，用小锤轻敲压平。
    2. 将压平的针固定在显微解剖针夹持器上（参见 材料表).
    3. 使用一对镊子将针的扁平端弯曲，形成一个曲率约为2.5 mm的钩状结构。
  2. 制作用于小眼分离的吹打移液管。
    1. 将一根直径1.2 × 0.68 mm（外径 × 内径）的玻璃毛细管置于明火上，灼烧抛光以缩小其开口。
    2. 在显微镜下测量毛细管开口的大小。根据开口尺寸将制备的复眼研磨移液管分为七组（即 0.2-0.5 mm）。将它们分别存放于合适的容器中（例如 试管）
    3. 将一个小型烧杯装入双蒸水（DDW），另一个小型烧杯装入70%乙醇。用石蜡膜覆盖每个烧杯。
    4. 在覆盖去离子水烧杯的石蜡膜上打一个小孔（参见 图1A).
    5. 在覆盖乙醇烧杯的石蜡膜片上打七个直径较小的孔，并将孔按 0 到 6 编号（参见 图1B).
    6. 将每组不同规格的复眼研磨移液管各取一支，放入每一张石蜡膜的孔中，使开口最大的移液管位于0号孔th 孔，且移液管开口最小的位于6th 孔
    7. 连接一根塑料管 200 µL 将移液器吸头连接至一段长35 cm、外径×内径为1.57 × 1.14 mm的聚乙烯管。将管子的另一端连接至一个具有最大开口的复眼组织研磨移液器即 0.46 - 0.5 mm），确保吹打移液管的尖端不朝向管路内部。
  3. 使用外径1 mm、内径0.58 mm的含丝硼硅酸盐玻璃毛细管，经拉制制成全细胞记录用膜片钳电极。
    注意：使用基于葡糖酸钾的细胞内液（IS1）时，玻璃微电极的电阻应为 8–15 MΩ。可使用任何合适的膜片钳电极拉制仪（例如，参见 材料表）。火焰抛光并非必要步骤。
  4. 准备记录室（参见 图2) 通过固定盖玻片（参见 材料清单使用融化的石蜡或高真空硅脂将浴槽室固定到底部。可采用任何合适的自制或商用腔室，确保电极可进入并能进行灌流。
  5. 将灌流浴槽安装在倒置显微镜的载物台上。放置灌流系统管道、吸引系统和接地线即 Ag-AgCl导线/颗粒）放入浴液中（参见 材料表 和 图2).
  6. 放置两对精细的 #5 镊子（图1在视网膜解剖和小眼单位分离步骤中，将工作表面所需物品放置到位以备使用。

3. D. melanogaster 培养

  1. 提升 D. Melanogaster 低种群密度下的果蝇（即 约20只果蝇置于含标准玉米粉培养基的6盎司瓶中，在19-24 °C.
    注意：最好使用暗适应的果蝇进行实验。为保持果蝇对光的高敏感性，减少变异并防止突变体果蝇发生视网膜退化。
  2. 实验前至少将果蝇在黑暗环境中饲养24小时。
    注意：实验所用果蝇应为新近羽化的（<2 小时）且仍处于柔软、颜色较浅并带有胎粪的状态。小眼体也可从蛹中制备，但其对光的敏感性随发育年龄变化显著。10.

4. 视网膜解剖与小眼分离：方案一

注意：所有以下步骤均需在体视变倍显微镜下进行，使用适合清晰观察样本的放大倍数（见图1）。

  1. 加入四滴 ES-0Ca2+ 在已翻转的60毫米培养皿上加入一滴TS溶液。
  2. 使用粗糙的镊子，捕捉一只新羽化的（<羽化后2 h）用翅膀或身体固定果蝇。此后所有操作均需迅速完成，并在20 ± ℃下使用微弱红光进行1 °C.
  3. 用粗镊子夹住果蝇的同时，用第一把细镊子将果蝇头部与身体分离。将头部浸入第一份 ES-0Ca 溶液中2+ 滴
  4. 使用第二把精细镊子沿矢状面将头部切开成两半。确保此步骤结束时，双眼仍保持完整。
  5. 将一半头部组织转移至第二个 ES-0Ca2+ 一半加入到第三份 ES-0Ca 中2+ 滴
  6. 使用精细镊子尽可能去除眼球周围组织，并确保不损伤视网膜。
  7. 用精细镊子牢固夹住一只角膜边缘，用刮匙挖出视网膜。
    注意：完成此步骤后，角膜将保持完整且中空，并与完整的视网膜分离。
  8. 用去离子水冲洗与管路相连的吹打移液管，并用少量 ES-0Ca 填充移液管2+ 从第四滴开始。
    注意：每次使用新的分离小眼移液管并将其从乙醇烧杯中取出时，都必须执行此步骤（移液管内的溶液应与视网膜所处的溶液一致）。
  9. 用嘴轻轻抽吸，使分离的视网膜进入移液管。务必格外小心，避免将气泡吸入移液管中。
  10. 将分离的视网膜转移至TS液滴中。对第二只眼睛同样执行步骤4.6–4.10。
  11. 擦去ES-0Ca液滴2+ 使用精细的擦拭纸，仅在培养皿中留下含有两只视网膜的TS液滴。在培养皿顶部再添加六滴TS溶液。将两只视网膜转移至另一滴TS溶液中。
  12. 更换为开口直径更小的吹打移液管。按照步骤4.8所述方法冲洗，使用TS溶液填充移液管。
  13. 快速反复地将双侧视网膜在溶液中进行抽吸和排出，以启动从完整视网膜中分离去除色素细胞的单个眼小体。
    注意：分离的单眼小眼在TS液滴中可见，随着分离过程的进行，TS液滴的透光性逐渐降低。
  14. 将剩余的视网膜转移至下一个TS液滴中。用移液器吸取前一个TS液滴（含有已分离的小眼），并将该液滴吹入浴槽中。
  15. 重复步骤 4.12–4.14 以获得最大数量的分离小眼。等待约 1 分钟，使分离的小眼沉降并贴附于灌流室底部。
  16. 使用灌流系统，启动无钙ES液的流动2+ 含1.5 mM Ca2+ 注入浴室室。确保腔室从底部到顶部完全充满溶液，且接地部分完全浸没在溶液中。继续清洗浴室4-5次。

5. 视网膜解剖与小眼分离：方案二

注意：所有以下步骤均需在体视变倍显微镜下进行，使用适合清晰观察样本的放大倍数（参见图1）。

  1. 准备一个剃须刀片碎片及其夹持器。使用剃须刀片夹持器折断并安装一小块三角形的剃须刀片碎片（图1）。
  2. 根据制造商的说明准备硅胶解剖皿/块（参见材料表）。
  3. 进行解剖时，在硅胶解剖块上制备一大滴 ES 溶液（<0.5 mL），并在60 mm 培养皿中加入两滴“储存”用的 TS 溶液（每滴约50 µL）。
  4. 将一只刚羽化（羽化后<2小时）的果蝇置于冰上的玻璃管中使其固定，用镊子夹住其翅膀将其取出。自此之后，所有操作均需迅速进行，并在20 ±1 °C条件下于微弱红光照明下完成。
  5. 用镊子夹住果蝇，使用安装在夹持器中的剃须刀片碎片切下果蝇头部。用镊子夹取一根昆虫针（长12 mm，直径0.1 mm），从两眼之间刺入头部。
  6. 将头部短暂浸入70%乙醇中；此举可防止气泡在头/眼表面形成。将头部钉在硅胶解剖皿的ES液滴下。
  7. 使用剃须刀片碎片沿眼部前缘切线方向以锯动方式切下两只眼睛。
  8. 用精细镊子牢固夹住一只角膜边缘。
  9. 用刮勺将视网膜挖出。
    注意：完成此步骤后，角膜将保持完整且为空腔状态，与完整的视网膜分离。
  10. 在不损伤视网膜的前提下，使用镊子和刮勺轻轻去除附着的气囊及多余脑组织。
    注意：分离得到的视网膜可用于非特异性视网膜蛋白的Western blot分析11、整体组织学染色以及全视网膜成像。也可对完整视网膜中的感光细胞进行膜片钳记录12。
  11. 取最大口径的吹打移液管，连接至导管，并通过轻柔吸力（即用嘴）从培养皿中的一个储存液滴吸取少量TS溶液反向填充移液管。每次更换新的小眼吹打移液管时均需重复此步骤。
  12. 用嘴轻轻将TS溶液吹过两个视网膜，然后通过轻柔吸力将分离的视网膜吸入移液管中。操作时需注意避免气泡进入移液管。
  13. 将分离的视网膜转移至培养皿中，形成一小滴（约20 µL），并用其中一个储存液滴中的TS溶液清洗一次或两次。
  14. 将视网膜在避光条件下孵育20–25分钟。
  15. 将小眼吹打移液管更换为开口直径更小的移液管（使用步骤4.6中所述方法，从储存液滴中取新鲜TS溶液反向填充移液管）。
  16. 在一小滴溶液（约20 µL）中快速反复吹吸两个视网膜，以开始分离出独立的小眼单元。
    注意：在初始阶段，周围色素化胶质细胞应发生解体，溶液中可见少量碎片。
  17. 当已有大量细小碎片产生，但尚未有大量小眼分离前，使用储存液滴中的新鲜TS溶液，将视网膜转移至一个新的小液滴中。
  18. 选择更小直径的吹打移液管，反向填充后继续进行吹打操作。
    注意：此时小眼开始分离，在体视显微镜高倍镜下应能清晰观察到其细长形态。如有必要，持续更换更小直径的吹打移液管，直至观察到足够数量的小眼。
  19. 当观察到适量的小眼且液滴不再呈半透明状时，用移液管吸取含有分离小眼的全部液滴，并轻柔地将其吹入已预先充满ES溶液的灌流室底部。
  20. 静置约1分钟，使分离的小眼沉降并附着于灌流室底部。
  21. 使用灌流系统，开始向灌流室中持续流入ES溶液。确保溶液从底部到顶部完全充满灌流室，且接地电极完全浸没于溶液中。继续用ES溶液冲洗灌流室4–5次。
    注意：此后无需持续灌流，但在引入新的膜片钳移液管前应短暂冲洗灌流室。

6. 全细胞记录

用于记录神经信号的显微镜与电子设备组成的电生理实验装置。
图 2：电生理与光学实验装置示意图。 该装置包含一个由铁制成、涂成黑色的法拉第笼（F）。其前侧覆盖有内嵌铜网的黑色帘布。此设计可使实验样品完全隔绝外界杂散光，适用于记录暗环境下的自发性微小电信号（spontaneous bumps）。倒置荧光显微镜（A）固定于防震台（E）上。光感受器记录装置由自制的丙烯酸玻璃浴槽（O）、灌流入口（Q）、吸液移液管（S）以及银-氯化银接地电极（P）组成。浴槽通过自制适配器安装在显微镜载物台（T）上。记录移液管通过银-氯化银导线连接至丙烯酸玻璃固定装置，再接入放大器前置放大器头级（C）。头级安装在一个粗调显微操作器上，而该操作器又固定于精细XYZ机械显微操作器（B）之上。灌流系统（D）由一组注射器构成，液体流速由夹管阀（H）控制。机架上的所有设备均连接至同一中心接地点，其中包括膜片钳放大器（N）、示波器（J）、脉冲/函数发生器（K）、模数转换器（L）、灌流控制器（I）以及滤光轮和快门控制器（M）。在成像实验中，通过侧端口（G）连接一个冷却型（-110 °C，参见材料表）CCD相机。 请点击此处查看该图的放大版本。

注意：在以下所有步骤中，仅使用微弱的红光照明，并确保小眼（ommatidia）暴露于光下的时间最短即 快速操作，并在执行无需观察小眼的任务时关闭用于观察小眼的解剖光源和培养室红色照明。此外，所有后续步骤均应按照标准电生理学实验方案进行。

  1. 在倒置显微镜（40倍物镜）下仔细检查浴液中的所有小眼，选择一个适合实验的小眼。
    1. 确保小眼的外膜光滑且完整，其长轴方向与电极接近方向大致呈直角（如图所示） 图3A），并确保小眼的远端部分周围无任何多余组织。将选定的小眼置于物镜光轴上（视野中心），以保证 illumination 均匀。
  2. 用细胞内液（IS1 或 IS2）填充膜片电极。
    注意：测量强度反应和量子 bumps 分析时，使用 IS1；测量光敏通道的反转电位时，使用 IS2。
  3. 将膜片电极安装到电极夹持器上。
  4. 通过连接电极夹的管道用嘴向移液管吹气，使其内部充满正压。关闭管道阀门以维持压力。
  5. 使用显微操作器将电极插入浴槽室中。
  6. 将电极引导至小眼的远端区域附近，确保电极与小眼之间无接触，直至在小眼中观察到一个小凹陷（由膜片钳电极内的正压所致）。
  7. 打开记录软件（参见 材料表）打开“膜测试模块”，以100 Hz的频率施加2 mV的连续方波电压脉冲。
  8. 将膜片钳放大器上的相应旋钮调节至“零”，使方波脉冲基线的结电位为“零”电流
    注意：电生理装置包括一个前置放大器（head stage）即 第一轮扩增）连接至放大器（即 第二轮扩增）。放大的模拟信号通过模数转换器（A/D转换器）转换为数字信号，该转换器由安装在个人计算机上的软件控制。
  9. 打开与电极架相连的管路阀门，释放移液管内的正压。通过吸出管路中的液体，轻柔地在移液管内形成负压，促使移液管与细胞膜贴附。关闭管路阀门以维持负压状态。
  10. 确保在计算机屏幕上观察到的电极电阻升高至 100 - 150 MΩ。通过手动打开连接电极夹持器的管路阀门，释放移液管内的负压。
  11. 确保电极电阻升高至至少1-2 GΩ。
    注意：此时，电极与感光细胞之间已形成封接。
  12. 通过调节膜片钳放大器中的相应旋钮来补偿移液管的电容电流。
  13. 通过连接至电极夹持器的导管用嘴吸气，在电极内产生快速、短暂且有力的负压脉冲，以“击穿”感光细胞膜，形成全细胞记录构型。或者，可使用“Zap按钮”施加短暂的矩形电脉冲，起始持续时间为“0.1 ms”，亦可结合使用上述两种方法。
    注意：全细胞构型的形成表现为移液管电容的突然增加（对于野生型R1-6感光细胞，电容通常约为60 pF；若电容仅为约20 pF，表明记录来自R7感光细胞；若电容超过约90 pF，则表明记录来自两个感光细胞）。
  14. 将光电感受器的钳制电位手动调节至所需电压（通常为 -70 mV），使用膜片钳放大器上的相应旋钮进行操作。
    注意：此步骤可在形成封接后（步骤 6.11）且在达到全细胞记录构型之前进行。
  15. 补偿电容电流和串联电阻（测得的串联电阻值大于25 MΩ表明电极移液管已堵塞），并根据需要（即 对于较大的电流，使用膜片钳放大器上的相应旋钮进行串联电阻补偿。
  16. 关闭法拉第笼的黑色前帘，以获得最大程度的黑暗和电隔离。
  17. 使用软件开始记录过程，并根据所需的实验方案给予光刺激和/或药物物质。

7. 全细胞记录与Ca2+成像的同时进行

  1. 对于基因编码的 Ca2+ 指示剂，使用表达 GCaMP6f13 的 D. melanogaster 果蝇，按上述方法分离小眼。采用 CCD 相机（见材料表）进行荧光检测，并确保显微镜配备适当的激发和发射滤光片以及二向色镜（见材料表）4。
  2. 对于外源性 Ca2+ 指示剂的应用（图4；见材料表），按上述方法分离小眼。此外，确保移液管溶液中含有 20–100 µM 的钙指示剂。
  3. 使用成像软件（见材料表）以 40 Hz 的速率采集图像。在持续 10 秒的暗期后，进行持续 2 秒的强光刺激，并在此期间完成图像采集。
  4. 使用成像软件定义感兴趣区域（ROI），测量该区域内的荧光强度。对暗期荧光强度（FD）取平均值，并从光刺激期间的荧光记录值（FL）中减去该值（FL−FD）。根据光刺激开始时的荧光强度（FL0）对这些测量值进行归一化处理。

结果

在特定条件下，该方法实现了对自发产生和光诱导量子突跃（quantum bumps）的基本单通道电流的精确记录，这些电流叠加后形成对光的宏观反应。该方法还允许比较野生型与关键信号分子存在缺陷的突变型果蝇（图3 和 图5）14,15,16,17,18。此外，在双离子条件下测量反转电位的能力揭示了TRP和TRP样（TRPL）通道的基本生物物理特性18,19。该方法还实现了对TRP通道孔区氨基酸替换所引起的Ca2+通透性改变效应的测量20。

全细胞膜片钳记录获得的光反应在至少4个数量级的光强范围内与光强度呈线性关系。这一特性无法通过视网膜电图（ERG）和细胞内记录方法解析。因此，通过一系列强度递增的短暂闪光刺激所得到的反应，以及绘制的光强-反应函数曲线，揭示了闪光反应随光强增加而呈现严格的线性关系。这种严格的线性关系可维持至数百皮安（pA）水平，但在此之后，究竟是线性关系本身发生偏离，还是电压钳制能力丧失，尚存争议。图6）。这些结果表明，光的宏观反应是光的单个反应的线性叠加（即 量子 bumps

已有电压记录研究明确证实，弱光刺激会引发离散的电压波动（即 量子 bumps）在大多数无脊椎动物物种中。 D. melanogaster 量子 bumps 源于在 bump 峰值时约 15 个 TRP 通道和约 2 个 TRPL 通道的协同开放18每个隆起由单个光子的吸收产生，而对较强光线的宏观反应则是这些基本反应的总和14,21. 即使在刺激条件相同的情况下，这些感受野的潜伏期、时间进程和振幅也存在显著差异。感受野的产生是一个符合泊松统计的随机过程，其中每个有效吸收的光子仅引发一个感受野。单光子-单感受野的关系要求级联反应中的每一步不仅包含高效的“开启”机制，还必须具备同样高效的“关闭”机制。这种机制的功能优势在于能够产生一种极为敏感的光子计数器，并具有快速的瞬时响应特性，非常适合视觉系统对敏感性和时间分辨率的要求。当活性光敏色素（即 变视紫红质，M）或其靶标 Gqα无法失活，导致在光照关闭后仍持续产生感光小体图3)15,22,23,24 .

凸起代表微绒毛中TRP/TRPL通道的协同活动。因此，任何关于通道激活的假说都应同时解释通道的协同激活机制。最近，Hardie及其同事已证明光会引发感光细胞的快速收缩，提示光敏感通道（TRP/TRPL）可能是机械门控的25。这种机械激活，加上磷脂酶C介导的PIP水解所释放的质子，2 水解，促进TRP/TRPL通道的开启，并解释光感受器小事件（bump）产生的协同性26目前， D. melanogaster 光感受器是少数几个可以研究磷脂酰肌醇信号通路和TRP通道的系统之一 体内因此使得 D. melanogaster 光转导及用于研究该机制的方法是一种极具价值的模型系统。

光感受器反应图；电生理学，多种突变；比较突触活性。
图3：inaCP209 和 inaDP215 突变体揭示了宏观光反应及单量子 bumps 反应终止的缓慢特性。 (A使用填充有荧光染料Lucifer Yellow CH（激发波长：430 nm；发射波长：540 nm）的膜片钳电极对分离的小眼制备进行全细胞记录时的图像。请注意，荧光染料已扩散并标记了一个单一的感光细胞胞体，且感光细胞胞体虽已与其细长的轴突分离，但仍保持活性。该制备适用于同时进行全细胞记录与成像实验。B-D上图：在持续弱光（空心条）下，野生型（WT）的全细胞电压钳制量子 bumps 反应 inaCP209，以及 inaDP215 突变果蝇中观察到光感受器反应的缓慢终止。 inaCP209 和 inaDP215 与野生型果蝇相比的突变体。下方插图为单个光感受器反应（bumps）的放大形状。底部图示：全细胞记录的宏观反应在500毫秒光脉冲（1.5 x 105 每秒光子数（photons per s）的野生型和突变型果蝇。 （E-G） 上图：全细胞电压钳记录的野生型量子 bumps 对短暂（1 毫秒）、微弱光刺激（引发单光子反应）的响应 arr23，以及 ninaCP235 突变果蝇。注意观察到的一系列隆起。 arr23 和 ninaCP235 突变果蝇在吸收单个光子后的反应。下图：全细胞电压钳制下对500 ms光脉冲（1.5 × 104 光子/秒）在相应突变体中的变化。注意在宏观反应中观察到的终止过程较慢的现象。 arr23 和 ninaCP235 突变果蝇相对于野生型。 请点击此处以查看此图的放大版本。

不同光照时间下野生型与Cpn1%的荧光寿命显微成像；发射光分析。
图 4：信号诱导的 Ca2+ 内流后细胞内 Ca2+ 动态变化受Calphotin影响。 对野生型和 Cpn1% 果蝇感光细胞在光照刺激过程中 Ca2+ 指示剂荧光信号的时间序列图像。原始荧光强度图像采用伪彩色编码表示（比例尺 = 10 µm；箭头指示移液管）。图示经 Weiss et al.4 许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

野生型与trp突变型果蝇的电流轨迹电生理图；电压阶跃方案。
图5：野生型、trp突变体和trpl突变体的电生理特性。 (A) 连续弱光（开放条形表示光照期）下WT和trpl突变体中量子突触电流的全细胞电压钳记录302和 trpP343 无突变体果蝇。振幅显著降低的 trpP343 观察到突起。插图：野生型和单个量子突起的放大图 trpP343 显示了无效突变体果蝇。B) 对野生型及相应突变体施加3秒光脉冲后的全细胞电压钳记录。瞬态稳态反应的 trpP343 突变体被观察到。插图：野生型（WT）和突变体的放大光反应 trpP343突变体如图所示。 (C) 上述果蝇品系在20 ms光脉冲刺激下诱发的叠加光诱导电流家族，于反转电位（E）附近以3 mV电压步长记录的电流响应翻转). (D) 绘制平均 E 的直方图翻转 野生型及各种突变体。误差条表示标准误（S.E.M.）。反转电位（Erev野生型（WT）的正值E之间rev 的 trpl302，该细胞仅表达TRP，以及E翻转 的 trpP343 null突变体，仅表达TRPL。 请点击此处以查看此图的放大版本。

显示光电流（皮安）与光子计数呈线性叠加的光子响应图。
图 6：闪光响应与光强增加呈严格线性关系。
一系列对强度递增的短暂闪光刺激所产生的电流反应，以及光反应峰值幅度随短暂闪光强度增加的变化关系图。该关系表明，闪光响应与光强增加之间存在严格的线性关系。这种严格的线性关系至少可维持至数百皮安（pA）范围内，光强跨度超过四个数量级；在此之后，究竟是线性关系被破坏，还是电压钳制控制失效，尚存争议。请点击此处查看该图的放大版本。

pH7.15（用 NaOH 调节）
试剂浓度 (mM)
NaCl120
KCl5
MgCl24
TES10
脯氨酸25
丙氨酸5
在 -20 °C 下保存。
注：该溶液名义上为无 Ca2+ 溶液，但未添加 Ca2+ 缓冲剂，因此含有约 5 - 10 µM 的痕量 Ca2+。细胞外液（ES）= 在 ES-0Ca2+ 中加入 1.5 mM CaCl2 制成，可通过将 0.5 M 或 1 M 储存液的 CaCl2 加入 ES-0Ca2+ 获得。

表1：Ca+2无细胞外液（ES） 化学描述及制备 Ca 所需的具体用量+2无ES

试剂用量
FBS15 mL
sucrose1.5 g
分装为每管150 µL，置于1.5 mL离心管中，于-20 °C保存。
吹打溶液（TS）取1管150 mL的储存液，加入1,350 mL ES或ES-0Ca2+溶液进行稀释，所用溶液应与解剖过程中使用的溶液一致。

表2：胎牛血清（FBS）+蔗糖——储备液。 配制胎牛血清（FBS）+蔗糖储备液所需的化学试剂及其具体用量。

pH7.15（用 KOH 调节）
试剂浓度 (mM)
葡萄糖酸钾 (Kglu)140
MgCl22
TES10
三磷酸腺苷镁盐 (MgATP)4
三磷酸鸟苷钠盐 (Na2GTP)0.4
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物 (NAD)1
于 -20 °C 保存。

表3：细胞内溶液（IS1）。 化学成分及配制IS1所需的特定用量，该溶液主要用于强度反应和量子 bumps 测量。

pH7.15（用CsOH调节）
试剂浓度（mM）
CsCl120
MgCl22
TES10
ATP镁盐（MgATP）4
GTP钠盐（Na2GTP）0.4
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物（NAD）1
四乙基氯化铵（TAE）15
于-20 °C保存。

表4：细胞内溶液（IS2）。 化学成分及配制主要用于光诱导电流反转电位测量的细胞内溶液IS2所需的特定用量。

讨论

对黑腹果蝇（D. melanogaster）感光细胞应用全细胞记录技术，使得研究人员能够发现并阐明多种新型信号蛋白的功能，例如TRP通道27,28,29以及INAD30,31,32支架蛋白。自该技术首次引入以来，它推动解决了有关光反应的离子机制及其电压依赖性的长期基础科学问题。这得益于该技术能够精确控制细胞膜电压以及细胞外和细胞内的离子组成19,28。

在 D. melanogaster 中应用膜片钳技术的主要障碍之一是分离出的小眼（ommatidia）制备物极为脆弱。详细研究表明，光转导机制的完整性严重依赖于ATP的持续供应，尤其是在光照条件下，此时ATP消耗量巨大。然而，为了使膜片钳电极能够接触到感光细胞膜，必须机械剥离色素细胞（即 胶质细胞），而这一步骤会消除ATP生成所需代谢物的主要来源33。通过记录电极向细胞内施加外源性ATP仅能部分满足大量ATP的需求。ATP的短暂缺乏会导致TRP通道的自发激活，并使光转导机制与光激活通道解偶联，从而引起细胞内Ca2+浓度显著升高，并完全消除对光的正常反应34,35。这一系列事件并非由解剖操作对感光细胞造成的机械损伤所致，而是由于细胞内ATP耗竭所引起。为防止此类情况发生并维持正常的光反应，应避免将感光细胞暴露于强光下，因为强光会大量消耗ATP。此外，记录电极液中必须包含NAD，推测其作用是促进线粒体内的ATP生成18,36。在记录自发性量子 bumps 和单光子反应时，上述问题影响较小，因为仅使用弱光刺激。实际操作中，稳定的全细胞记录通常可维持约20–25分钟，尽管在此期间反应动力学会逐渐变慢。一批分离的小眼制备物在体外最多可保持活性达2小时。

分离小眼制备方法的另一个缺点是微绒毛无法接近，这导致记录电极难以接触到TRP和TRPL通道，从而无法进行单通道记录。Bacigalupo及其同事利用他们开发的一种方法，成功地直接记录到来自感杆（rhabdomere）的单通道活动37。然而，这种通道活动与在组织培养细胞中异源表达的TRPL通道活动38以及通过噪声分析从分离小眼中获得的TRP通道活动34均不相同。推测使用该方法时，解剖过程对感光细胞造成了严重损伤。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究的实验部分得到了以下机构的资助：美国-以色列双边科学基金会（授予 B.M. 和 I.L.）、以色列科学基金会（ISF）、德意志-以色列项目合作组织（DIP）（授予 B.M.），以及生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC 资助编号：BB/M007006/1 和 BB/D007585/1）（授予 R.C.H.）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mL 注射器
5 mL 注射器
带细长针头的1 mL注射器
培养皿60 mm
注射器滤器Millex22 µm PVDF 滤膜 
毛细管（用于小眼分离）玻璃，1.2 x 0.68 mm（每根约7.5 cm）
聚乙烯管Becton Dickinson1.57 × 1.14 毫米（35 厘米）
 2 个小型烧杯50 mL 或更少
2片石蜡膜Parafilm M约 5 x 5 厘米
浴槽室自制
盖玻片22 x 22 mm No. 0
Paraplast PlusSigma石蜡 – 聚异丁烯混合物将盖玻片粘附至灌流腔底部
地面Warner Instruments 64-1288杂交组装银-氯化银纳米线阵列
无头显微解剖针昆虫学，12 mm
显微解剖针持
夹具
2 把精细镊子 + 1 把粗糙镊子Dumont #5，生物学 0.05 × 0.02 mm，长 110 mm，Inox
体视变倍显微镜 尼康SMZ-2B
冷光源SchottKL1500 LCD
冷光源滤光片（彩色）SchottRG620
精密擦拭器KimtechKimwipes
电极夹 holderWarner InstrumentsQSW-T10PQ系列支架，适用于Axon放大器，直筒式设计
银线Warner Instruments0.25 mm 直径，需进行氯化处理
显微操作仪Sutter InstrumentsMP 85休斯利-沃尔式显微操作器
法拉第笼自制电磁噪声屏蔽与黑色前帘
防振台纽波特VW-3036-OPT-01
示波器GWGOS-622G
灌注系统华纳仪器VC-8P夹管阀控制系统
灌注阀控制器科学仪器BPS-8
吸力系统
放大器分子装置Axopatch-1D
前置放大器分子装置CV - 4增益：x 1/100
模数转换器分子装置Digidata 1440A
Clampex分子装置10软件
pCLAMP分子装置10软件
光源（氙弧灯）Sutter InstrumentsLambda LS
光检测器自制光电晶体管
滤光轮和快门控制器Sutter InstrumentsLambda 10-2 配备 Uniblitz 快门
滤光片（中性密度滤光片）染色6,5,4,3,2,1,0.5,0.3
滤光片（彩色）SchottOG590，边缘滤光片
氙闪光灯系统Dr. Rapp OptoElecftronicJML-C2
光导石英 
脉冲发生器AMPI掌握 8
显微镜OlympusIX71，倒置显微镜
显微镜用红色照明滤光片RG630 / RG645 ø45 mm
显微镜物镜奥林巴斯X60/0.9 UplanFL N 空气物镜或 X60/1.25 UplanFI 油镜
CCD相机AndoriXon DU885K
NIS Element 尼康雄激素受体软件
Ca+2 指示剂Invitrogen钙绿5N
激发 &和发射滤光片及二向色镜染色19002 - AT - GFP/FITC 长通滤光片组
垂直式移液器拉制仪Narishige 模型 PP83根据个人偏好选择使用垂直或水平拉制仪。
水平拉管仪Sutter Instrument Model P-1000 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪
丝状结构Sutter Instrument3 mm 槽或方盒
毛细血管哈佛仪器硼硅酸盐玻璃毛细管1 × 0.58 mm

参考文献

  1. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).
  2. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  3. Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).
  4. Weiss, S., et al. Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration. J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).
  5. Wang, T., et al. Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX. Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).
  6. Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation. J. Physiol. Lond. 440, (1991).
  7. Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).
  8. Nasi, E. Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra. J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).
  9. Nasi, E., Gomez, M. P. Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians. J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).
  10. Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).
  11. Kohn, E., et al. Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo. J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).
  12. Hevers, W., Hardie, R. C. Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors. Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).
  13. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  14. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).
  15. Scott, K., Zuker, C. S. Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses. Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).
  16. Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors. J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).
  17. Katz, B., Minke, B. Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors. J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).
  18. Hardie, R. C., et al. Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase. Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).
  19. Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL. Neuron. 19, 1249-1259 (1997).
  20. Liu, C. H., et al. In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel. J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).
  21. Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).
  22. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  23. Liu, C. H., et al. Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III. Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).
  24. Cook, B., et al. Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo. Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).
  25. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  26. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).
  27. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).
  28. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  29. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  30. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  31. Shieh, B. H., Niemeyer, B. A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila. Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).
  32. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  33. Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina. J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).
  34. Hardie, R. C., Minke, B. Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).
  35. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  36. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
  37. Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
  38. Parnas, M., Katz, B., Minke, B. Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel. J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

TRP ES

相关文章