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方法文章

在卵内 鸡听觉脑干中的电穿孔技术

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DOI：

10.3791/55628

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2017年6月9日

 ,  , 
1Roxelyn and Richard Pepper Department of Communication Sciences and Disorders, Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center, Northwestern University, 3Department of Neurobiology, Northwestern University

本文内容

摘要

鸟类和哺乳动物的听觉脑干神经元专门负责快速神经编码，这是正常听觉功能的基本过程。这些神经元起源于胚胎后脑的不同前体细胞。本文介绍了利用电穿孔技术在鸡胚后脑中表达基因的方法，以研究基因在听觉发育过程中的功能。

摘要

电穿孔是一种将目的基因导入鸡胚等具有生物学意义的生物体内的方法。长期以来，鸡胚一直被公认为研究听觉系统发育基本生物学功能的有效研究模型。近年来，鸡胚在研究与听觉相关的基因表达、调控及功能方面变得尤为有价值。在体电穿孔可用于靶向负责高度特化听觉功能的听觉脑干区域，这些区域包括鸡的巨细胞核（NM）和层状核（NL）。NM和NL的神经元起源于菱脑节5和6（R5/R6）的不同前体细胞。本文介绍了通过在体电穿孔将质粒编码的基因导入上述区域，以研究与基因相关的特性。我们展示了一种可实现基因表达时空控制的方法，从而促进功能表型的获得或缺失。通过靶向与R5/R6相关的听觉神经前体区域，我们实现了在NM和NL中的质粒转染。通过采用tet-on载体系统，可实现基因表达的时间调控。这是一种药物诱导方法，在多西环素（Dox）存在的情况下表达目的基因。在体电穿孔技术结合生化、药理学或在体功能检测，为研究听觉神经元发育及相关病理生理现象提供了一种创新性方法。

引言

声音的快速神经编码对于正常的听觉功能至关重要。这些功能包括声音定位能力1、噪声中语音分辨能力2，以及其他具有行为学意义的通信信号的理解3。在鸟类和哺乳动物的听觉脑干中，存在功能类似的神经元，它们高度特化于快速神经编码4。这些神经元包括鸡的巨细胞核（nucleus magnocellularis, NM）、层状核（nucleus laminaris, NL），以及它们在哺乳动物中的对应结构——耳蜗腹前核（anteroventral cochlear nucleus, AVCN）和内侧上橄榄核（medial superior olive, MSO）5。然而，调控听觉脑干中快速神经编码的发育机制尚不明确。因此，研究负责快速神经编码的特定基因，有助于更深入地理解这些基因在听觉发育过程中的表达、调控及其功能。

发育中的鸡胚是研究听觉系统发育基本生物学问题的一种有效且成熟的实验工具6,7近年来，分子技术的进步通过在发育中的鸡胚中表达或敲低目标基因，以分析相关生物学问题 体内 基因功能8,9研究特定基因的调控作用是在理解与听觉功能障碍相关病理机制方面的重要进展。本文介绍 在卵内 将质粒编码的基因电穿孔至鸡听觉脑干中发生快速声音神经编码的区域10通过靶向与菱脑节5和6相关的听觉神经前体区域11,12 （R5/R6），我们展示了在NM和NL中对质粒转染的空间控制。此外，通过采用tet-on载体系统，实现了基因表达的时间调控。这是一种药物诱导方法，在存在多西环素（Dox）的情况下表达目的基因。8.

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方案

所有实验程序均经西北大学机构动物照护与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》进行。

1. 卵的处理

  1. 从当地供应商处购买受精卵，并在孵化前将卵置于13 °C的冰箱中保存，保存时间不得超过5天。胚胎活力在1周后会显著下降。
  2. 将卵放入孵化器前，用70%乙醇擦拭每个卵。
  3. 将1-2打卵侧放于孵化器中，温度设定为38 °C，湿度约为50%。此条件可分别确保胚胎在电穿孔时的正确位置及最佳存活率。
    注意：孵化48-52小时后，胚胎将处于Hamburger-Hamilton（HH）期约12-13期，适合进行电穿孔。

2. 准备

  1. 质粒混合
    1. 加入 1 µL 0.1% 快绿（0.1% 溶于 18 MΩ 去离子蒸馏水）2O [ddH₂O]2O])，每 7 µL DNA 混合物。
    2. 对于多个质粒的共电穿孔，将质粒按1:1的比例混合，最终DNA浓度应为5-8 µg/µL。
  2. 填充注射移液管
    1. 使用微量移液器拉制仪拉制移液管。用28G注射器针头将1-2 µL质粒溶液吸入移液管中。
    2. 用镊子将移液管尖端折断至10 - 20 µm。使用显微镜辅助判断断裂后移液管尖端的尺寸。将移液管连接至皮升注射仪的移液管固定装置上。

3. 开窗

注意：窗宽窗位处理步骤此前已有发表13。有关额外的视觉信息，请参见参考文献13。

  1. 用70%乙醇擦拭所有仪器和工作区域。
  2. 从培养箱中取出所需数量的受精蛋（6-10枚），置于室温下，并再次用70%乙醇逐个擦拭蛋壳表面。取出培养箱后，鸡蛋至少在2小时内仍保持活性。
  3. 将鸡蛋置于光源照射器上方，以确定胚胎的位置。用铅笔标出深色区域（i.e.，胚胎）的中心位置。
  4. 使用19G针头在鸡蛋的钝端打一个小孔。
  5. 在鸡蛋尖端靠近所画圆圈处再打一个孔。用19G针头去除一小块外层蛋壳（约16 mm2），然后用镊子去除一小块内层蛋壳（约8 mm2）。
  6. 将19G针头连接至3 mL注射器，从钝端的小孔中抽出1.5–2.5 mL蛋清。注意将针头以45°角向下插入。
  7. 用一小块胶带（1 cm × 1 cm）封住钝端的小孔。用较大胶带（2.5 cm × 4 cm）覆盖所画圆圈及第二个孔。
  8. 使用弯头剪刀（刀刃长度为2.5 cm），在圆圈范围内剪出一个窗口。剪刀应与蛋壳表面平行，窗口直径应小于2 cm。

4. 质粒注射

  1. 打开微量喷射仪，将压力设置为 18 psi，持续时间为 5 µs。打开解剖显微镜的气罐和光源。
  2. 配制 30 mL 储存液：将市售印度墨汁与无菌磷酸盐缓冲液（PBS）按 1:10 比例稀释，混匀后于 4 °C 保存。注射印度墨汁是清晰观察鸡胚的重要步骤。
    1. 用 1 mL 注射器吸取稀释后的印度墨汁溶液，安装 27G 针头，并排出注射器内的所有气泡。
    2. 将针头插入卵黄膜下方，距离胚胎约 2–3 mm 处，轻柔地将约 0.2 mL 印度墨汁注射至胚胎下方。注射量不得超过 0.5 mL，以免降低胚胎存活率。
  3. 将已开窗的鸡胚蛋置于解剖显微镜下的蛋托上，使用最高放大倍数以清晰观察质粒注射位点。
  4. 用镊子去除注射区域上方的膜组织。听觉脑干感兴趣区域（即，NM 和 NL）起源于菱脑节 5 和 6（R5/R6）。R5/R6 位于耳囊（脊椎动物胚胎中发育为内耳的结构）旁侧，耳囊可作为 R5/R6 区域质粒注射的解剖标志。
  5. 使用显微操作仪将装有 DNA 的移液针插入覆盖于 R5/R6 区域且位于耳囊之间的神经管内。理想位置的示意图见 图 1A。
  6. 通过微量喷射仪施加气压（18 psi，持续 5 µs），将 DNA 排入神经管内。

5. 电穿孔

  1. 打开电流/电压刺激器。
  2. 用 PBS 填充一支 3 mL 注射器，并安装注射器滤器。在胚胎上滴加 1–2 滴 PBS。
  3. 使用显微操作器将双极电极移至胚胎位置，负极置于注射位点上方（内侧），正极置于 R5/R6 外侧（图 1A）。避免电极与胚胎直接接触。使用铂铱合金材料制成的双极电极。用镊子调节电极尖端间距至 0.5 mm。
  4. 使用电流/电压刺激器，以 50 V 电压、1 ms 脉冲时长、1 s 间隔进行 20 次脉冲刺激。
  5. 电穿孔后，在暴露区域滴加一滴 PBS。轻柔移除电极，并用实验室擦拭纸和 70% 乙醇清洁电极。用胶带封闭暴露胚胎的窗口。
  6. 在蛋壳上标记所注射质粒类型及孵化日期。
  7. 将鸡蛋放回孵育箱，窗口面朝上。在 38 °C、50% 湿度条件下孵育，直至达到所需发育阶段。
  8. 若为实现基因表达的时间控制而电穿孔 tet-on 载体，则每 24 小时施用一次多西环素（Dox）以诱导基因表达（参见第 6 节）。

6. 用于基因表达时间调控的 Tet-on 系统

  1. 使用以下质粒：
    pCAGGS-T2TP：一种表达转座酶的质粒。
    pT2K-CAGGS-rtTA-M2：一种稳定表达Dox结合蛋白的质粒。
    pT2K-BI-TRE-EGFP：一种包含双向tet-on启动子（TRE）的质粒，可驱动EGFP报告基因和另一个目的基因的表达。
    注意：上述三种质粒需以1:1:1的比例共电穿孔转染。
  2. 储备液配制：
    1. 将Dox溶于无菌PBS中，配制成1 mg/mL的储备液，于-20 °C保存。
  3. Dox处理：
    1. 为在特定发育阶段诱导目的基因的表达，需每24小时施加一次Dox。
    2. 施加Dox时，取出鸡蛋，打开窗口，用移液器将50 µL Dox滴加到绒毛尿囊膜上，封闭窗口后将鸡蛋放回培养箱。

7. 脑干切片用解剖区域的准备

注意：以下章节（7 - 9）及操作步骤此前已发表14。如需更多视觉信息，请参阅这些参考文献。

  1. 制备琼脂糖溶液（40 mg/mL 琼脂糖， 即 4% in ddH₂O2将琼脂溶液倒入培养皿中，室温下静置使其凝固。将盖好的琼脂平板置于冰箱中保存，以备后续组织脑干切片时使用。
  2. 持续用95% O₂2 和5% CO2 （pH 7.2–7.4，渗透压：295–310 mOsm/L）
  3. 用70%乙醇清洁工作区域和振动切片机，并用蒸馏水冲洗刀片。
  4. 在工作区域放置一块干净的液体吸收垫，并备好相应的解剖工具。
  5. 从冰箱中取出琼脂平板，切下一小块琼脂（10 mm × 10 mm × 8 mm）。使用市售的超级胶水将琼脂块粘附至振动切片机切片室的载物台上。

8. 鸡听觉脑干的分离

  1. 在已贴胶带标记的窗口位置打开蛋壳。用解剖刀刺破膜囊，取出鸡胚的头部。
  2. 用锋利的剪刀将鸡胚头部完全剪下。
  3. 将剃刀刀尖置于眼睛稍后方位置，沿头尾方向的颅骨中线切开。根据胚胎的发育阶段施加轻微压力，发育较晚的胚胎需要更大的压力。
  4. 轻轻拨开皮肤和羽毛，暴露颅骨，确认中线切口位置准确。
  5. 施加较大力度，用剃刀切开颅骨的前部；立即将刀片移至眼睛后方，贯穿整个颅骨及脑组织进行切割。
  6. 用剪刀在颅骨"的后部区域从中线向两侧做切口，位置略位于颈部肌肉前方，两侧对称。通过掀开颅骨和去除多余组织，暴露大脑和小脑。
  7. 用剪刀剪断与脑干相连的组织，取出脑干，脑干可从颅骨中自由分离。

9. 用于脑干切片的制备 体内 电生理学或成像

  1. 通过视顶盖固定脑干。
  2. 用剪刀切断小脑脚，移除小脑，暴露第四脑室的底部。
  3. 使用镊子清除脑干表面的膜状组织和血管。
  4. 为对脑干进行切块，在第四脑室底部最前端、皮层后方稍偏尾侧处做一水平切口；再通过视顶盖做垂直于该切口的侧向切割，以分离出脑干。
  5. 在振动切片机载物台上、琼脂块正前方涂少量超级胶水。
  6. 用镊子夹住脊髓端提起脑干，将其腹侧朝下、背侧朝向振动切片机刀片放置于胶水上。用实验纸巾或滤纸吸除多余胶水。
  7. 将充氧人工脑脊液（ACSF）倒入振动切片机载物台中。将振动切片机刀片角度设为20–22°，启动最大振幅振荡模式。将载物台向上移动，使组织顶部与刀片保持平行。
  8. 快速将刀片移向脑干组织，在刀片"接触组织前显著降低推进速度。
  9. 以尽可能慢的前进速度进行切片。当刀片完全穿过整个冠状组织切面后，用移液器轻轻取出切片。
  10. 将载物台下降200–300 µm，再次切片。重复此过程，直至听觉核团的解剖标志清晰可见，例如核团NL特有的背侧/腹侧神经纤维网区域，以及NM相对于NL的内侧位置。
  11. 小心维持切片在ACSF中。此过程可在室温（22°C）或接近生理温度（约41°C）的水浴条件下进行。注意记录切片顺序：第一片对应组织最尾侧区域，最后一片对应最头侧区域。这大致反映了听觉脑干从低频到高频编码区的拓扑性频率排列。

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结果

我们在此表明 在卵内 电穿孔技术可实现基因在正常发育的生物系统中的表达。将质粒编码的基因局部注射至覆盖R5/R6区域的神经管内。图中展示了电极和移液管相对于重要解剖标志的位置示意图 图1A电穿孔后24小时确认质粒注射的正确位置，并在图中显示 图1B将质粒靶向注射至覆盖R5/R6节段的神经管，可实现特定听觉脑干区域（即核髓质（NM）和核外侧丘系（NL））的基因表达。(11). 图1C 显示一个 体外 E12 胚胎脑干切片在微分干涉差（DIC）照明下的图像。感兴趣的听觉区域已用轮廓标出。在荧光照明下（图1C1可见表达 YFP 的 NM 和 NL 内神经元。 图1D 显示高倍镜下E18胚胎的微分干涉差（DIC）成像。多个NM神经元典型的无树突细胞体清晰可见。在荧光照明下（图1D

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讨论

在卵内 电穿孔是一种通过表达或敲低目的基因以进行分析的方法 体内 基因功能8,9在鸡胚中，这是一种将质粒编码基因表达于不同听觉脑干区域的创新方法8为确保最佳表达效果，需遵循若干关键步骤。首先，仅注射耳囊清晰可见的胚胎；若耳囊不可见，则表明胚胎未达到电穿孔所需的正确发育阶段。其次，使用较细的移液管尖端更易于穿透神经管，且造成的组织损伤更小；但断裂的尖端应足够大，以确保DNA能够顺利排出。第三，需将快速绿溶液充分扩散至覆盖菱脑节5/6（R5/R6）区域的整个神经管内。最后，将刺激电极尽可能靠近胚胎放置至关重要，但须避免与胚胎直接接触，以防电流脉冲灼伤并损伤组织。

对技术方法的改进有助于提高胚胎的存活率和质粒的表达水平。首先，卵子应在到达后24小时内进行设置，以保持较高的存活率。其次，卵子的开窗处必须用胶带严密封闭，以防液体流失。即，脱水）导致密封不充分会增加胚胎死亡率。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Leslayann Schecterson博士、Yuan Wang博士、Andres Barria博士以及Ximena Optiz-Araya女士在实验方案初期建立过程中提供的帮助以及质粒的提供。本研究工作由美国国立卫生研究院耳聋与其他沟通障碍研究所（NIH/NIDCD）资助项目DC013841（JTS）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
受精的白来航鸡鸡蛋Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
PicospritzerParker Hannifin052-0500-900Picospritzer III，单通道或双通道
电流/电压刺激器Grass TechnologiesSD9SD9
Microfil 注射器针头World Precision InstrumentsMF28G67-528 号规格，67 mm 长，（每包 5 支）
电极夹持器Warner Instruments64-1280MP 系列：非电压力应用
刺激用微电极FHCPBSA1075PBSA1075
空气罐/调压器NU Laboratory Services干燥空气 300 CF
快绿染料（Fast green）Sigma AldrichF7258-25GF7258-25G
透明塑料胶带Scotch191
盐酸多西环素（Doxycycline hyclate）Sigma AldrichD9891-1G
鸡蛋冷藏箱Vissani Wine Refrigerator13.3 - 16.1 °C (56-61° F)
孵育箱Hova-Bator38 ° C (100 ° F)，约 50% 湿度
解剖显微镜Zeiss4.35E+15SteREO Discovery V8 显微镜，50.4X
冷光源Zeiss4.36E+15CL6000 LED
显微操作器Narishige Japan型号：MM-32 个显微操作器
毛细管Sutter InstrumentBF150-86-10厚壁硼硅酸盐玻璃（尺寸）
注射器1 mL，3 mL
针头BD Precision Glide 27 G × 1 1/4，19 G × 1 1/2
镊子StoeltingNo. 5 超细 Dumont 镊子
鸡蛋固定架定制使用黏土底座亦可
微电极拉制仪Sutter Instrument型号 P-97
注射器滤器Ultra Cruzsc-358811PVDF 0.22 μm

参考文献

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