在卵内 鸡听觉脑干中的电穿孔技术

摘要

鸟类和哺乳动物的听觉脑干神经元专门负责快速神经编码，这是正常听觉功能的基本过程。这些神经元起源于胚胎后脑的不同前体细胞。本文介绍了利用电穿孔技术在鸡胚后脑中表达基因的方法，以研究基因在听觉发育过程中的功能。

摘要

电穿孔是一种将目的基因导入鸡胚等具有生物学意义的生物体内的方法。长期以来，鸡胚一直被公认为研究听觉系统发育基本生物学功能的有效研究模型。近年来，鸡胚在研究与听觉相关的基因表达、调控及功能方面变得尤为有价值。在体电穿孔可用于靶向负责高度特化听觉功能的听觉脑干区域，这些区域包括鸡的巨细胞核（NM）和层状核（NL）。NM和NL的神经元起源于菱脑节5和6（R5/R6）的不同前体细胞。本文介绍了通过在体电穿孔将质粒编码的基因导入上述区域，以研究与基因相关的特性。我们展示了一种可实现基因表达时空控制的方法，从而促进功能表型的获得或缺失。通过靶向与R5/R6相关的听觉神经前体区域，我们实现了在NM和NL中的质粒转染。通过采用tet-on载体系统，可实现基因表达的时间调控。这是一种药物诱导方法，在多西环素（Dox）存在的情况下表达目的基因。在体电穿孔技术结合生化、药理学或在体功能检测，为研究听觉神经元发育及相关病理生理现象提供了一种创新性方法。

引言

声音的快速神经编码对于正常的听觉功能至关重要。这些功能包括声音定位能力¹、噪声中语音分辨能力²，以及其他具有行为学意义的通信信号的理解³。在鸟类和哺乳动物的听觉脑干中，存在功能类似的神经元，它们高度特化于快速神经编码⁴。这些神经元包括鸡的巨细胞核（nucleus magnocellularis, NM）、层状核（nucleus laminaris, NL），以及它们在哺乳动物中的对应结构——耳蜗腹前核（anteroventral cochlear nucleus, AVCN）和内侧上橄榄核（medial superior olive, MSO）⁵。然而，调控听觉脑干中快速神经编码的发育机制尚不明确。因此，研究负责快速神经编码的特定基因，有助于更深入地理解这些基因在听觉发育过程中的表达、调控及其功能。

发育中的鸡胚是研究听觉系统发育基本生物学问题的一种有效且成熟的实验工具^6,7近年来，分子技术的进步通过在发育中的鸡胚中表达或敲低目标基因，以分析相关生物学问题 体内 基因功能^....

方案

所有实验程序均经西北大学机构动物照护与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》进行。

1. 卵的处理

1. 从当地供应商处购买受精卵，并在孵化前将卵置于13 °C的冰箱中保存，保存时间不得超过5天。胚胎活力在1周后会显著下降。
2. 将卵放入孵化器前，用70%乙醇擦拭每个卵。
3. 将1-2打卵侧放于孵化器中，温度设定为38 °C，湿度约为50%。此条件可分别确保胚胎在电穿孔时的正确位置及最佳存活率。
   注意：孵化48-52小时后，胚胎将处于Hamburger-Hamilton（HH）期约12-13期，适合进行电穿孔。

2. 准备

1. 质粒混合
   1. 加入 1 µL 0.1% 快绿（0.1% 溶于 18 MΩ 去离子蒸馏水）₂O [ddH₂O]₂O])，每 7 µL DNA 混合物。
   2. 对于多个质粒的共电穿孔，将质粒按1:1的比例混合，最终DNA浓度应为5-8 µg/µL。
2. 填充注射移液管
   1. 使用微量移液器拉制仪拉制移液管。用28G注射器针头将1-2 µL质粒溶液吸入移液管中。
   ....

结果

我们在此表明 在卵内 电穿孔技术可实现基因在正常发育的生物系统中的表达。将质粒编码的基因局部注射至覆盖R5/R6区域的神经管内。图中展示了电极和移液管相对于重要解剖标志的位置示意图 图1A电穿孔后24小时确认质粒注射的正确位置，并在图中显示 图1B将质粒靶向注射至覆盖R5/R6节段的神经管，可实现特定听觉脑干区域（即核髓质（NM）和核外侧丘系（NL））的基因表达。⁽¹¹⁾. 图1C 显示一个 体外 E12 胚胎脑干切片在微分干涉差（DIC）照明下的图像。感兴趣的听觉区域已用轮廓标出。在荧光照明下（图1C₁可见表达 YFP 的 NM 和 NL 内神经元。 图1D 显示高倍镜下E18胚胎的微分干涉差（DIC）成像。多个NM神经元典型的无树突细胞体清晰可见。在荧光照明下（图1D

讨论

在卵内 电穿孔是一种通过表达或敲低目的基因以进行分析的方法 体内 基因功能^8,9在鸡胚中，这是一种将质粒编码基因表达于不同听觉脑干区域的创新方法⁸为确保最佳表达效果，需遵循若干关键步骤。首先，仅注射耳囊清晰可见的胚胎；若耳囊不可见，则表明胚胎未达到电穿孔所需的正确发育阶段。其次，使用较细的移液管尖端更易于穿透神经管，且造成的组织损伤更小；但断裂的尖端应足够大，以确保DNA能够顺利排出。第三，需将快速绿溶液充分扩散至覆盖菱脑节5/6（R5/R6）区域的整个神经管内。最后，将刺激电极尽可能靠近胚胎放置至关重要，但须避免与胚胎直接接触，以防电流脉冲灼伤并损伤组织。

对技术方法的改进有助于提高胚胎的存活率和质粒的表达水平。首先，卵子应在到达后24小时内进行设置，以保持较高的存活率。其次，卵子的开窗处必须用胶带严密封闭，以防液体流失。即，脱水）导致密封不充分会增加胚胎死亡率。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
受精的白来航鸡鸡蛋	Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III，单通道或双通道
电流/电压刺激器	Grass Technologies	SD9	SD9
Microfil 注射器针头	World Precision Instruments	MF28G67-5	28 号规格，67 mm 长，（每包 5 支）
电极夹持器	Warner Instruments	64-1280	MP 系列：非电压力应用
刺激用微电极	FHC	PBSA1075	PBSA1075
空气罐/调压器	NU Laboratory Services		干燥空气 300 CF
快绿染料（Fast green）	Sigma Aldrich	F7258-25G	F7258-25G
透明塑料胶带	Scotch	191
盐酸多西环素（Doxycycline hyclate）	Sigma Aldrich	D9891-1G
鸡蛋冷藏箱	Vissani Wine Refrigerator		13.3 - 16.1 °C (56-61° F)
孵育箱	Hova-Bator		38 ° C (100 ° F)，约 50% 湿度
解剖显微镜	Zeiss	4.35E+15	SteREO Discovery V8 显微镜，50.4X
冷光源	Zeiss	4.36E+15	CL6000 LED
显微操作器	Narishige Japan	型号：MM-3	2 个显微操作器
毛细管	Sutter Instrument	BF150-86-10	厚壁硼硅酸盐玻璃（尺寸）
注射器			1 mL，3 mL
针头	BD Precision Glide		27 G × 1 1/4，19 G × 1 1/2
镊子	Stoelting		No. 5 超细 Dumont 镊子
鸡蛋固定架	定制		使用黏土底座亦可
微电极拉制仪	Sutter Instrument		型号 P-97
注射器滤器	Ultra Cruz	sc-358811	PVDF 0.22 μm