光片为主的生活的荧光显微镜或固定和染色赤拟谷盗胚胎

摘要

成像昆虫胚胎与基于光的片材的荧光显微镜的形态已成为现有技术的状态。该协议概述并比较适合赤拟谷盗胚胎三个安装技术中，引入了两个新的定制的转基因系非常适合于实时成像，讨论必需的质量控制和指示当前实验的限制。

摘要

在赤拟谷盗赤拟谷盗已成为发育遗传学及进化发育生物学的一个重要昆虫的模式生物。 赤胚胎与基于光的片材的荧光显微镜观察具有优于常规宽场和共聚焦荧光显微镜多个优点。由于基于光的片材显微镜的独特性质，活标本的三维图像可以记录具有高信号噪声比和比上几个周期显著降低光致漂白，以及沿多个方向的光毒性天。随着四年多的发展方法和数据的不断增加，时间似乎是适当的建立光片技术在赤社区的使用以及在昆虫社会大众的标准作业程序。这个协议描述了适合˚F三个安装技术或不同的目的，提出了两种新的定制的转基因赤线适合于长期实时成像，表明5个的荧光染料来标记固定胚胎的细胞内结构以及用于记录数据的及时评估提供了关于数据的后处理的信息。代表性的结果集中在长期实时成像，光学切片并沿多个方向相同的胚胎的观察。相应的数据集提供的可下载资源。最后，协议讨论了用于实时成像测定，电流限制和所概述的程序到其它昆虫物种的适用性的质量控制。

该协议主要针对谁寻求成像解决方案，超越标准的实验室设备发育生物学家。它促进了连续尝试关闭技术上导向的实验室/社区，其发展和完善万分之一之间的差距复制方法论，生命科学实验室/社区，这需要技术上的挑战"插件和播放的解决方案。此外，它支持移动的生物学问题成为人们关注的焦点的公理化方法。

引言

在赤拟谷盗赤拟谷盗 ，属于大家族暗中甲虫（拟步甲科），具有农业和生命科学领域内历史悠久，是果后的第二个最好的研究模型昆虫的模式生物飞行果蝇 。在过去的四个十年里，它成为发育遗传学的强大和受欢迎的昆虫的模式生物，在进化发育生物学，并在过去的二十年中，在各种原因的胚胎形态:

果蝇和赤同属Holometabola，但约300万年前的^{1，2，3，4}分歧。而果蝇胚胎发育通常被认为是高度衍生， 赤示出devel的更祖模式即在昆虫物种^{5，6，7，8，9}的一个相当大的比例发现opment。首先， 赤呈现出非渐开头的发展， 即，其口器和天线胚胎发生

方案

1. 赤培养的畜牧

注意:标准条件定义为在25℃和70％相对湿度在12个小时亮/ 12小时黑暗周期的培养温度。有关赤畜牧业的更多信息，相应的指南可^64。此协议需要两个不同的面粉媒体​​，可在千克数量制备和储存数月。

1. 之前用面粉和非活性干酵母工作，存储未开启的包装，在-20℃下放置24个小时，然后让它们升温至室温。这个过程消除了潜在的病原体。
2. 通过与710微米筛孔尺寸的筛子通过全谷物小麦粉和非活性干酵母，然后用5％的补充过筛全粒面粉（重量/重量）过筛非活性干酵母制备生长培养基中。
3. 经过405精面粉和非活性干酵母通过筛250＃181;米筛目大小，然后用5％的补充过筛405细小麦粉（重量/重量）过筛非活性干酵母制备产蛋平台。
4. 通过相应的赤文化通过 用筛 800 微米网目尺寸。丢弃剩余的生长培养基。转移幼虫，蛹和成虫一个大玻璃盘。
5. 如果没有后代的文化存在，大约80幼虫和/或蛹转移到一个新的玻璃瓶，建立一个新的子代的文化。如果没有幼虫和/或蛹存在，约有40名成人代替。添加50克生长培养基中并在标准条件下温育。
6. 收集在另一个新玻璃瓶大约300成年人（500-700毫克）以建立所述成像培养。添加50克生长培养基中并在标准条件下....

结果

这个协议描述了用于生活的荧光成像或固定和染色赤胚胎LSFM实验框架。由于光漂白和光毒性，其光学切片能力的直接结果的低水平，LSFM是特别适合于长期实时成像。

新颖AGOC {ATub'H2B-mEmerald}＃1转基因线下的α-微管蛋白1启动子⁷⁴的控制表达histone2B-mEmerald融合蛋白。它示出了一个增强子捕获状表达图案⁵¹中，由于荧光信号主要从浆膜，卵黄囊和几个神经元细胞簇获得。使用这条线，在室温（23±1℃）的胚胎发育66小时，记录，覆盖germband回缩和背封（补充电影1）。这个线可以被用于可视化的头附件（ 图4A）和浆膜层迁移的背封（ 图4B）中的动态范围内的神经元簇。新颖AGO.......

讨论

品质管制

在活体成像试验中，准备和记录程序必须是非侵入性的， 即，既不机械和化学处理（收集，dechorionation，安装到样本保持器），也没有观察时的集成能量负载应该影响样品的可行性。对于研究表征WT发展，它是从其中胚生存的录制过程中，成功地检索并发展成一个健康的成年人实验建议只使用数据。成人不应该表现出任何形态畸变，宜肥沃，且其后代也应该是肥沃。主要有三个原因，低存活率，尤其是在长期的实时成像检测:

首先，将胚胎表面进行了广泛的与琼脂糖步骤7，这可能阻碍了离子和气体交换和收缩胚胎mechan期间覆盖ically。受影响的胚胎，特别是在早期胚胎发育过程中成像，通常不明显开发了好几个小时，突然逮捕并很快失去其荧光信号。有一定经验的，即通过使用半球技术嵌入在琼脂糖表面部分可以保持在低于三分之一，而与所述支架蛛网技术，在表面的最一半是由非常薄的琼脂糖层覆盖。其次，施加到胚胎的集成能量负荷超过容差。在步骤8.2中给出的值作为一个经验法则，但以下条件应考虑:早期胚胎发育过程中（.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
全麦小麦粉	Demeter e.V.	1.13E+08	美国：全麦面粉，英国：全麦面粉
405 细小麦粉	Demeter e.V.	1.13E+08	美国：糕点粉，英国：软面粉
非活性干酵母	Flystuff / Genesee Scientific	62-106
磷酸盐缓冲盐碱 （PBS），pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010-023
次氯酸钠，~12% 活性 Cl	Sigma Aldrich	425044-250ML	注意：次氯酸钠是腐蚀性
低熔点琼脂糖	Carl Roth	6351.2
6 孔板	Orange Scientific	4430500
24 孔板	Orange Scientific	4430300
玻璃毛细管，内部 Ø 0.46 mm	品牌 GmbH + Co KG	7087 09
SYTOX Green	Thermo Fisher Scientific	57020	染色液制备在表 2 中说明
YOYO-1 碘化物	Thermo Fisher Scientific	Y3601	染色液制备在表 2 中解释
BOBO-3 碘化	Thermo Fisher Scientific	B3586	染色液制备在表 2 中解释
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽	Thermo Fisher Scientific	A12379	染色液制备在表 2 中解释
Alexa Fluor 546 鬼笔环肽	Thermo Fisher Scientific	A22283	染色液的制备在表 2
筛、800 和 micro 中解释;m 网孔尺寸	VWR International	200.025.222-051
筛，710 µm 网孔尺寸	VWR International	200.025.222-050	用于生长培养基制备（步骤 1.1）
筛子，300 µm 网孔尺寸	VWR International	200.025.222-040
筛，250 µm 网孔尺寸	VWR International	200.025.222-038	用于产蛋培养基制备（步骤 1.2）
玻璃皿，Ø 100 毫米和次; 20 毫米	Sigma Aldrich	CLS70165102
细胞过滤器，100 和微量;m 目尺寸	BD Biosciences	352360
油漆刷，头部和斜杠; 2 毫米	VWR International	149-2121
注射器，1.0 毫升	B. Braun Medical AG	9166017V
闪烁瓶	Sigma Aldrich	M1152-1000EA
多聚甲醛 （PFA）	Sigma Aldrich	158127	注意：多聚甲醛有毒且具有腐蚀性
正庚烷 >99%	Carl Roth	8654.1	警告：正庚烷易燃且有毒
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	警告：Trition X-100 具有腐蚀性