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方法文章

活体或固定染色样本的光片荧光显微镜成像 赤拟谷盗 胚胎

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DOI：

10.3791/55629

⸱

2017年4月28日

 ,  , 
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

本文内容

摘要

利用光片荧光显微镜对昆虫胚胎的形态发生过程进行成像已成为当前的标准技术。本实验方案概述并比较了三种适用于赤拟谷盗（Tribolium castaneum）胚胎的样品制备方法，介绍了两种适用于活体成像的新型定制转基因品系，讨论了关键的质量控制步骤，并指出了当前实验中存在的局限性。

摘要

赤拟谷盗Tribolium castaneum已成为发育遗传学和进化发育生物学中重要的昆虫模式生物。与传统的宽场荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜相比，基于光片的荧光显微镜在观察Tribolium胚胎方面具有多项优势。由于光片显微镜独特的光学特性，可在数天时间内以多个方向对活体样本进行三维成像，获得高信噪比的图像，同时显著降低光漂白和光毒性。经过四年多的方法学发展以及数据的持续积累，目前时机已成熟，可在Tribolium研究领域乃至整个昆虫研究领域建立光片成像技术的标准操作流程。本实验方案描述了三种适用于不同目的的样品固定技术，介绍了两种适用于长期活体成像的新型转基因Tribolium品系，推荐了五种可用于标记固定胚胎细胞内结构的荧光染料，并提供了数据后期处理的相关信息，以实现对所记录数据的及时评估。代表性结果聚焦于长期活体成像、光学切片以及对同一胚胎从多个方向进行观察。相关数据集作为可下载资源提供。最后，本方案讨论了活体成像实验的质量控制、当前技术的局限性，以及所述方法在其他昆虫物种中的适用性。

本方案主要面向希望获得超越标准实验室设备成像解决方案的发育生物学家。它致力于持续缩小以技术为导向、致力于显微镜方法开发与优化的实验室/学术群体，与需要“即插即用”式技术解决方案的生命科学实验室/学术群体之间的差距。此外，该方案支持一种公理化的方法，将生物学问题置于研究的核心位置。

引言

红面粉甲虫Tribolium castaneum属于拟步甲科（Tenebrionidae）这一大型甲虫类群，在农业和生命科学领域具有悠久的研究历史，是继果蝇Drosophila melanogaster之后被研究最为深入的第二种模式昆虫。在过去四十年中，由于多种原因，它已成为发育遗传学、进化发育生物学以及近二十年来胚胎形态发生研究中一种强大且广受欢迎的昆虫模式生物：

果蝇 和 赤拟谷盗 两者均属于完全变态亚纲（Holometabola），但约在3亿年前发生分歧1,2,3,4胚胎发育过程中 黑腹果蝇 通常被认为高度特化， 赤拟谷盗 表现出在更大比例的昆虫物种中发现的一种更为原始的发育模式5,6,7,8,9首先， 赤拟谷盗 表现出非内卷头部发育， 即 其口器和触角在胚胎发生期间便已开始形成10,11,12,13,14,15其次， 赤拟谷盗 遵循短胚带发育的原则， 即 在原肠胚伸长期间，腹部体节从后部生长区依次添加16,17,18,19第三， 赤拟谷盗 发育并随后降解两个胚外膜 即 羊膜，仅从腹侧覆盖胚胎；浆膜，完全包裹胚胎20,21,22两层膜在形态发生中均起着至关重要的作用23 以及对微生物的防护作用24,25 和干燥26第四，胚胎发育中的腿部在幼虫生活阶段已完全具备功能，并在蛹期变态过程中作为成虫腿部的原基。27,28,29,30,31.

由于其体型小且培养条件简单，在实验室中培养Tribolium相对容易。野生型（WT）品系或转基因品系的培养群体通常包含约100至300只成虫，可饲养于一升容量的玻璃瓶（底面积80 cm2）中，瓶内装入3至4厘米高（约50 g）的培养基，培养基由全麦面粉添加灭活干酵母组成。无需额外提供水源。因此，即使空间有限的实验室也可在小型或中型商用昆虫培养箱中同时维持数十个甲虫培养群体。通过筛分可轻松将Tribolium后期发育阶段（约第四龄之后的幼虫、蛹和成虫）从培养基中分离。通过将成虫在产卵培养基上短暂培养，即可获得同步化的胚胎。为实现快速发育，甲虫培养通常在32 °C下进行（每代约四周）；而保种培养则通常在22–25 °C下进行（每代约十周）。

在过去的十年中，许多标准技术已逐步得到改进和优化 赤拟谷盗，如综述所述 新兴模式生物 书籍32. 重要的高级遗传学方法包括胚胎学33幼虫34,35 或亲本36,37 基于RNA干扰的基因敲低，通过生殖系转化结合 piggyBac38,39 或 Minos40 转座酶系统与基于CRISPR/Cas9的基因组编辑41此外，该 赤拟谷盗 基因组大约在十年前已完成测序42，目前正处于基因组组装发布的第三轮阶段43，可实现基因的高效、全基因组范围的鉴定与系统性分析44 或其他遗传元件45,46此外，另有四种鞘翅目物种的基因组可用于比较遗传学研究47,48,49,50与已测序的基因组相关联，已开展了两项大规模的遗传学分析， 即 插入突变筛选51 基于RNA干扰的系统性基因敲低筛选52,53.

宽场、共聚焦或光片显微镜（LSFM）荧光活体成像可用来观察胚胎形态 赤拟谷盗 随时间变化的函数（即 在多维背景下（形态发生）表1）。在宽场和共聚焦荧光显微镜中，激发光和发射光通过同一物镜传递。在这两种方法中，每个记录的二维平面均需对整个样品进行照明，因此样品会暴露于非常高的能量水平。在光片荧光显微镜（LSFM）中，由于采用两个相互垂直排列的物镜，实现了照明与检测的分离，仅对焦平面内的荧光分子进行激发。图1）。LSFM 有两种典型实现方式——单平面照明显微镜（SPIM）和基于数字扫描激光片层的荧光显微镜（DSLM， 图2）——相较于传统方法具有多项关键优势：（i）固有的光学切片能力，（ii）良好的轴向分辨率，（iii）显著降低的光漂白程度，（iv）极低的光毒性，（v）高信噪比，（vi）相对较快的图像采集速度，（vii）可沿多个方向成像，以及（viii）由于采用低数值孔径照明物镜，实现更深的组织穿透54,55,56.

LSFM 已成功应用于 赤拟谷盗 记录几乎整个胚胎形态发生过程57 并分析背闭合开始时胚外膜破裂的机制23. 提高LSFM在该领域的吸引力 赤拟谷盗 对于整个科研领域及昆虫学研究而言，建立标准操作流程并改进方法、实验方案和资源库至关重要，应使其达到将显微镜变为发育生物学实验室中易于使用的常规工具的水平，从而让生物学问题始终处于研究的核心地位。

本方案从基础开始 赤拟谷盗 培养 即 维护、繁殖和胚胎收集。接下来展示了两种实验策略：（i）对定制的转基因品系进行活体成像；（ii）对经荧光染料染色的固定胚胎进行成像表 2）。随后，详细介绍了三种目的略有不同的封片技术（图3 和 表3）：（i）琼脂糖柱，（ii）琼脂糖半球，以及（iii）新型蛛网状固定装置。随后，本方案详细说明了使用LSFM进行数据采集的步骤，概述了成像模式及关键注意事项。最后，介绍了胚胎回收方法，并提供了基础数据处理的建议。在代表性结果中，展示了来自两种新型自制装置以及Glia-blue的活体成像数据58 展示了转基因品系，并提供了相应的成像数据集作为可下载资源。此外，还展示了用多种荧光染料染色的固定胚胎的图像数据。讨论部分重点介绍了质量控制、活体成像方法的当前局限性，以及本实验方案对其他物种的适用性。

该方案适用于配备样品室和可旋转夹持装置的光片荧光显微镜，该夹持装置用于标准化的样品架54,59,60，通常为由金属、塑料或玻璃制成的圆柱形元件，直径在毫米量级。该方案同样适用于两种典型实现方式， 即 SPIM 和 DSLM，以及具有两个或更多照明和检测臂的装置61,62,63代表性结果展示了两个光谱通道的数据，绿色通道（488 nm 激光激发，通过 525/50 带通滤光片检测）和红色通道（561 nm 激光激发，通过 607/70 带通滤光片检测），但该方案可扩展至三个或四个光谱通道。

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方案

1. 赤拟谷盗（Tribolium）品系的饲养

注意：标准条件定义为25 °C培养温度、70%相对湿度，以及12小时光照/12小时黑暗的循环周期。有关Tribolium饲养的更多信息，可参考相应的指南64。本实验方案需要两种不同的基于面粉的培养基，可按千克量制备，并可储存数月。

  1. 在使用面粉和干酵母之前，将未开封的包装储存在 -20 °在4°C下孵育24小时，然后使其恢复至室温。该步骤可消除潜在病原体。
  2. 将全麦面粉和失活干酵母通过孔径为710的筛子过筛 µm 网筛过滤后，通过向过筛的全麦面粉中添加 5%（w/w）过筛的失活干酵母，制备培养基。
  3. 将405号细小麦粉和失活干酵母通过孔径为250的筛子过筛 µm 网筛过滤后，通过向过筛的405细小麦粉中添加5%（w/w）过筛的失活干酵母，制备产卵培养基。
  4. 传递相应的 赤拟谷盗 培养通过 带筛子的 800 µm 网孔大小。弃去剩余的培养基。将幼虫、蛹和成虫转移至一个大玻璃培养皿中。
  5. 若无子代培养物，将约80只幼虫和/或蛹转移至新的玻璃瓶中以建立新的子代培养物。若无幼虫和/或蛹，可改用约40只成虫。加入50 g培养基，在标准条件下培养。
  6. 在另一个新的玻璃瓶中收集约300只成虫（500–700 mg）以建立用于成像的培养群体。加入50 g培养基，在标准条件下培养。在收集胚胎前，让该成像培养群体在新鲜培养基中至少稳定24小时。
  7. 至少每两周更换一次成像培养物的培养基，此操作可与胚胎收集（见3.2）同时进行。经过两到三个月后，用子代培养物中的新成虫完全替换成像培养物。
  8. 若使用非纯合转基因品系，需定期筛选子代培养物，剔除非转基因个体。理想情况下，若相应转基因在两条染色体上均存在时不会导致致死或不育，则应建立纯合品系。纯合培养物通常具有较高的平均荧光强度，且实验条件更为均一，因为仅存在一种基因型。

2. 显微镜设置与校准

注意： 赤拟谷盗 胚胎的头尾轴长度约为 600-660 µ微米，横向直径约为300-330 µm. 大多数现代CCD相机的传感器芯片尺寸约为9 mm x 7 mm， 即 11.4 的直径 µ米，像素间距为6.45 µm. 当与10倍物镜结合使用时，可对胚胎进行成像 整体上 像素间距为 0.645 µm. 大多数现代sCMOS相机的传感器芯片尺寸较大，约为16 mm x 14 mm， 即 21.3 的直径 µ米，像素间距为6.5 µm. 当与20倍物镜结合使用时，可对胚胎进行成像 整体上 像素间距为 0.325 µm.

  1. 将照明和检测物镜安装到显微镜上。确保激光器和荧光滤光片与荧光染料的吸收和发射光谱高度匹配。
  2. 将样品室连接至显微镜。用 pH 7.4 的 PBS 或其他适当的成像缓冲液填充样品室。
  3. 开启显微镜并进行校准。针对自行构建的光片显微镜（特别是 DSLM 实现）的全面校准流程和故障排除指南已有先前文献报道65。对于商用设备，必须严格遵循制造商的说明。操作不当可能导致样品室中的介质流失，进而对仪器和样本造成严重损害。

3. 转基因或野生型胚胎的收集

  1. 将成像用种群通过孔径为 800 µm 的筛子过滤。收集成虫至新的玻璃瓶中，并加入 10 g 产卵培养基。将产卵培养物在 25 °C 和 70% 相对湿度条件下光照孵育 1 小时。
  2. 将产卵培养物通过孔径为 800 µm 的筛子过滤，以分离成虫与含有约 30–100 枚胚胎的产卵培养基。将成虫转移至新的玻璃瓶中，并加入原有培养基或 50 g 新鲜生长培养基。
  3. 若需从均一囊胚期开始观察（示例数据集 DS0002），则将产卵培养基在 25 °C 和 70% 相对湿度条件下孵育 15 小时；若需从原肠胚带回缩初期开始观察（示例数据集 DS0001 和 DS0003），则将胚胎在 32 °C 和 70% 相对湿度条件下孵育 23 小时。如需其他发育阶段，请参考相应文献64,65，并根据需要调整孵育时间和/或温度。

4. 胚胎去壳

注意：卵壳的外层为 chorion，由蛋白质和多糖组成。chorion 对光有很强的吸收性，但对于正常发育并非必需，因此可通过化学方法将其去除。

  1. 将产卵基质通过孔径为 300 µm 的筛网过滤，用孔径为 100 µm 的细胞筛收集胚胎，并弃去残留的产卵基质。
  2. 准备一个 6 孔板，操作如下：向 A1、A2、A3 和 B3 孔中各加入 10 mL PBS（pH 7.4），向 B1 和 B2 孔中各加入 9 mL PBS，然后小心地向 B1 和 B2 孔中各加入 1 mL 次氯酸钠。在体视显微镜下观察步骤 4.3 至 4.8 的操作过程。注意：次氯酸钠具有腐蚀性。
  3. 将细胞筛放入 A1 孔（PBS，pH 7.4）中，在轻微振荡条件下清洗胚胎 1 分钟，使较大的面粉颗粒从胚胎上脱落。
  4. 将细胞筛转移至 B1 孔（含次氯酸钠的 PBS，pH 7.4），剧烈振荡培养板 30 秒，使残留的面粉颗粒完全从胚胎上脱离。
  5. 将细胞筛转移至 A2 孔（PBS，pH 7.4），在轻微振荡条件下清洗胚胎 1 分钟。
  6. 进行去壳处理时，将细胞筛转移至 B2 孔（含次氯酸钠的 PBS，pH 7.4），剧烈振荡培养板，直至卵壳破裂并从胚胎上脱落。卵壳呈薄而半透明的膜状结构，边缘呈撕裂状；而去壳后的胚胎轮廓则较为平滑。
  7. 将细胞筛转移至 A3 孔（PBS，pH 7.4），在轻微振荡条件下清洗胚胎 1 分钟。若清洗后仍有卵壳碎片附着于胚胎上，则重复步骤 4.6。
  8. 将胚胎保存在 B3 孔（PBS，pH 7.4）中。胚胎可在其中储存数小时而不受影响，但需注意胚胎发育仍在持续进行。
  9. 对于非纯合转基因品系，如有可能，应去除所有无荧光的胚胎。如需对野生型或转基因胚胎进行固定和染色，请继续执行步骤 5；如需对转基因胚胎进行活体成像，请继续执行步骤 6。

5. 卵黄膜通透化、固定与染色

注意：卵黄膜是卵壳的内层。它对荧光染料具有不透性，因此在染色前必须通过化学方法使其通透。

  1. 用固定/透化溶液（1.5 mL 4% (w/v) 多聚甲醛溶于 PBS pH 6.9，以及 1.5 mL 正庚烷）填充闪烁瓶。用画笔将胚胎转移至瓶中。用铝箔包裹瓶体以避光保护荧光染料，并在摇床上以每分钟 50 转的速度孵育 30 分钟。注意：多聚甲醛具有毒性和腐蚀性，正庚烷易燃且有毒。
  2. 移除固定液，随后在摇床上以每分钟 50 转的速度，用 3 mL 0.1% (v/v) Triton X-100 溶于 PBS pH 7.4 的溶液处理胚胎，每次 15 分钟，共处理三次；之后再用 3 mL 1% (v/v) Triton X-100 溶于 PBS pH 7.4 的溶液处理一次，每次 15 分钟。注意：Triton X-100 具有腐蚀性。
  3. 移除透化溶液，向瓶中加入 0.5 mL 染色液。示例性染色液见表 2。在 4 °C 下于摇床上以每分钟 50 转的速度避光孵育过夜。对于表 2中建议的染料，无需进行后续洗涤步骤。

6. 制备包埋琼脂糖

  1. 将1 g低熔点琼脂糖加入100 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在800 W微波炉中加热2–3分钟。若仍有少量琼脂糖颗粒未溶解，以30秒为间隔重复加热，直至颗粒完全溶解。封片用琼脂糖无需每次新鲜配制，凝固的琼脂糖可通过上述加热方式重新液化。此过程可重复5–6次，直至水分蒸发过多为止。
  2. 让琼脂糖冷却至约40–45 °C，随后将加热后的琼脂糖分装至两个1.5 mL离心管中，并将这些离心管置于温控金属块中，保持在35 °C。

7. 胚胎固定与样品腔插入

  1. 选项1：琼脂糖柱（图3A- C，第一列；表3，第二列
    1. 用蒸馏水填充一支1.0 mL注射器，并通过一小段橡胶管将其连接到玻璃毛细管的一个开口端。用蒸馏水填充毛细管至一半高度。
    2. 用画笔挑取一个胚胎，将其放置在另一根玻璃毛细管开口的内侧。在胚胎干燥之前迅速进行下一步操作。
    3. 将毛细管插入液态琼脂糖中，缓慢吸取少量 µ微升液体琼脂糖与胚胎一同吸入毛细管中。随后迅速增加抽吸力度，使胚胎随琼脂糖一同被拖入。最终，少量 µ在胚胎的上方和下方均应有适量琼脂糖。将毛细管静置数分钟，使琼脂糖凝固。
    4. 用金刚石玻璃切割器将毛细管截短至约5 mm长度。剩余片段应完全充满琼脂糖，且胚胎应位于第二四分位区域内。
    5. 将带针的钢圆筒插入样品室，然后将毛细管碎片粘在针的顶端。含有胚胎的部分应从毛细管碎片顶端伸出几毫米的琼脂糖柱。
  2. 选项2：琼脂糖半球（图3A- C，第二列；表3，第三列
    1. 吸取200 µ将液态琼脂糖注入1.0 mL注射器中，然后用其从顶部填充钢管，直至底部开口处形成一个半球形。该半球的直径应与钢管直径相等。静置数分钟，待琼脂糖完全凝固。
    2. 用画笔挑选一个胚胎，并在笔尖上调整其位置，使前端易于接触。将琼脂糖半球浸入液态琼脂糖中，使其表面覆盖一层薄膜。
    3. 将胚胎的前端朝上，放置在琼脂糖半球的顶端。旋转钢管，并用毛刷调整胚胎的位置。如有必要，可通过添加2 μL琼脂糖溶液来稳定胚胎。 µ将低熔点琼脂糖覆盖至胚胎/半胚边缘。理想情况下，琼脂糖应覆盖少于一半的胚胎表面，且两侧边缘应尽可能陡直。
    4. 将带有半球和胚胎的钢管缓慢插入样品室中。
  3. 选项3：蛛网状固定架（图3A-C，第三列；表3，第四列
    1. 用画笔挑选一个胚胎并置于一旁。
    2. 用 5-8 根覆盖蛛网支架的带槽孔 µL 液体琼脂糖，然后移除大部分琼脂糖，直至仅剩一层薄薄的琼脂糖膜。
    3. 将胚胎放置在琼脂糖膜上并调整其位置。小心地将胚胎移至狭缝孔的x轴中心，并使其伸长的头尾轴与狭缝孔的长轴对齐。
    4. 将装有胚胎的蛛网状支架缓慢插入样品室中。调整蛛网状支架的位置，使其不干扰激发光和发射光的传播。 即 45° 相对于 x 轴和 z 轴。

8. 光片荧光显微镜技术

  1. 确定应沿多少个方向（以及沿哪些取向）对胚胎进行成像。通常，沿四个方向（取向分别为 0°、90°、180° 和 270°）可在覆盖范围与能量负荷之间取得良好平衡。
  2. 设置荧光通道数量。每个通道的主要参数包括激光波长、荧光滤光片、激光功率和曝光时间。对于长期活体成像，必须确保累积的能量负荷不超过胚胎的耐受范围。曝光时间为 25–50 ms 可实现快速成像，而激光功率在 100 至 300 µW 之间通常不会影响胚胎的存活率。对于固定样品，曝光时间和激光功率至少可加倍。
  3. 对于活体成像实验，配置时间间隔。在室温（23 ± 1 °C）下，Tribolium 的完整胚胎发育约需七天，在 32–35 °C 下则略少于三天64。应根据需观察的形态发生事件定义时间间隔。对于较短的时间间隔，应考虑降低曝光时间和激光功率（见 8.2）。
  4. 在透射光模式下，将胚胎沿 x 轴和 y 轴移动至视野中心，避免激光照射。以 90° 步进旋转胚胎 360°，检查胚胎在装样过程中是否受到损伤。
  5. 适当绕 y 轴旋转胚胎，使胚胎的轴线与显微镜的轴线对齐，例如将侧向轴与 x 轴对齐，i.e. 将背腹轴与 z 轴对齐。使用蛛网支架法时，可能无法实现对齐。
  6. 在荧光模式下，为每个方向定义 z 层切范围。在胚胎前后各增加 25–50 µm 作为空间缓冲。包含缓冲区域后，Tribolium 胚胎的典型 z 层切范围约为 350–400 µm。同时定义 z 方向步距，其值应为横向步距的四倍，i.e. 即 x 轴和 y 轴方向步距的四倍66。
  7. 若同时对两个或多个胚胎进行成像，则对下一个胚胎从步骤 8.4 重新开始。
  8. 对于长期成像，确保样品腔内充满足够的 pH 7.4 PBS 或其他成像缓冲液，并覆盖样品腔开口。
  9. 启动成像过程。对于长期活体成像，需监控所有胚胎在所有通道、所有方向上的正确采集情况。在接下来的数天内应定期检查胚胎是否存活并处于适当位置。

9. 胚胎获取与质量控制

  1. 成像完成后，将带有胚胎的样品架从样品室中取出。仅需回收活体成像实验中的胚胎，固定并染色的胚胎可丢弃。
  2. 若进行了活体成像实验，需将胚胎转移至载玻片上。对于琼脂糖柱法，使用解剖刀、微型刀片或剃须刀片将胚胎从周围琼脂糖中取出；对于琼脂糖半球法，将带有胚胎的半球平面朝下转移至载玻片上，无需取出胚胎；对于蛛网支架法，使用画笔轻轻将胚胎从琼脂糖膜上取下。将载玻片置于小型玻璃培养皿中，在饱和湿度环境下按标准条件培养，直至幼虫孵化。
  3. 孵化后，将幼虫转移至24孔板的各个孔中，每孔加入500 mg培养基，在标准条件下继续培养。将成像幼虫的总发育时间和形态与未成像的野生型（WT）及转基因幼虫进行比较（见讨论部分）。在表征野生型发育的实验中，理想情况下不应观察到明显的形态学异常。
  4. 当幼虫发育为健康成虫后，为其提供相同遗传背景的野生型配偶。两周后检查是否产生子代。建议进一步通过子代间互交（inter pares）检测其生育能力。只有当成像胚胎发育为可育成虫，并且其子代也具备生育能力时，方可认为该成像过程为非侵入性。

10. 图像数据处理

注意：对于图像数据处理，推荐使用开源图像处理软件 ImageJ67 或其衍生版本 FIJI68。这两个软件及其完整文档均可在 www.imagej.net 获取。LSFM 数据的标准文件格式为标记图像文件格式（TIFF）。该格式的内置容器功能支持将图像堆栈（如 z 堆栈或 z 最大投影的时间序列）存储于单个文件中，可通过拖放方式在 ImageJ 或 FIJI 中直接打开。

  1. 如有必要，旋转z层堆栈以使胚胎的前后轴与y轴对齐（图像 → 变换 → 旋转）。请注意，旋转参数需针对每个方向单独设置，但无需针对时间序列和荧光通道进行设置。
  2. 沿x、y和z轴裁剪z层堆栈，仅保留最小背景（x轴和y轴方向保留20–40像素，z轴方向保留5–10个层面）（对于x轴和y轴，使用矩形选区工具，然后选择图像 → 裁剪；对于z轴，使用图像 → 堆栈 → 工具 → Slice Keeper）。请注意，裁剪参数需针对每个方向单独设置，但无需针对时间点和荧光通道进行设置。
  3. 为每个z层堆栈计算z轴最大值投影（图像 → 堆栈 → Z投影，选择最大强度）。强度投影计算是一种数据简化方法，会去除一个空间维度。
  4. 对于长期活体成像数据，可考虑使用ImageJ或FIJI脚本，对所有方向、所有时间点及所有荧光通道自动执行步骤10.1至10.365。理想情况下，将每个通道和方向的z轴最大投影串联起来，并保存为单个TIFF容器中的时间序列。或者，可使用FIJI的BigDataViewer69插件浏览TB级别的大型数据集。
  5. 根据转基因品系和成像模式，由于光漂白和/或荧光蛋白表达水平波动，可能需要对时间堆栈进行动态强度调整。建议使用ImageJ或FIJI内置的漂白校正功能（图像 → 调整 → 漂白校正，选择直方图匹配），或专用软件65。
  6. 若胚胎在多个方向和多个荧光通道中被记录，建议将不同方向的图像进行水平拼接（图像 → 堆栈 → 工具 → 合并），并进行通道合并（图像 → 颜色合并 → 通道）。
  7. 对多个方向获取的z层堆栈进行配准与融合70，必要时结合去卷积处理71，可生成具有均匀质量和各向同性分辨率的高质量三维图像。这两个插件均为开源软件，已预装在FIJI中，但需要在样本周围存在标记物（如荧光微球，e.g. beads）。
  8. 也可使用开源软件框架进行大规模定量数据提取与分析，例如细胞核分割与追踪72或细胞形态识别73。

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结果

本方案描述了一种用于活体或固定染色样本荧光成像的实验框架 拟赤须粉虫 由于光漂白和光毒性的水平较低，这是其光学切片能力的直接结果，因此采用LSFM对胚胎进行成像特别适用于长期活体成像。

新型转基因品系 AGOC{ATub'H2B-mEmerald} #1 在 alpha-tubulin 1 启动子的调控下表达组蛋白2B-mEmerald 融合蛋白74。该品系呈现类似增强子捕获的表达模式51，因为荧光信号主要来自浆膜、卵黄囊以及多个神经细胞簇。利用该品系，记录了室温（23±1 °C）下持续 66 小时的胚胎发育过程，涵盖了成胚带回缩和背闭合阶段（补充影片 1）。该品系可用于可视化头部附肢内的神经细胞簇（图 4A）以及背闭合过程中浆膜迁移的动态变化（

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讨论

质量控制

在活体成像实验中，样品制备和图像采集过程必须具有非侵入性， 即 机械和化学处理（收集、去卵膜、固定到样品支架上）以及观察过程中累积的能量负荷均不应影响样本的存活能力。对于表征野生型（WT）发育的研究，建议仅使用那些胚胎在记录过程后仍能存活、成功回收并发育为健康成体的实验数据。该成体不应表现出任何形态学异常，应具有生育能力，其子代也应具备生育能力。长期活体成像实验中存活率较低主要有三个原因：

首先，在第7步中，胚胎表面被大量琼脂糖覆盖，这可能会阻碍离子和气体交换，并对胚胎造成机械性限制。受影响的胚胎，尤其是在早期胚胎发育阶段进行成像时，通常会隐匿性发育数小时，随后突然停止发育并迅速失去荧光信号。积累一定经验后，采用半球法可将嵌入琼脂糖的表面比例控制在三分之一以下，而使用蛛网支架法时，最多仅有一半的胚胎表面被极薄的琼脂糖层覆盖。其次，施加于胚胎的累积能量负荷超过了其耐受限度。第8.2步中提供的数值仅作为经验性参考，但还应考虑以下因素：（i）处于早期胚胎发育阶段的胚胎对激...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

作者贡献

FS 和 EHKS 构思了本研究。FS 构建了转基因 AGOC 品系。FS 和 SK 进行了光片荧光成像。FS 和 EHKS 在 SK 的参与下撰写了手稿。

致谢

感谢 Sven Plath 提供的技术支持。Glia-blue 转基因品系由 Gregor Bucher（德国哥廷根）惠赠。本研究由德国研究基金会（DFG）资助，隶属于美因河畔法兰克福大分子复合物卓越集群（CEF-MC，项目编号 EXC 115，负责人 Volker Dötsch），部分经费授予位于美因河畔法兰克福歌德大学的布赫曼分子生命科学研究所（BMLS，所长 Enrico Schleiff）的 EHKS。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
全麦粉Demeter e.V.1.13E+08美国：全麦面粉，英国：全麦粉
405精制小麦粉Demeter e.V.1.13E+08美国：糕点粉，英国：软质面粉
无活性干酵母Flystuff / Genesee Scientific62-106
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010-023
次氯酸钠，~12% 活性氯Sigma Aldrich425044-250ML注意：次氯酸钠具有腐蚀性
低熔点琼脂糖Carl Roth6351.2
6孔板Orange Scientific4430500
24孔板Orange Scientific4430300
玻璃毛细管，内径 Ø 0.46 mmBrand GmbH + Co KG7087 09
SYTOX GreenThermo Fisher Scientific57020染色液配制方法见表2
YOYO-1 碘化物Thermo Fisher ScientificY3601染色液配制方法见表2
BOBO-3 碘化物Thermo Fisher ScientificB3586染色液配制方法见表2
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽Thermo Fisher ScientificA12379染色液配制方法见表2
Alexa Fluor 546 鬼笔环肽Thermo Fisher ScientificA22283染色液配制方法见表2
筛网，800 µm 孔径VWR International200.025.222-051
筛网，710 µm 孔径VWR International200.025.222-050用于培养基制备（步骤1.1）
筛网，300 µm 孔径VWR International200.025.222-040
筛网，250 µm 孔径VWR International200.025.222-038用于产卵培养基制备（步骤1.2）
玻璃培养皿，Ø 100 mm × 20 mmSigma AldrichCLS70165102
细胞滤网，100 µm 孔径BD Biosciences352360
画笔，刷头直径 Ø 2 mmVWR International149-2121
注射器，1.0 mLB. Braun Medical AG9166017V
闪烁瓶Sigma AldrichM1152-1000EA
多聚甲醛（PFA）Sigma Aldrich158127注意：多聚甲醛有毒且具腐蚀性
正庚烷 ≥99%Carl Roth8654.1注意：正庚烷易燃且有毒
Triton X-100Sigma AldrichX100-100ML注意：Triton X-100具有腐蚀性

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