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利用DNA染料诱导的侧群表型从生物样本中检测和纯化肿瘤干细胞

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DOI：

10.3791/55634

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2017年5月10日

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1Institute of Immunobiology, Kantonsspital St. Gallen, 2Internal Medicine V, Medical University of Innsbruck, 3Tyrolean Cancer Research Institute (TKFI), 4Medical Clinic III, Oncology, Hematology, Immunoncology and Rheumatology, University Clinic Bonn (UKB)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

用于表征和分离生物样本中干细胞群体的方法，对于推动靶向干细胞的癌症治疗及其他疾病治疗至关重要。本文中，我们提供了一种利用染料触发的侧群表型分离癌干细胞的详细实验方案。

摘要

癌症是一种由干细胞驱动的疾病，根除这些细胞已成为主要的治疗目标。解析癌症干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）的脆弱性并鉴定合适的分子靶点，依赖于能够在细胞系等异质性样本中特异性区分这些细胞的方法。 离体 肿瘤组织。流式细胞术/荧光激活细胞分选（FACS）是一种强大的多参数单细胞水平分析生物样本的技术，迄今为止仍是分离活细胞用于后续分析的首选方法。通常利用表面标志物（如CD44和CD133）以及醛脱氢酶酶活性检测，通过FACS来定义并分选出肿瘤样本中的肿瘤干细胞（CSCs）。另一种互补的方法（本文将详细描述其技术流程）则利用ATP结合盒（ABC）药物转运蛋白的功能性染料外排能力，可鉴定出一群荧光信号较弱的细胞亚群，通常称为侧群（side population, SP）。SP 癌细胞表现出典型的干细胞特征，可通过抑制染料外排药物转运蛋白（最常见的是ABCB1/P-糖蛋白/MDR1/CD243和ABCG2/Bcrp1/CD338）的试剂对其进行消除并功能验证。此外，SP 该检测可与其他流式细胞术分析兼容，例如表面抗原染色、醛脱氢酶检测以及死细胞区分例如，使用7-AAD或碘化丙啶（PI））。因此，我们描述了一种基于功能参数而非表型参数的、具有重要价值且广泛适用的肿瘤干细胞（CSC）鉴定、分离及亚群表征方法。尽管该方法最初使用Hoechst 33342作为激发染料，但本文重点介绍基于较新紫色染料的侧群（SP）表型，该表型可在任何配备紫色激光光源的流式细胞仪上进行分析。

引言

由于对癌症的遗传学和分子机制的理解取得了显著进展，以及靶向药物（如治疗性抗体和小分子抑制剂）的出现，过去十年中癌症主要疗法的疗效已大幅提升。然而，转移性和复发性癌症通常仍无法治愈，相关临床情况下的发病率和死亡率依然较高。肿瘤干细胞（CSCs） 是肿瘤内一个独特的亚群，具有典型的干细胞特性，如克隆形成能力/致瘤性、多药耐药性以及不对称细胞分裂1,2。因此，CSCs不仅推动了肿瘤的转移进展和异质性，还在治疗过程中持续存在，导致患者容易复发。因此，有效清除CSCs是预防癌症复发、实现长期治愈的重要医学需求3。

鉴定癌症干细胞（CSCs）的脆弱性并阐明根除这些细胞的策略，在很大程度上依赖于能够从生物样本中纯化CSCs的方法，以便后续进行表达谱分析和/或功能研究。而此类方法又依赖于特异性表达于这些细胞的表面标志物、胞内标志物或功能性标志物。CSC特异性的表面标志物包括但不限于CD44、CD133、CD24和CD90，已被用于在多种肿瘤实体中鉴定CSC群体，如乳腺癌和结肠癌4。另一标志物——醛脱氢酶（ALDH）——定位于细胞内，可通过提供相应底物进行功能性检测，其酶促反应可产生发光信号。利用该检测方法，已在多种肿瘤实体中鉴定出CSC群体5。另一种互补方法通常称为SP 分析，本文将对此方法进行详细描述，该方法利用ABC药物转运蛋白的主动染料外排能力，识别出一群荧光微弱、具有干细胞样特性的稀有细胞群体6,7,8。为实现这一目的，将待测样本与一种脂溶性DNA结合荧光染料共同孵育，该染料通过被动扩散进入所有细胞，并与核DNA和线粒体DNA结合。不表达ABC药物转运蛋白的非CSCs会积累染料而呈现强荧光，而CSCs则能主动将染料排出，导致荧光强度降低。通过药理学手段抑制药物转运蛋白活性可消除该现象，并在功能上验证SP表型，因此应将其作为对照手段使用。具有SP特征的CSC群体已在多种肿瘤中被发现，包括卵巢癌9,10、前列腺癌11,12、乳腺癌13、肺癌14、子宫内膜癌15、胶质瘤16,17以及骨肉瘤18。重要的是，SP检测法既适用于癌细胞系，也适用于原代肿瘤组织，尽管后者存在额外挑战，例如需要特定的肿瘤细胞区分策略（某些宿主细胞群体也可能表现出SP特征）19,20。

赋予SP特性的两种最为明确的药物转运蛋白是ABCB1/P-糖蛋白/MDR1/CD243和ABCG2/Bcrp1/CD3388,9,21；然而，其他药物转运蛋白也可能是SP表型的分子决定因素（例如，ABCB5）22ABCB1 可通过维拉帕米有效阻断，而 ABCG2 的活性则可被烟曲霉素 C（FTC）特异性抑制。6,19SP分析的一个显著优势是可与其他染色方法联合使用（例如，表面标志物和ALDH）并允许活细胞回收，因此可与后续功能研究相兼容。此外，由于CSC群体中ABC药物转运蛋白的高度保守性，SP检测具有广泛的适用性9,23.

最初，SP 的检测使用 Hoechst 33342 作为激发染料24。该染料可实现优异的分辨率，但需要紫外激光激发，因此其应用自然局限于高端流式细胞仪。DyeCycle Violet（DCV）25 的出现为 SP 分析开辟了新途径，并将该方法的应用扩展至缺乏紫外激光源的标准流式细胞仪（仅需紫激光源即可分辨 DCV-SP 细胞）。重要的是，Hoechst 33342 与 DCV 具有相同的泵特异性，表明这两种染料应能识别相同的细胞群体。

本文提供了一种基于DCV的SP分析详细实验方案，便于独立实验室快速、简便地重复该方法。因此，我们认为本文可作为癌症干细胞研究领域研究人员的资源，有助于优化和标准化这一有用的细胞生物学技术。

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方案

本方案完全符合标准的机构伦理审查委员会指南。若使用本方案中所述方法研究人体或动物组织，研究人员必须获得其所在机构或国家相关审查委员会的批准。

注意：本实验方案适用生物样本安全操作的标准预防措施。包括佩戴手套和实验服，并在尽可能的情况下于生物安全柜内进行操作。

1. 细胞的制备

  1. 癌细胞系
    1. 在37 °C条件下，使用10–30 mL适当的培养基培养相应的人或小鼠癌细胞系（例如，RPMI 1640 培养基添加 10%（v/v) 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素）并在细胞亚汇合时收获细胞（即 70-90%），可使用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化或其他细胞解离方法。使用计数板和台盼蓝染色法测定细胞数量并检测细胞活力，活细胞比例应超过85%。
      注意：携带SP的人类癌细胞系示例 细胞系包括 MCF7/HTB-22 和 SKBR3/HTB-30（乳腺癌）、A2780 和 SKOV-3/HTB-77（卵巢癌），以及 A549（肺癌）26.
  2. 离体 肿瘤组织
    1. 取新鲜的手术肿瘤标本，或 alternatively 从可移植性或基因工程小鼠肿瘤模型中获取肿瘤组织。取 200–1,000 mg 组织，通过机械解离法制备单细胞悬液（例如，使用剪刀或手术刀）和酶消化（例如，使用胶原酶/分散酶/DNase 混合酶溶液。
    2. 通过70 µm孔径的滤网过滤样品。使用计数板和台盼蓝染色法测定细胞数量并检测细胞活力。
      注意：消化液通常含有 200 µg/mL 胶原酶 P、0.8 U/mL 中性蛋白酶和 25 µg/mL DNase I，孵育时间通常为 20 至 50 分钟。理想情况下，组织解离应根据针对所研究组织优化的实验方案进行 27,28,29.

2. 测试样品

  1. 将细胞浓度用新鲜培养基调整至 1 × 106 个细胞/mL（使用含营养成分的载体非常重要，因为染料外排是一个需要能量的主动过程）。最后，将 1 mL 样品转移至普通的流式细胞术/FACS 圆底管中（标记为“测试”）。
    注意：为获得最佳结果，可能需要对细胞浓度进行滴定（例如 5 × 105、1 × 106、2.5 × 106 个细胞/mL），但通常较低的细胞浓度可获得更高的分辨率19。仅在分选应用中需要回收最大数量的SP细胞时，建议将细胞浓度提高至最高 1 × 107 个细胞/mL。
  2. 向样品中加入 10 µM DCV，并充分混匀，可通过轻柔涡旋或重悬 3–5 次实现。随后进行抑制对照实验。
    注意：最佳结果可能取决于诱导染料的滴定浓度（例如 2.5、5、10、20 µM），但通常较高的染料浓度可获得更高的分辨率19。

3. 抑制对照

  1. 将250 µL含染料的细胞悬液转移至新的流式细胞术/FACS圆底管中（标记为“对照”）。加入50 µM维拉帕米或20 µM FTC，用移液器充分混匀。
    注意：维拉帕米和FTC是SP分析中最常用的抑制剂，但对不同外排泵具有特异性：维拉帕米可抑制多种ABC药物转运蛋白，包括ABCB1和ABCB5，而FTC特异性抑制ABCG26,19。若样本的SP状态未知，建议在不同的管中分别使用维拉帕米和FTC。

4. 染色

  1. 将“实验”管和“对照”管均盖紧，在37 °C避光孵育90分钟，每15分钟轻柔振荡一次。SP细胞中的大部分染料外排将在前45分钟内完成，但非SP细胞中的染料积累（有助于分辨）需在75–90分钟后才达到最大值19。
  2. 染色完成后，用3–4 mL预冷的PBS洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于100 µL PBS中。保持细胞避光并置于冰上冷却，随后进行其他标记物的染色。或者，可直接进行流式细胞术分析。

5. 其他标记物的共染色

  1. 向DCV染色的细胞中加入所需的一组荧光染料偶联抗体，充分混匀后，在4 °C避光孵育20-30分钟。用3-4 mL预冷的PBS洗涤细胞，随后进行死细胞区分。
    注意：与DCV兼容性良好且几乎无需补偿的抗体荧光染料形式包括PerCP或PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、Alexa Fluor 647、APC-Cy7、APC-H7、BV711、Alexa Fluor 750和BV786。与DCV兼容但可能需要补偿的形式包括FITC、Alexa Fluor 488、PE和BV650。几乎不与DCV兼容的形式包括BV421、V450和V500。
  2. 按照特定生产商推荐的浓度，向DCV染色的细胞中加入7-AAD（或PI），避光孵育5-10分钟。将样品通过70 µm孔径的滤网过滤后，进行流式细胞术分析。

6. 流式细胞术分析

注意：建议在染色过程中即开启相应的流式细胞仪，以便样本准备就绪时所有设置已完成。这包括系统的常规维护程序，如系统性能监测和储液罐的补充。

  1. 在流式细胞仪上获取细胞，并在双变量FSC/SSC点图（图1B）上设门。通过比较FSC的不同信号排除双联体和聚集体即 高度、宽度、面积（图1C）。
    1. 如果已加入死细胞标记物，则对活细胞组分进行圈选（例如，7-AAD阴性）图1D）。在“蓝色”和“红色”DCV发射的双变量点图上观察可存活的单细胞。为此，将“蓝色”荧光通道显示在y轴上例如，450/50）以及横轴上的“红色”荧光通道（例如, 525/50).
    2. 将两个通道均切换至线性模式，并相应调整检测器电压，使SP位于 侧面 位于左下象限的区域。相反，非SP细胞位于右上象限，反映其细胞周期分布（G1和G2期）。圈选SP细胞并停止采集（图1E).
      注意：可使用配备紫色激光激发源的流式细胞仪检测由DCV定义的SP细胞即 405 nm 激光线）。SP 分析的一个特定之处在于，发射荧光以线性模式在两个独立通道中进行检测，并显示在双变量点图上。DCV 的“蓝色”发射光在约 450 nm 处检测例如，使用450/40标准滤光片）和DCV的“红色”发射光在约510 - 585 nm处测量（例如，使用510/50、525/50或585/15滤光片）19由于该检测的特殊化学性质，SP细胞与非SP细胞在“红色”荧光通道中的分离效果通常更明显19.
  2. 加载抑制对照并采集数据。此时，SP细胞已消失或显著减少（图1F如有必要，根据这些数据优化SP门。
  3. 为研究SP细胞的表面标志物表达，将DCV的“红色”荧光保留在x轴上，并在y轴上以对数模式显示相应的荧光通道（例如，APC）。相应调整检测器电压，并圈选对所研究标志物（s）染色呈阳性的SP细胞亚群（图1G）。SP细胞共表达特定标记物时，会在图中左上象限产生相应的信号30.
  4. 记录数据和/或分选SP细胞。

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结果

以下为A2780细胞的代表性SP分析结果，A2780是一种人卵巢癌细胞系，既往研究已证实其含有SP细胞群，占比不足细胞总数的1%9。细胞在37 °C条件下培养于RPMI 1640培养基中，培养基中添加10%（v/v）胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素，当细胞融合度达到85%时，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA处理收获细胞。细胞经PBS洗涤后，通过70 µm孔径滤网过滤。采用计数板和台盼蓝染色法测定细胞数量，并将细胞重悬于新鲜培养基中，调整浓度为1 × 106 个细胞/mL，随后加入10 µM DCV染料，在37 °C避光条件下染色90分钟。同时，取另一份等量细胞样品，在完全相同的条件下加入20 µM FTC进行孵育作为对照。染色后，细胞用4 mL PBS洗涤，向“检测”管中加入预滴定浓度的APC标记ABCG2抗体。4 °C孵育25分钟后，再次用PBS洗涤细胞，并加入7-AAD以标记死细胞。样品置于冰上冷却后，使用流式细胞仪进行分析。图示的设门策略基本可普遍适...

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讨论

癌症临床管理水平的进步还依赖于靶向肿瘤干细胞（CSCs）的治疗手段的发展。能够从生物样本中可靠分离CSCs的方法将加速适宜靶点的鉴定，因此在这一研究方向中具有关键重要性。侧群（SP）分析是一种成熟且有价值的技术，可用于鉴定表达ABC药物转运蛋白的CSC群体，而双循环体积（DCV）方法的引入使其可应用于常规流式细胞仪。从机制上讲，SP鉴别利用ABC药物转运蛋白介导的活性染料外排，通过检测低荧光信号来识别CSCs，表现为特征性的低荧光区域定位 侧面 从图左下角到相应的非SP细胞。重要的是，基于DCV的SP检测是一种稳健且简便的方法，其中最关键的步骤包括：（i）细胞的制备；（ii）染色过程；（iii）选择合适的抑制剂；以及（iv）流式细胞术分析。由于染料外排是一个主动的耗能过程，因此起始细胞活力良好尤为关键；只有存活的（表达药物转运蛋白的）细胞才能形成SP。此外，优化染料浓度与细胞密度之间的比例通常具有重要意义，从而增强SP细胞的分离效果（这反过来需要对DCV和细胞进行滴定）。一般原则是，较高的染料浓度和较低的细胞浓度有助于提高分离效果。19成功进行DCV实验的关键在于使用药理...

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披露

作者声明无利益冲突。在稿件撰写过程中，亦无非作者人员参与。

致谢

Maximilian Boesch 获得奥地利科学基金 FWF 的埃尔温·薛定谔奖学金（项目编号 J-3807）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Vybrant DyeCycle VioletThermo Fisher ScientificV35003即用型
盐酸维拉帕米Sigma-AldrichV4629溶于乙醇
Fumitremorgin CSigma-AldrichF9054溶于DMSO
7-AAD（或碘化丙啶 - PI）BioLegend420403即用型
常规细胞培养试剂（例如，培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、抗生素、PBS、胰蛋白酶-EDTA、等）不同供应商
待测样本/目标细胞（例如，人或小鼠肿瘤细胞系、人或小鼠肿瘤组织）不同供应商
流式细胞仪（FACS；分析仪或细胞分选仪）不同供应商需配备紫色激光光源
FACS管（圆底）不同供应商推荐使用带盖管
70 µm 孔径滤网不同供应商可选但推荐使用
组织消化酶混合液（例如，胶原酶/分散酶/DNase）不同供应商仅适用于组织解离
荧光染料标记的针对目标表面标志物的抗体不同供应商可选
ALDEFLUOR试剂盒STEMCELL Technologies01700可选

参考文献

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