一种无需使用基质即可生成组织构建物的极具前景的技术是在模拟微重力条件下培养细胞。利用旋转式培养系统，我们从卵泡存活率、形态、生长以及卵母细胞功能等方面，考察了模拟微重力条件下卵巢卵泡的生长及卵母细胞的成熟情况。
本文内容
摘要
摘要
14日龄小鼠卵巢组织及从同龄小鼠分离的前窦状卵泡在模拟微重力培养系统中进行培养。我们对卵泡存活率进行了定量评估，测量了卵泡和卵母细胞的直径，并检测了该系统所产生的卵母细胞的超微结构。在模拟微重力条件下，观察到卵泡存活率降低，增殖细胞核抗原（作为颗粒细胞发育指标）和生长分化因子9（作为卵母细胞发育指标）的表达下调，以及卵母细胞出现超微结构异常。模拟微重力实验体系需进一步优化，以建立用于研究卵母细胞/卵泡相关机制的模型。 体外 发育
引言
体外 卵巢卵泡发育和卵母细胞成熟已通过传统二维培养方法（如在培养皿表面）以及三维（3D）基质（如海藻酸盐和水凝胶）实现1,2,3一种三维培养系统能有效维持卵泡的组织样结构，并保持与体内相似的基因表达谱 体内4 卵泡，并产生具有减数分裂能力的卵母细胞5,63D 培养系统也可在无基质条件下建立，例如悬滴悬浮法和旋转培养装置。由美国国家航空航天局（NASA）开发的旋转壁式生物反应器（RWV）可产生模拟微重力（s-µg）环境。g) 对培养于容器内的细胞7这种模拟微重力条件由于不存在沉降和对流，为细胞增殖与分化提供了独特的培养系统。已有研究表明，模拟微重力可促进内皮细胞形成血管样结构。8,9甲状腺细胞组装成甲状腺组织10以及在RWV装置中由脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞分化11然而，其他研究显示，模拟微重力可诱导胃细胞和B淋巴母细胞发生凋亡。12,13,14，表明模拟微重力对细胞损伤的影响可能具有细胞类型依赖性。模拟微重力还可能引起超微结构水平的变化，如卵母细胞中纺锤体结构紊乱和细胞质出泡现象的报道所示15优化的模拟微重力条件及其在该系统中诱导组织工程化或细胞损伤的机制仍需进一步研究。 体外 使用RWV装置培养卵巢卵泡/卵母细胞的实验可为卵母细胞基因表达及卵母细胞细胞器超微结构提供重要信息。本研究采用含前窦状卵泡的卵巢组织及分离的前窦状卵泡，探究模拟微重力的影响卵泡发育和卵母细胞成熟
本研究中，采用含有前窦卵泡的卵巢组织以及分离的前窦卵泡，探究模拟微重力环境对卵泡发育及卵母细胞成熟的影响。在本研究中，旋转壁式生物反应器（RWV）这一模拟微重力装置在5% CO2培养箱内围绕水平轴旋转，可提供具有高效氧合且剪切力极低的模拟微重力环境。我们分别分析了增殖细胞核抗原（PCNA）和生长分化因子9（GDF-9）的基因表达水平，作为颗粒细胞和卵母细胞发育的指标。结果表明，在RWV装置培养条件下，颗粒细胞中的PCNA表达和卵母细胞中的GDF-9表达均受到抑制；同时我们观察到，在模拟微重力（s-µg）条件下培养的卵泡中，卵母细胞微绒毛从透明带回缩的现象，该现象与GDF-9缺陷型小鼠卵泡中的表现相似16。
方案
本研究已获得温州医学院动物研究伦理委员会的伦理批准。
1. 培养基与海藻酸盐水凝胶的制备
- 使用L-15培养基配制卵巢组织和卵泡操作液，其中含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 µg/mL链霉素，4 °C保存两周。
- 配制卵巢组织和卵泡培养基：在α-最小必需培养基[α-MEM]中添加5%胎牛血清[FBS]、1%胰岛素-硒-转铁蛋白、10 mIU/mL重组卵泡刺激素（rFSH）、100 IU/mL青霉素和100 µg/mL链霉素，4 °C保存两周。
- 使用0.8%（w/v）海藻酸钠溶液（溶于无菌PBS）制备海藻酸盐水凝胶，取10 µL该溶液滴入包埋液（140 mM NaCl / 50 mM CaCl2）中以形成海藻酸盐微珠。
注：海藻酸盐微珠直径约为3 mm。
2. 小鼠卵泡的分离与包封
- 采用颈椎脱位法处死14日龄ICR雌性小鼠，用剪刀和镊子无菌取出卵巢，并将卵巢放入2 mL操作液中。
- 使用手术刀将卵巢切成两半。用于培养的半片卵巢组织厚度约为1 mm。
- 在2–4倍体视显微镜下，使用26½号针头手工从卵巢中分离卵泡，并收集符合标准的卵泡用于培养液中的培养。
注意：卵泡筛选标准：1）卵泡呈圆形，卵母细胞位于中央，周围有2–3层颗粒细胞；2）卵泡具有完整的基底膜，并附着部分膜细胞；3）卵泡直径为90–100 µm - 按照步骤1.3制备海藻酸盐微珠。用海藻酸盐溶液洗涤卵泡，然后在体视显微镜下用移液器将单个卵泡移入每个海藻酸盐微珠中央，确保每个微珠仅含一个卵泡。用培养液冲洗后，将海藻酸盐微珠置于35×10 mm培养皿或RWV装置中，加入150 µL培养液进行培养。
3. 模拟微重力条件下卵巢组织或卵泡培养
- 使用 RWV 装置产生模拟微重力环境。将容器中加入轻质石蜡油（约 10 mL），在油中放置一滴培养基（150 µL），然后将一片卵巢组织或三粒包埋卵泡的海藻酸盐微珠转移至培养基液滴中。关闭容器的端口盖，并将容器固定在装置的旋转底座上。
- 在对照组中，将含有卵泡的海藻酸盐微珠或卵巢组织置于 35×10 mm 培养皿中的 150 µL 培养基液滴内，并用轻质石蜡油覆盖。
- 将培养皿和 RWV 装置一同放入湿润的培养箱中，在 37 °C、5% CO2 的空气中孵育。
- 更换 RWV 装置中的培养基时：将容器中的油和培养基倒入 150×20 mm 培养皿中，将卵巢组织或海藻酸盐微珠转移至含有新鲜培养基的培养皿中。按照步骤 3.1 重新建立容器培养系统。
4. 去壳与卵泡采集
- 培养4天后，将油和培养基倒入150×20 mm的培养皿中。收集海藻酸盐微珠，并将卵泡从海藻酸盐微珠中去包封：在添加了10 U/mL海藻酸酶的处理培养基中，于37 °C孵育30分钟。
- 在体视显微镜下收集卵泡，并用处理培养基洗涤。
5. 卵巢组织和卵泡评估
- 细胞活力检测
- 用 D-PBS 将去囊泡的卵泡洗涤三次，然后在 150 µL 的细胞活力检测试剂（2 µM 钙黄绿素 AM 和 4 µM EthD-1）中室温孵育 45 分钟。
- 将卵泡转移至洁净的显微镜载玻片上，加入 10 µL D-PBS，盖上盖玻片，再用透明指甲油封片。
- 在共聚焦荧光显微镜（400X）下计数载玻片上的绿色和红色细胞。
注：在此活力检测中，绿色细胞为活细胞，红色细胞为死细胞。死细胞比例低于 10% 的卵泡被视为存活卵泡。
- 卵巢组织和卵泡的苏木精-伊红（H&E）染色
- 将新鲜的 14 日龄小鼠卵巢以及从 14 日龄小鼠中分离的原始卵泡用 Bouin 溶液固定，作为第 0 天样本；将培养 2 天或 4 天后的卵巢组织，以及培养 4 天后藻酸盐微珠内的单个卵泡作为实验样本进行固定。
- 将所有样本包埋于石蜡中，连续切片至 5 µm 厚度，然后按照制造商说明书进行 H&E 染色。
- 卵泡计数与直径测量
- 在 H&E 染色的卵巢组织切片中，在显微镜下（放大倍数 400X）计数组织切片区内的所有卵泡及健康原始卵泡。通过将原始卵泡数量除以总卵泡数量计算卵泡密度。
注：健康原始卵泡是指具有至少两层颗粒细胞的卵泡。 - 测量第 0 天卵泡和培养第 4 天卵泡的卵泡及卵母细胞直径。
- 在 H&E 染色的卵巢组织切片中，在显微镜下（放大倍数 400X）计数组织切片区内的所有卵泡及健康原始卵泡。通过将原始卵泡数量除以总卵泡数量计算卵泡密度。
- 免疫组织化学
- 将卵巢组织用 4% 多聚甲醛固定，包埋于石蜡中，切片至 5 µm 厚度，并将组织切片贴附于载玻片上。脱蜡、复水后，将切片置于柠檬酸缓冲液中孵育 15 分钟。用 3% 过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，用 5% 山羊血清进行抗原修复，然后在室温下与一抗孵育 3 小时。
- 用 PBS 洗涤 3 分钟，随后在室温下与 1:500 稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔 IgG（H+L）孵育 1 小时。
注：本研究使用的一抗为兔抗 GDF-9 抗体（1:500 稀释）和兔抗 PCNA 抗体（1:200 稀释）。
- 用 PBS 洗涤 3 分钟，随后在室温下与 1:500 稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔 IgG（H+L）孵育 1 小时。
- 将卵巢切片与 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）孵育以检测过氧化物酶活性，并用水性封片剂封片于载玻片上。
- 在显微镜下以 400X 放大倍数观察卵巢切片。
- 将卵巢组织用 4% 多聚甲醛固定，包埋于石蜡中，切片至 5 µm 厚度，并将组织切片贴附于载玻片上。脱蜡、复水后，将切片置于柠檬酸缓冲液中孵育 15 分钟。用 3% 过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，用 5% 山羊血清进行抗原修复，然后在室温下与一抗孵育 3 小时。
- 透射电子显微镜 [TEM]
- 将卵泡在 2.5% 戊二醛中室温固定 3 小时，随后在 1% 锇酸中 37 °C 后固定 1 小时。用 PBS 洗涤后，在 37 °C 下用 1% 磷钨酸和 1% 醋酸铀酰处理卵泡 1 小时。使用丙酮梯度进行脱水：25%、50%、75%、95% 和 100%（每次 3 次），在最后一次 100% 丙酮处理后，于 37 °C 下与环氧树脂-丙酮混合液孵育，最后在 45 °C 下包埋于环氧树脂中。
- 将包埋块切成 1.0 µm 的半薄切片，用 1% 亚甲蓝染色 1–2 分钟以定位组织块中的卵泡。再将包埋块切成 50 nm 的超薄切片，并将切片置于铜网上用于透射电镜观察。
6. 统计学分析
- 所有数据均以均值 ± 标准误（mean ± SEM）形式表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较组间差异，随后进行 Tukey 多重比较检验。检验结果的显著性阈值 α 设定为 p < 0.05。
结果
图1A 显示了旋转壁式生物反应器（RWV）内含有油的装置。将含有一个卵巢组织片段或三个包埋卵泡的海藻酸盐微球的150 µL培养基液滴放入油中。由于在每分钟25转旋转的油中液滴受到流体阻力，该培养基液滴保持在终末速度状态，从而产生模拟微重力（s-µg）环境。在对照实验中，将卵巢组织或包埋的卵泡培养于覆盖矿物油的150 µL培养基液滴中，置于35×10 mm培养皿内（图1B），以产生1-g 的正常重力条件。
研究模拟微重力对前窦卵泡发育的影响 体外，我们在1%的g （对照实验）或 s-µg 条件下。我们对H中的健康卵泡数量进行了计数&E 在培养 0、2 和 4 天后两种条件下的染色切片（图2）。我们发现，经 s- 处理的卵巢组织中卵泡的存活率µg 条件显著低于1-g 培养第2天和第4天的条件（p <0.05，ANOVA）。此外，我们发现，在s-µg 条件图3）。在海藻酸盐微珠包埋的孤立前腔卵泡培养中，我们发现，与1-g 条件（76.8% ± 5.3%，n = 227）相较于s-µg 在培养第4天，两种重力条件下的卵母细胞成熟率相似（54.4% ± 6.7%，n = 249）。此外，培养4天后卵母细胞大小未见显著增加，而两种重力条件下卵泡大小均显著增大图4）。然而，卵泡中死亡的颗粒细胞比例低于10%（图5）在1-g 条件（81.5 ± 5%，n = 10）下高于 s-µg 条件（90 ± 8%，n = 10）(p <0.05).
为研究模拟微重力对卵母细胞功能的影响，我们检测了卵母细胞特异性标志物 GDF-9 的表达。结果显示，在模拟微重力（s-µg）条件下，卵巢组织中 GDF-9 的表达显著下调（图6）。此外，我们还发现，在模拟微重力（s-µg）条件下培养第4天时，包被卵泡中的卵母细胞细胞器频繁出现超微结构异常（图7）。
图 1：s-µg 与 1-g 培养条件的装置示意图。（A）s-µg 通过旋转壁式生物反应器实现，使培养物在运动的油相中处于持续自由落体状态。（B）1-g 条件通过在覆盖矿物油的培养皿表面培养卵巢组织或卵泡实现。箭头指示一滴培养基。比例尺 = 1 cm。本图经 Zhang et al.17 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：s-µg对卵巢组织培养的影响。（A）卵巢组织切片在1-g或s-µg条件下培养0、2和4天的图像。比例尺 = 50 µm。（B）卵巢组织切片中的卵泡密度。误差线表示1个标准误（SEM），*：p <0.05。该图改编自Zhang et al.17 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：PCNA的免疫组织化学染色。 检测了在1-g或s-µg条件下培养0、2和4天的卵巢组织中颗粒细胞的PCNA蛋白表达。比例尺 = 50 µm。本图经Zhang et al.17 修改 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：s-的影响µg 关于海藻酸盐微珠中包封的前腔卵泡的培养 (A) 1-条件下培养的前腔卵泡形态g 或 s-µg 0 天和 4 天的处理条件。比例尺 = 50 µm. (B) 卵母细胞直径和 (C) 卵泡直径在1 g与s-之间进行了比较µg 条件。误差棒代表1个标准误（SEM），*： p <0.05。此图经Zhang修改 等17 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5： 细胞活力检测。 代表性图像在显微镜下以400倍放大倍数拍摄。该检测使用Calcein AM标记活细胞，呈绿色荧光，使用EthD-1标记死细胞的细胞核，呈红色荧光。（A）：一个颗粒细胞存活率约为100%的卵泡（绿色）。（B）：一个含有活颗粒细胞（绿色）以及超过10%死细胞（红色）的卵泡。比例尺 = 50 µm。本图已根据Zhang et al.17 修改。请点击此处查看此图的高清版本。
图6：GDF-9的免疫组织化学分析。 通过免疫组织化学方法检测了在1-g或模拟微重力（s-µg）条件下培养0、2和4天的卵巢组织中卵母细胞内GDF-9蛋白的表达情况。比例尺 = 50 µm。本图已根据Zhang et al.17 修改。请点击此处查看此图的高清版本。
图7：培养第4天在1-g或s-µg条件下培养的分离前窦卵泡的超微结构分析。（A）卵母细胞表面微绒毛（箭头）伸入透明带（1-g条件）。（B-F）卵母细胞中出现大空泡（*）、多层小体（#）、脂滴（箭头）、无嵴空泡化线粒体（箭头）以及分散的高尔基体（箭头）（s-µg条件）。O：卵母细胞；ZP：透明带。该图改编自Zhang et al.17 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
成功培养前窦状卵泡的关键步骤包括：1）根据方案文本2.1中描述的选择标准正确挑选前窦状卵泡；2）在严格无菌条件下进行所有操作，并维持无菌培养环境；3）正确设置RWV培养系统。
为了在重复实验中确保实验观察结果的一致性，应使用相似或相同的材料。小鼠前窦状卵泡的选择标准表明，所选卵泡需具备以下特征：1）卵母细胞处于生发泡破裂（GVBD）阶段，且被一层薄的透明带包围；2）由基底膜包裹的2-3层颗粒细胞；3）基底膜上附着部分膜细胞。因此，所选卵泡不仅包含卵巢卵泡支持卵母细胞生长所需的全部三个功能区室，而且具有相似的形态学特征，直径为90 - 100 µm。
这是首次尝试在模拟微重力条件下采用三维培养方式培养小鼠前腔卵泡。目前已开发出多种用于小鼠前腔卵泡的培养系统。在培养皿平面表面进行培养（即所谓的二维培养）所获得的卵母细胞能够受精并产生活的后代。此外，三维培养系统（如海藻酸盐微珠中的卵泡培养）可维持组织结构接近体内状态，并获得较高比例的具有减数分裂能力的卵母细胞。然而，卵巢卵泡/卵母细胞在零重力环境下的发育过程尚不清楚。旋转壁式生物反应器（RWV）是组织工程领域备受关注的一种装置，可产生模拟微重力环境，为研究模拟微重力对卵巢卵泡/卵母细胞生长的影响提供理想条件。 体外.
正确设置旋转壁式生物反应器（RWV）装置对细胞培养至关重要。必须清除培养容器中的气泡。若容器内产生气泡，可按以下方法去除：在两个注射器端口各插入一支含有0.5 mL油的注射器，打开控制注射器端口的阀门，将气泡移动至注射器端口下方，同时通过另一注射器端口注入约等体积的培养基，将气泡吸入注射器中。待所有气泡清除后，关闭阀门，取下注射器，并重新盖上注射器端口盖帽。此外，确定合适的旋转速度也极为关键，该速度可通过持续旋转防止细胞沉降。旋转速度的优化取决于细胞的比重、流体密度以及黏度。
PCNA 和 GDF-9 的表达谱与 GDF-9 缺陷型小鼠卵泡中的表达谱相似16，表明模拟微重力对颗粒细胞和卵母细胞的发育具有不利影响。RWV 装置的培养容器在含 5% CO2 的培养箱中围绕水平轴旋转，使氧气和二氧化碳能够通过后部的膜进行渗透，从而实现有效的氧合，并产生极低的剪切应力，因此剪切应力不太可能是导致卵泡或卵母细胞损伤的原因。仍需优化实验设置并开展进一步分析，以探究这些不利影响的作用机制。
需要进一步研究以探讨其发育潜能 体外 来自RWV培养系统的卵母细胞。 体外 目前正在进行卵母细胞向MII期的成熟培养。该培养系统的最终验证将通过评估所获卵母细胞的受精能力来完成。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢Yilong Wang和Yanlin Zhao在动物饲养方面提供的帮助，感谢Chan Zhang在制备组织学样品方面的协助，以及感谢何松涛博士对本文稿的审阅。本工作受到浙江省自然科学基金（资助号：LY13C120002）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ICR 小鼠 | SLRC 实验室 | 14 日龄雌性小鼠 | |
| L-15 培养基 | Sigma | L1518 | 含 L-谷氨酰胺，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10100147 | 来源：澳大利亚 |
| 青霉素 V 钾盐 | Sigma | 1504503 | 美国药典（USP）标准品（USP） |
| 链霉素 sesquisulfate 水合物 | Sigma | 46754 | 分析标准品 |
| Universal Click Pen 针头 | Penfine | 12×1/2" 0.33×12 mm | |
| 海藻酸钠 | Sigma | W201502 | |
| α-最低必需培养基 | Sigma | M0894 | α 修饰型，含 L-谷氨酰胺，不含核糖核苷、脱氧核糖核苷和碳酸氢钠，粉末，适用于细胞培养 |
| 胰岛素-硒-转铁蛋白 | Invitrogen | 51500056 | 液体，经无菌过滤，BioReagent，适用于细胞培养 |
| GONAL-F | Merck Serono | 注射用重组促卵泡激素α | |
| 一次性高长径比旋转培养瓶 | Synthecon | 10 mL | |
| 培养用油 | Vitrolife | 无菌轻质石蜡油 | |
| 海藻酸酶 | Sigma | A1603 | 粉末，>10,000 单位/克固体 |
| 26½ 号针头 | Becton Dickinson | ||
| 35×10 mm 培养皿 | Becton Dickinson | ||
| 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒 | Invitrogen | L3224 | |
| Bouin’s 溶液 | Sigma | HT10132 | |
| 辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔 IgG（H+L） | Jackson Immuno-Research Laboratories | 111-035-003 | |
| 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐 | Beyotime | P0203 | |
| 水溶性封片介质 | Dako | C0563 | |
| 兔抗 GDF-9 抗体 | 北京博奥森生物技术有限公司 | BS-175R | |
| 兔抗 PCNA 抗体 | Proteintech | 24036-1-AP | |
| 亚甲蓝 | Sigma | M9140 | |
| 透射电子显微镜 | 日立 | H-7500 |
参考文献
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