胚胎血管生成的可视化与定量分析 Xenopus tropicalis

摘要

本方案展示了一种基于荧光的方法，用于可视化血管系统并量化其复杂性 Xenopus tropicalis在对胚胎进行遗传学和/或药理学干预后，将荧光染料注入跳动的心脏，数分钟后即可对血管系统进行成像，以研究心血管发育过程。 体内.

摘要

血管向全身供应氧气和营养物质，血管网络的形成受到严格的发育调控。高效的 体内 血管的可视化及其复杂性的可靠量化对于理解血管网络的生物学特性及疾病机制至关重要。本文提供了一种利用 commercially available 荧光染料——人血浆乙酰化低密度脂蛋白 DiI 复合物（DiI-AcLDL）——对血管进行可视化，并对其复杂性进行定量分析的详细方法 Xenopus tropicalis通过向胚胎跳动的心脏中简单注射DiI-AcLDL，可对血管进行标记，并可在活体或固定后的胚胎中对整个胚胎的血管系统进行成像。结合靶向显微注射核酸和/或浴式施加药理学试剂以实现基因扰动，可在无需复杂基因工程动物模型的情况下，于一周内研究特定基因或信号通路在血管发育中的作用。由于静脉系统结构清晰 非洲爪蟾 及其典型的血管生成过程——即已有血管的出芽，可在扰动实验后高效地量化血管复杂性。这一相对简单的方案可作为心血管研究多个领域的便捷工具。

引言

血管发生（vasculogenesis）是指由新生的内皮细胞形成新血管的过程，而血管生成（angiogenesis）则是指由已有血管形成新血管的过程，这两种截然不同的过程共同塑造了胚胎的脉管系统¹。这些过程中的任何失调均会导致多种心脏疾病和血管结构异常。此外，肿瘤的生长也与不受控制的血管增生密切相关。因此，血管发生和血管生成背后的分子机制正受到广泛而深入的研究²。

Xenopus 和斑马鱼是研究血管发生和血管生成的优良脊椎动物模型，原因有多个。首先，它们的胚胎体积较小，因此相对容易对整个血管系统进行成像。其次，胚胎发育迅速，整个血管系统的形成仅需数天时间，在此期间可对发育中的血管系统进行实时成像。第三，在血管形成之前或过程中易于实施遗传学和药理学干预，例如通过向发育中的胚胎显微注射反义吗啉代寡核苷酸（MOs），或通过浸泡法施加药物^3,4,5。

Xenopus 相较于斑马鱼的独特优势在于可以进行胚胎学操作，因为 Xenopus 具有典型的全裂卵裂模式，且其胚胎命运图谱已明确界定

方案

所有实验均符合延世大学医学院机构动物护理和使用委员会批准的方案。

1. 准备 Xenopus tropicalis 胚胎

注意：Xenopus tropicalis 胚胎的制备方法如前所述¹⁰，略有修改。Xenopus tropicalis 胚胎的发育阶段根据 Nieuwkoop 和 Faber 的分期表确定¹¹。

1. 诱导排卵
   1. 预先注射：在交配前一天，向一对青蛙（一雌一雄）的背侧淋巴囊内注射人绒毛膜促性腺激素（hCG），每只雌蛙注射20单位，每只雄蛙注射10单位。将一雌一雄置于同一水箱中过夜（超过18小时）。
   2. 次日进行诱导，向预诱导雌性注射200单位hCG，向预诱导雄性注射100单位hCG；诱导后的雌性约3小时后开始产卵，并可持续全天产卵。将雌雄配对保留在同一容器中以进行自然交配，或分别置于不同水箱中以 体外 受精（步骤 1.2）。
2. 受精
   注意：卵子可通过自然交配或 体外 受精。在自然交配过程中，卵子在产出的同时即被受精，因此无法控制受精时间。相比之下，可将一只已诱导成熟的雌性青蛙饲养....

结果

实验时间线（图1和图2）

受精后不久，可进行靶向显微注射以调控基因表达。例如，可注射一种特异性结合内源性 Tie2 mRNA 起始密码子的反义吗啉代寡核苷酸（MO），通过空间位阻抑制 Tie2 靶标 mRNA 的翻译。MO 可与荧光素偶联，便于对成功注射的胚胎进行直观的荧光筛选。或者，可将示踪 mRNA（例如，编码 EGFP 的 mRNA）与 MO 共同注射。此外，药物处理可在孵化后通过浸泡法进行（早期尾芽期，约 NF 26 期）。将药物溶于 0.1× MBS 并加入胚胎中。若需更早处理，可用镊子将胚胎从膜中取出。为了研究血管形成的动态过程，可在 33/34 期左右将 DiI-AcLDL 注射入心脏，但通常我们在 37/38 期或更晚阶段进行注射（图 2，着色区域）。

成功与失败注射的典型示例.......

讨论

本文所述方案最初由 Ali H. Brivanlou 及其同事开发，用于研究 Xenopus laevis⁴ 血管形成过程中的发育事件，但如本论文所示，该方法也可应用于其他小型动物。向心脏注射染料操作简便，整个血管网络可在荧光体视显微镜以及共聚焦显微镜下成像。若在血管发育期间向心脏注射染料，可实时观察血管生长与分支的动态过程⁴。利用结构清晰的静脉网络，特别是后主静脉（PCV）和最前端的节间血管（ISVs），可对遗传或环境干扰因素对血管生成的影响进行定量评估。

本方案中最关键的步骤是DiI-AcLDL的注射（步骤4）。我们提供了成功与失败注射的示例（图3）。应按照步骤4.3所述，在荧光显微镜下筛选成功注射的胚胎。若注射后30分钟仍不可见PCV，则表明DiI-AcLDL注射量不足（图3C）。对于注射失败的胚胎，可重新进行麻醉并再次注射。在某些情况下，DiI-AcLDL可能被注入错误位置，导致其他器官被标记（.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 毫米培养皿	SPL	10035	Sylgard 模具框架
60 毫米培养皿	SPL	10060	胚胎培养托盘
硼硅酸盐玻璃	Sutter instrument	B100-50-10	注射用针头
BSA	Sigma	A3059-10G	包被试剂
CaCl2	D.S.P.GR Reagent		0.1x MBS 组分
盖玻片	Superior	HSU-0111520	用于共聚焦成像
DiI-AcLDL	Thermo Fisher Scientific	L3484	血管染色溶液
FBS	Hyclone	SH.30919.02	用于睾丸保存
光纤照明器	World Precision Instruments	Z-LITE-Z	光源
Ficoll	Sigma	F4375	注射缓冲液
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter instrument	P-97	注射针拉制仪
镊子	Fine Science Tool	11255-20	用于胚胎孵化及 针尖切割
玻璃底培养皿	SPL	100350	用于共聚焦成像
hCG	MNS Korea		用于青蛙诱导排卵
HEPES	Sigma	H3375	缓冲剂
培养箱	Lab. Companion	ILP-02	用于胚胎培养
KCl	DAEJUNG	6566-4400	MBS 组分
L15 培养基	Gibco	11415-114	用于睾丸保存
L-半胱氨酸	Sigma	168149-100G	脱胶试剂
MgSO4	Sigma	M7506	MBS 组分
微量离心管	Axygen	MCT-175-C-S	用于睾丸保存
MS222	Sigma	E10521	麻醉粉末
NaCl	DAEJUNG	7647-14-5	MBS 组分
NaOH	Sigma	S-0899	pH 调节试剂
多聚甲醛	Sigma	P6148	固定剂
PBS	BIOSESANG	P2007	成像用缓冲液
pH 试纸	Sigma	P4536-100EA	用于确认 pH 值
PICO-LITER 注射仪	Waner instruments	PLI-100A	用于注射
针	Pinservice	26002-10	用于切口
持针器	Scitech Korea	26016-12	用于切口
精密立体变倍双目显微镜	World Precision Instruments	PZMIII	用于视觉筛选
标准手动控制显微操作仪	Waner instruments	W4 64-0056	用于显微注射
SYLGARD 184 试剂盒	Dow Corning		用于 DiI 注射
移液管	Korea Ace Scientific Co.	YM.B78-400	用于卵子和 胚胎收集