本方案展示了一种基于荧光的方法，用于可视化血管系统并量化其复杂性 Xenopus tropicalis在对胚胎进行遗传学和/或药理学干预后，将荧光染料注入跳动的心脏，数分钟后即可对血管系统进行成像，以研究心血管发育过程。 体内.
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本文内容
摘要
摘要
血管向全身供应氧气和营养物质，血管网络的形成受到严格的发育调控。高效的 体内 血管的可视化及其复杂性的可靠量化对于理解血管网络的生物学特性及疾病机制至关重要。本文提供了一种利用 commercially available 荧光染料——人血浆乙酰化低密度脂蛋白 DiI 复合物（DiI-AcLDL）——对血管进行可视化，并对其复杂性进行定量分析的详细方法 Xenopus tropicalis通过向胚胎跳动的心脏中简单注射DiI-AcLDL，可对血管进行标记，并可在活体或固定后的胚胎中对整个胚胎的血管系统进行成像。结合靶向显微注射核酸和/或浴式施加药理学试剂以实现基因扰动，可在无需复杂基因工程动物模型的情况下，于一周内研究特定基因或信号通路在血管发育中的作用。由于静脉系统结构清晰 非洲爪蟾 及其典型的血管生成过程——即已有血管的出芽，可在扰动实验后高效地量化血管复杂性。这一相对简单的方案可作为心血管研究多个领域的便捷工具。
引言
血管发生（vasculogenesis）是指由新生的内皮细胞形成新血管的过程，而血管生成（angiogenesis）则是指由已有血管形成新血管的过程，这两种截然不同的过程共同塑造了胚胎的脉管系统1。这些过程中的任何失调均会导致多种心脏疾病和血管结构异常。此外，肿瘤的生长也与不受控制的血管增生密切相关。因此，血管发生和血管生成背后的分子机制正受到广泛而深入的研究2。
Xenopus 和斑马鱼是研究血管发生和血管生成的优良脊椎动物模型，原因有多个。首先，它们的胚胎体积较小，因此相对容易对整个血管系统进行成像。其次，胚胎发育迅速，整个血管系统的形成仅需数天时间，在此期间可对发育中的血管系统进行实时成像。第三，在血管形成之前或过程中易于实施遗传学和药理学干预，例如通过向发育中的胚胎显微注射反义吗啉代寡核苷酸（MOs），或通过浸泡法施加药物3,4,5。
Xenopus 相较于斑马鱼的独特优势在于可以进行胚胎学操作，因为 Xenopus 具有典型的全裂卵裂模式，且其胚胎命运图谱已明确界定6。例如，可以在两细胞期向其中一个细胞注射反义吗啉代寡核苷酸（MO），从而获得仅在一侧体侧发生遗传学操作的胚胎。此外，还可以将一个胚胎的心脏原基移植到另一个胚胎中，以确定该基因的功能是通过细胞自主性还是非自主性机制发挥作用7。尽管这些技术主要是在异源四倍体的 Xenopus laevis 中建立的，因而并不完全适用于遗传学研究，但它们可直接应用于与其亲缘关系密切的二倍体物种 Xenopus tropicalis8。
在活体Xenopus胚胎中可视化血管系统的一种方法是注射荧光染料以标记血管。用荧光分子（如DiI）标记的乙酰化低密度脂蛋白（AcLDL）是一种非常有用的探针。与未乙酰化的LDL不同，AcLDL不与LDL受体结合9，而是被巨噬细胞和内皮细胞通过内吞作用摄取。将DiI-AcLDL注射到活体动物的心脏后，可特异性地荧光标记内皮细胞，从而可通过荧光显微镜对活体或固定胚胎中的整个血管系统进行成像4。
本文介绍了利用DiI-AcLDL对热带爪蟾（Xenopus tropicalis）血管进行可视化和定量分析的详细实验方案（图1）。我们提供了关键的实验操作要点，并列举了成功与失败实验的实例。此外，我们还提供了一种简便的血管复杂性定量分析方法，该方法可用于评估遗传和环境因素对血管网络形成的影响。
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方案
所有实验均符合延世大学医学院机构动物护理和使用委员会批准的方案。
1. 准备 Xenopus tropicalis 胚胎
注意：Xenopus tropicalis 胚胎的制备方法如前所述10，略有修改。Xenopus tropicalis 胚胎的发育阶段根据 Nieuwkoop 和 Faber 的分期表确定11。
- 诱导排卵
- 预先注射：在交配前一天，向一对青蛙（一雌一雄）的背侧淋巴囊内注射人绒毛膜促性腺激素（hCG），每只雌蛙注射20单位，每只雄蛙注射10单位。将一雌一雄置于同一水箱中过夜（超过18小时）。
- 次日进行诱导，向预诱导雌性注射200单位hCG，向预诱导雄性注射100单位hCG；诱导后的雌性约3小时后开始产卵，并可持续全天产卵。将雌雄配对保留在同一容器中以进行自然交配，或分别置于不同水箱中以 体外 受精（步骤 1.2）。
- 受精
注意：卵子可通过自然交配或 体外 受精。在自然交配过程中，卵子在产出的同时即被受精，因此无法控制受精时间。相比之下，可将一只已诱导成熟的雌性青蛙饲养在单独的水箱中，以收集未受精的卵子用于后续实验 体外 受精，可同时产生数百个受精胚胎。当需要在血管标记前对卵裂球进行靶向显微注射时，后一种方法尤为适用。然而，该方法需牺牲一只雄性个体。- 自然交配
- 将已诱导的雌雄个体留在同一水族箱中。雄体会抱住雌体，导致产出的卵立即受精。使用玻璃或塑料移液管收集受精卵，并转移至培养皿中。为防止卵粘附在移液管内壁，需用0.5%牛血清白蛋白（BSA）溶液预先润洗移液管内表面。
- 体外 体外受精（IVF）
- 将诱导后的雌性与雄性分离。雌性大约在3小时后开始自发产卵。使用经BSA包被的移液器吸取少量已产出的卵，转移至培养皿中，并在显微镜下检查其质量。若观察到健康卵子（色素清晰、呈弹性球状），即可准备解剖诱导后的雄性以取出睾丸。
- 制备0.4%三卡因甲磺酸盐（MS222）用于安乐死，向已处理的雄性个体背淋巴囊注射300 µL。约10分钟后，雄性个体将失去平衡感并漂浮于水面；用钝头镊子夹捏其后肢，若无反应，则确认该雄性个体已安乐死。
- 解剖出两侧睾丸，用无绒纸快速轻拍以清洁，然后转移至含有1 mL添加10%胎牛血清（FBS）的60% Leibovitz's L-15培养基（60%）的微量离心管中；详细步骤见其他文献10.
- 用研杵轻轻研磨睾丸以提取精子。在此浓度下（即， 2 个睾丸置于 1 mL 含 10% FBS 的 60% L-15 培养基中，仅需数滴睾丸悬液（0.1 mL）即可使约三百枚卵子受精。剩余精子可密封保存于 4 °C，用于次日的体外受精（IVF）。
- 将卵子从雌性个体中挤入小型培养皿中。将雌性上半身倒置放在手掌上，用食指置于其后肢之间，以食指和另一只手分开后肢，暴露泄殖腔。将泄殖腔轻触培养皿表面。在培养皿表面预先涂覆0.5% BSA，以便在体外受精过程中使卵子均匀分布成单层。
- 向卵子中加入几滴含精子的 L-15 培养基（0.1 mL）。为实现同步受精，轻轻搅动精子溶液使其均匀分布于培养皿中。室温下静置 4 分钟后，用 0.01x 改良巴氏生理盐水（MBS）充满培养皿，孵育 10 分钟，随后更换为 0.1x MBS。受精卵在室温下约 1 小时后将进行第一次卵裂。1x MBS 的成分为 88 mM NaCl、1 mM KCl、2.5 mM NaHCO₃3，5 mM HEPES，1 mM MgSO₄4，以及 0.7 mM CaCl2，pH 7.5。
- 自然交配
- （可选）反义吗啉代寡核苷酸（MOs）和/或 mRNA 的注射
- 为了研究目的基因对血管形成的影响，进行反义吗啉代寡核苷酸（antisense MO）和/或信使RNA（mRNA）的显微注射。
- 对于此类实验，使用含2% L-半胱氨酸的1x MBS溶液（pH 7.5–7.8）去除卵膜。将含有受精胚胎的培养皿中的0.1x MBS替换为含2% L-半胱氨酸的1x MBS溶液，轻轻摇动培养皿以混匀溶液。
注意：胚胎脱胶通常需要约5分钟。在此步骤中，需频繁观察卵子，以确保其未过度暴露于溶液中。若卵子过度暴露，将失去弹性并变扁平，导致发育异常和死亡。 - 用0.1x MBS缓冲液将去胶卵清洗五次。在含有4% Ficoll的0.1x MBS溶液中进行显微注射。通常在二细胞期，每个卵裂球注射4 ng的MO和600 pg的mRNA。仅向其中一个细胞注射，以实现胚胎一侧的基因表达操控。以同一胚胎未注射的一侧作为对照。
- 作为基因操作特异性的另一项对照，注射相同量的对照吗啉代寡核苷酸（CoMO）或对照mRNA例如， β-半乳糖苷酶 mRNA）。CoMO 的分子量必须与基因特异性的 MO 相同，并且不得靶向中国台湾任何基因 非洲爪蟾 基因组。为便于观察注射侧，可使用荧光素标记的吗啉代寡核苷酸（MO）或共注射示踪剂（例如， EGFP mRNA
- 将注射后的胚胎置于4% Ficoll中2小时，然后转移至装有0.1x MBS的新60 mm培养皿中。
- 饲养
- 在23 °C条件下培养胚胎。尽管通过使用低于或高于23 °C的温度（范围：16–26 °C）可分别减缓或加快发育速度，但仍建议在23 °C下进行培养。
- （可选）药理学试剂处理
- 对于药理学操作，通过浸泡法将药物施加于发育中的胚胎。
2. DiI-AcLDL 注射液的制备
- 使用标准的微电极拉制仪制备尖端渐细的玻璃移液管。将硼硅酸盐玻璃管放入微电极拉制仪中，并采用以下参数：气压 200；加热 30；拉力 30；速度 120；时间 200。
- 将 DiI-AcLDL 储存液保存在 4 °C。取溶液上层澄清部分用于注射，避免使用管底的沉淀颗粒。玻璃移液管中的任何碎屑都会干扰溶液的正常喷出。
- 使用微量加样器向制备好的玻璃移液管中加入适量 DiI-AcLDL 溶液（约 5 µL）。
- 使用精细镊子（55 号）逐次剪去玻璃移液管的尖端。调节压力控制注射系统，使每次喷出的溶液体积约为 5 nL；每个胚胎的血管染色使用 50–60 nL DiI-AcLDL 溶液已足够。
- 为避免溶液干燥，不要将装载了 DiI-AcLDL 的移液管长时间暴露在空气中。应将移液管尖端浸没于含 0.04% MS222 的 0.1X MBS 溶液中。在将溶液注入胚胎前（步骤 4.2.1），需检查是否能稳定喷出相同体积的染料。
3. 注射装置设置
- Sylgard模具
- 制备小型Sylgard模具时，按10:1的质量比混合Sylgard基础液与固化剂。将混合液注入小型培养皿（35 mm或60 mm培养皿）约一半高度，于室温下静置约48小时使其固化。
- 麻醉
- 使用含0.04% MS222的1× MBS溶液（pH 7.5–8.0）进行麻醉。当需要长时间麻醉时（例如，活体成像过程中），应使用含0.04% MS222的0.1× MBS溶液，以减少渗透压失衡。调节pH时，加入数滴NaOH（约20 µL），并用pH试纸检测pH值。
- 等待转移的胚胎完全停止运动。轻触胚胎的背鳍，观察其是否无反应，以确认麻醉完全。
- 注射前胚胎的定位
- 用细而锋利的刀片在已固化的Sylgard模具表面刻出凹痕，制作一个V形凹槽用于放置胚胎（见图2D）。将麻醉后的胚胎腹面朝上，以略微倾斜的方式（约30°）放入凹槽中（图2D）。
- 向模具中加入MS222溶液，并将胚胎置于其中。
4. DiI-AcLDL 注射
- 切开心脏表面的皮肤
- 准备两根针（Minutiens，0.10 mm），用于切开覆盖在心脏表面的皮肤。将每根针牢固地固定在持针器上；此时应能清楚识别心脏，因其有搏动（图2A-2C，粉色）。
- 用一根针刺穿胚胎的皮肤。将针从心脏与皮肤之间的空隙处穿过（图2C，实心箭头）。切勿刺破心脏。将该针插入部分置于将要进行切口的区域。
- 通过将另一根持于皮肤外的针轻轻摩擦已插入的针，形成线性切口。用两根针轻轻扩大切口，暴露心脏（图2B' 和 2D'，箭头）。此时，装载 DiI-AcLDL 的移液管可直接接近心脏（图2D'）。
- 注射
- 将装有试剂的玻璃移液管尖端插入心脏，并在约10次喷射脉冲中注入50–60 nL的DiI-AcLDL溶液。切勿注入过量溶液，以免导致心脏破裂。注射后检查心脏是否持续跳动。每次注射后，应检查是否喷射出等量的DiI-AcLDL；否则，移液管尖端可能已被堵塞（见步骤2.5）。
- 恢复与荧光显微观察筛选
- 将注射后的胚胎转移至一个新的培养皿中，皿内盛有0.1x MBS用于恢复。5–10分钟后，蝌蚪应恢复意识并开始活动。此时可对标记的血管进行成像。建议在荧光显微镜下对成功标记的胚胎进行视觉筛选（图3A 和 图3B）。若某胚胎中注入的DiI-AcLDL量不足，可再次注射（图3C）。
- 丢弃其他器官也被标记的蝌蚪（图3D）。持续操作，直至获得所需数量的成功标记胚胎。
- （可选）胚胎固定
- 为更全面地成像血管，可使用共聚焦显微镜；对已标记胚胎进行固定可能更便于共聚焦成像。首先将标记的胚胎在含0.04% MS222的1x MBS（pH 7.5–8.0）中麻醉，随后在含4%多聚甲醛的1X 磷酸盐缓冲液（PBS）中于室温固定1小时。固定后的胚胎可在4 °C下保存数天；需避免光照，以防DiI发生光漂白。
5. DiI-AcLDL 成像
- 立体成像
- 在荧光体视显微镜下拍摄照片（图3），以评估血管系统的整体形态。
- 将1%琼脂糖溶于1×PBS 中用于固定胚胎，或溶于1×MBS中用于活体成像。将熔化的琼脂糖倒入培养皿中，待其凝固。在琼脂糖凝胶表面制作一个浅凹陷，使胚胎侧卧时能够贴合。向培养皿中加入缓冲液（麻醉胚胎使用MS222溶液，固定胚胎使用1×PBS）。
- 荧光显微镜成像（罗丹明滤光片组）
- 由于DiI是一种绿色激发、红色发射的染料，应使用标准的罗丹明或光谱相近的荧光染料滤光片组进行成像（最大激发波长为554 nm，发射波长为571 nm）。将注射后的胚胎置于琼脂糖模具的凹陷中并拍照（图3）。
- 共聚焦显微镜成像
注意：如需对血管结构进行更细致的分析，应使用共聚焦显微镜。- 若使用倒置显微镜，将胚胎放置在底部为玻璃的培养皿中。加入数滴1×PBS，并在其上方加盖盖玻片以固定胚胎。去除多余的PBS。若需对活体胚胎进行成像，则使用麻醉后的胚胎，并以含0.015% MS222的0.1×MBS替代PBS。
- 进行低倍成像时，使用4X至10X物镜寻找目标区域；后主静脉（PCV）的头侧部分是研究发育性血管生成的有用区域（图4，虚线框）。
- 采用适用于红色发射荧光染料（如罗丹明）的采集设置。
- 通过成像胚胎的侧半部分获取z轴层扫图像。首先将焦点对准靠近物镜一侧的PCV侧面，然后将焦距下限设定在靠近物镜的血管最清晰的位置，将上限设定在被成像PCV内侧部分能够清晰对焦的位置。对胚胎整个侧半部分进行成像。使用可存储采集参数元数据（如x、y、z尺度）的软件，因为这些参数是计算血管长度所必需的。
- 如有需要，可使用拼接扫描模式对胚胎的整个血管系统进行成像。根据实际情况确定所需的水平和垂直拼接图像数量。
- 进行高倍成像时，按照上述步骤对PCV的头侧部分以及最前端的4条体节间静脉（ISVs）进行成像（图4，虚线框）。适当调整层数（z轴层扫）和拼接图像数量（拼接扫描）。
6. DiI 标记血管的定量分析
注意：DiI标记的血管可通过手工或软件进行追踪。我们使用 "简单神经突追踪器，" 一个免费的 ImageJ（NIH）插件，可实现对血管和神经突等管状结构的半自动追踪12使用该免费软件，可计算以下参数。该软件的详细使用步骤已在别处描述（https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer）12. 下文我们以胚胎血管为例，其中Tie2信号通路被抑制或增强（图4A-4C)5. 注射反义Tie2MO的胚胎表现出血管生成减少和ISV缩短图4B），而共注射组成型激活的 Tie2 突变体 mRNA（caTie2 mRNA）则过度挽救了该表型，导致ISV分支过度生长（图4C).
- ISV 长度
- 使用 Simple neurite tracer 计算每条被追踪血管的长度。计算最前端的 4 条 ISV 的长度。
- ISV 分支
注：在野生型胚胎中，至 42 阶段时，仅最前端的 ISV 会发出少数短小分支。- 在 Simple neurite tracer 中，将发出这些小血管的 ISV 设为主要分支后，追踪这些小血管。计算起源于 ISV 的这些分支的以下参数。
- 总分支数
- 完成所有 ISV 及其相关分支的追踪后，计算分支总数（图 5B-5D）。
- 分支级数
- 由于 Simple neurite tracer 会记录每个分支的级数（图 5A），请统计各级分支的数量。野生型胚胎中的大多数血管应为一级分支（即 ISV）。
- 静脉复杂度指数（VCI）
- 由于 VCI 是反映血管复杂程度的一个有用参数，且对高级别分支赋予更高权重，因此使用 图 5A 中的公式计算每个胚胎的 VCI。例如，Tie2MO 注射的胚胎 VCI 低于对照组（图 5B 和 图 5C），而 caTie2 mRNA 注射的胚胎 VCI 更高（图 5D）。
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结果
实验时间线（图 1 和图 2）
受精后不久，可进行靶向显微注射以调控基因表达。例如，可注射一种特异性结合内源性 Tie2 mRNA 起始密码子的反义吗啉代寡核苷酸（MO），通过空间位阻抑制 Tie2 靶标 mRNA 的翻译。MO 可与荧光素偶联，便于对成功注射的胚胎进行直观筛选。或者，可将示踪 mRNA（例如，编码 EGFP 的 mRNA）与 MO 共同注射。此外，药物处理可在孵化后通过浸泡法进行（早期尾芽期，约 NF 26 期左右）。将药物溶解于 0.1x MBS 中并加入胚胎。若需更早处理，可用镊子将胚胎从膜中剥离。为了研究血管形成的动态过程，可在约 33/34 期时将 DiI-AcLDL 注射至心脏，但通常我们在 37/38 期或更晚阶段进行注射（图 2，彩色区域）。
成功与失败注射的典...
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讨论
本文所述方案最初由 Ali H. Brivanlou 及其同事开发，用于研究 Xenopus laevis4 血管形成过程中的发育事件，但如本论文所示，该方法也可应用于其他小型动物。向心脏注射染料操作简便，整个血管网络可在荧光体视显微镜以及共聚焦显微镜下成像。若在血管发育期间向心脏注射染料，可实时观察血管生长与分支的动态过程4。利用结构清晰的静脉网络，特别是后主静脉（PCV）和最前端的节间血管（ISVs），可对遗传或环境干扰因素对血管生成的影响进行定量评估。
本方案中最关键的步骤是DiI-AcLDL的注射（步骤4）。我们提供了成功与失败注射的示例（图3）。应按照步骤4.3所述，在荧光显微镜下筛选成功注射的胚胎。若注射后30分钟仍不可见PCV，则表明DiI-AcLDL注射量不足（图3C）。对于注射失败的胚胎，可重新进行麻醉并再次注射。在某些情况下，DiI-AcLDL可能被注入错误位置，导致其他器官被标记（...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究受到以下工作的启发： Levine 等人，该文献描述了此实验方法，并对血管发育进行了全面阐述 非洲爪蟾 我们感谢实验室成员的贡献。本研究由延世大学2015年未来领先研究计划（2015-22-0095）和Bio & 国家研究基金会（NRF）资助的医疗技术开发计划，由科学技术信息通信部资助 & 未来规划（NRF-2013M3A9D5072551）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35 毫米培养皿 | SPL | 10035 | Sylgard 模具框架 |
| 60 毫米培养皿 | SPL | 10060 | 胚胎培养托盘 |
| 硼硅酸盐玻璃 | Sutter instrument | B100-50-10 | 注射用针头 |
| BSA | Sigma | A3059-10G | 包被试剂 |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1x MBS 组分 | |
| 盖玻片 | Superior | HSU-0111520 | 用于共聚焦成像 |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | 血管染色溶液 |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | 用于睾丸保存 |
| 光纤照明器 | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | 光源 |
| Ficoll | Sigma | F4375 | 注射缓冲液 |
| Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 | Sutter instrument | P-97 | 注射针拉制仪 |
| 镊子 | Fine Science Tool | 11255-20 | 用于胚胎孵化及 针尖切割 |
| 玻璃底培养皿 | SPL | 100350 | 用于共聚焦成像 |
| hCG | MNS Korea | 用于青蛙诱导排卵 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | 缓冲剂 |
| 培养箱 | Lab. Companion | ILP-02 | 用于胚胎培养 |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS 组分 |
| L15 培养基 | Gibco | 11415-114 | 用于睾丸保存 |
| L-半胱氨酸 | Sigma | 168149-100G | 脱胶试剂 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS 组分 |
| 微量离心管 | Axygen | MCT-175-C-S | 用于睾丸保存 |
| MS222 | Sigma | E10521 | 麻醉粉末 |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS 组分 |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH 调节试剂 |
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148 | 固定剂 |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | 成像用缓冲液 |
| pH 试纸 | Sigma | P4536-100EA | 用于确认 pH 值 |
| PICO-LITER 注射仪 | Waner instruments | PLI-100A | 用于注射 |
| 针 | Pinservice | 26002-10 | 用于切口 |
| 持针器 | Scitech Korea | 26016-12 | 用于切口 |
| 精密立体变倍双目显微镜 | World Precision Instruments | PZMIII | 用于视觉筛选 |
| 标准手动控制显微操作仪 | Waner instruments | W4 64-0056 | 用于显微注射 |
| SYLGARD 184 试剂盒 | Dow Corning | 用于 DiI 注射 | |
| 移液管 | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | 用于卵子和 胚胎收集 |
参考文献
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