胚胎血管生成的可视化和定量分析热带非洲爪蟾

Summary

该方案证明了一种基于荧光的方法来显示脉管系统并量化其在热带非洲爪蟾中的复杂性 。在遗传和/或药理学操作之后，将荧光染料注射到胚胎的跳动心脏中以在体内研究心血管发育后几分钟可以对血管进行成像。

Abstract

血管在全身供给氧气和营养物质，血管网络的形成受到严格的发展控制。血管的有效体内可视化及其复杂性的可靠定量是了解血管网络的生物学和疾病的关键。在这里，我们提供了一个详细的方法，用市售的荧光染料，人血浆乙酰化低密度脂蛋白DiI复合物（DiI-AcLDL）可视化血管，并量化他们在热带非洲爪蟾的复杂性 。可以通过将DiI-AcLDL简单注入胚胎的跳动心脏来标记血管，并且在整个胚胎中的血管可以在活的或固定的胚胎中成像。通过靶向显微注射核酸和/或药理试剂的浴液应用基因扰动，基因或信号传导途径对血管发育的作用可以揭示在一个星期内不参与复杂的遗传工程动物。由于非洲爪蟾定义良好的静脉系统及其刻板血管生成，预先存在的血管发芽，血管复杂性可以在扰动实验后有效量化。这个相对简单的协议应该作为心血管研究领域的一个易于访问的工具。

Introduction

血管生成，从新出生的内皮细胞形成新血管，血管发生，从先前存在的血管形成新血管，是形成胚胎脉管系统的两个不同的过程。这些过程中的任何调节都会导致各种心脏疾病和血管的结构异常。此外，肿瘤生长与不受控制的血管生长有关。因此，血管发生和血管生成的分子机制是密切研究的对象² 。

非洲爪蟾和斑马鱼是有吸引力的脊椎动物模型，用于血管发生和血管生成研究，原因有几个。首先，他们的胚胎很小;因此，对整个脉管系统进行成像是比较容易的。其次，胚胎发育很快;整个脉管系统只需要几天的时间才能发展，在此期间，发展中的血管可以成像。第三，容器形成之前和期间的遗传和药物干预是容易进行的，例如通过将反义吗啉代核苷酸（MO）显微注射到发育中的胚胎中或通过药物^3,4,5的浴中应用。

非洲爪蟾对斑马鱼的独特优势是可以进行胚胎操作，因为非洲爪蟾遵循定型的全息切割，胚胎命运图很好地定义⁶ 。例如，可以通过在两细胞阶段向一个细胞注射反义MO来产生仅遗传操纵一个侧面的胚胎。还可以将心原子从一个胚胎移植到另一个胚胎，以确定该基因是否通过细胞内在或外在机制发挥其功能ass ="xref"> 7。虽然这些技术主要是在非洲爪蟾属中开发的，它是异源四倍体，因此不适用于遗传研究，但它们可以直接应用于热带非洲爪蟾 ，这是一种密切相关的二倍体物种。

在活非洲爪蟾胚胎中可视化脉管系统的一种方法是注射荧光染料以标记血管。用荧光分子如DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（AcLDL）是非常有用的探针。与未乙酰化LDL不同，AcLDL不与LDL受体⁹结合，但被巨噬细胞和内皮细胞吞噬。将DiI-AcLDL注射到活体动物的心脏中导致内皮细胞的特异性荧光标记，并且可以通过荧光显微镜在活的或固定的胚胎中成像整个脉管系统。

在这里，我们在非洲爪蟾中使用DiI-AcLDL进行血管显像和定量的详细方案（ 图1 ）。我们提供了关键的实践要点，例如成功和不成功的实验。此外，我们提供了一种用于定量分析血管复杂性的直接方法，可用于评估遗传和环境因素对血管网络形成的影响。

Protocol

所有实验均符合延世大学医学院动物保健和使用委员会批准的方案。

1. 非洲爪蟾热带胚胎的准备

注意: 如前所述 ，制作了非洲爪蟾热带胚胎，稍作修改。 非洲爪蟾热带胚胎根据Nieuwkoop和Faber ¹¹的表进行分期。

1. 诱导排卵
   1. 要预先注射，在交配之前一天，将一种青蛙（一只雄性和一只雌性）的人绒毛膜促性腺激素（hCG）注射到背部淋巴囊中。每只雌蛙每只灌注20只，每只雄性10只。在同一个水箱内一个男人和一个女人在一夜之间（超过18小时）。
   2. 首先，第二天将200单位的hCG注射到预先灌注的女性和100单位的hCG中，以预先灌注男;被引导的女性将在约3小时内开始产卵，并且将在全天继续这样做。将雄性和雌性对保持在一起用于自然交配，或在单独的罐中进行体外受精 （步骤1.2）。
2. 受精
   注意:鸡蛋可以通过自然交配或体外受精来受精。在自然交配中，鸡蛋被铺设时受精，因此受精时间不能控制。或者，可以将引发的雌性青蛙饲养在单独的罐中，并且可以收集未受精卵以用于体外受精 ，其同时产生数百个受精的胚胎。当在血管标记之前进行卵裂球靶向显微注射时，后一种方法是有用的。然而，在这种方法中，牺牲了男性。
   1. 自然交配
      1. 在同一个坦克里留下原始的女性和男性对。男性将扣住f导致立即受精的鸡蛋。用玻璃或塑料移液器收集鸡蛋，并将其转移到培养皿中。为了防止鸡蛋粘在移液管上，用0.5％牛血清白蛋白（BSA）涂抹移液管的内表面。
   2. 体外受精 （IVF）
      1. 起动后，将起始的女性与男性分开。女性将在大约3小时内自发产卵。使用BSA涂层移液器将一些铺设的卵转移到培养皿中，并在显微镜下检查其质量。如果放置健康的蛋（透明颜料，弹性球形），准备从被涂的男性中剖析睾丸。
      2. 使0.4％的甲磺酸三甲基氯化钠（MS222）进行安乐死，并将300μL注射到已注射的男性的背部淋巴囊中。大约10分钟后，男性将失去平衡感，并保持活力;确认通过用一个后腿夹住男性来安乐死一对钝镊子，观察无反应。
      3. 解剖出两个睾丸，通过在无绒纸上快速敲打将其清洗干净，并将其转移到含有1 mL 60％Leibovitz L-15培养基（60％）的微管中，补充有10％胎牛血清（FBS）;详细的程序在其他地方描述¹⁰ 。
      4. 用杵轻轻剁碎睾丸以提取精子。在该浓度下（ 即，在1mL 10％FBS在60％L-15 中的 2次睾丸）中，几滴睾丸溶液（0.1mL）可以施用约三百个卵。剩余的精子可以在4°C密封管中储存，第二天用于IVF。
      5. 将鸡蛋从女性挤压成小培养皿。将女性的上半部分倒在手掌上，将食指放在其后腿之间。用食指和另一只手伸展后腿，露出泄殖腔。触摸泄殖腔到培养皿。外套他用0.5％BSA的培养皿在IVF期间以单层均匀分布卵。
      6. 向蛋中加入几滴（0.1 mL）含精液的L-15培养基。对于同步受精，轻轻地将精子溶液搅拌过菜。在室温下4分钟后，用0.01x改良巴斯氏盐水（MBS）填充培养皿，孵育10分钟，并用0.1x MBS替代溶液。受精卵将在室温约1小时内进行第一次裂解。 1×MBS是88mM NaCl，1mM KCl，2.5mM NaHCO 3，5mM HEPES，1mM MgSO ₄和0.7mM CaCl ₂ ，pH7.5。
3. （可选）注射反义吗啉代寡核苷酸（MO）和/或mRNA
   1. 为了研究感兴趣的基因对血管形成的影响，进行反义MO和/或mRNA的显微注射。
   2. 对于这种实验，将1％MBS中2％L-半胱氨酸的鸡蛋冻干（pH 7.5-7.8）。在含有1％MBS中2％L-半胱氨酸的受精胚胎的培养皿中取代0.1x MBS。轻轻旋转盘子混合溶液。
      注意:胚胎脱蛋白通常需要约5分钟。在此步骤中，经常监视鸡蛋，以确保其不会过度暴露于溶液中。如果鸡蛋过度暴露，就会失去弹性并变扁，这将导致异常发育和致死。
   3. 用0.1x MBS洗涤去皮蛋5次。在0.1％MBS中溶解4％Ficoll进行显微注射。通常，在两细胞阶段，每个卵裂球注射4ng的MO和600pg的mRNA。注入一个细胞，仅在胚胎的一侧操纵基因表达。使用同一胚胎的未注射侧作为对照。
   4. 作为基因操作特异性的另一个对照，注入相同量的对照MO（CoMO）或对照mRNA（ 例如， β-半乳糖苷酶mRNA）。 CoMO必须有相同的m作为基因特异性MO的分子量，不能靶向非洲爪蟾基因组中的任何基因。为了容易观察注射侧，使用荧光素标记的MO或共同注射示踪剂（ 如 EGFP mRNA）。
   5. 将注射的胚胎留在4％Ficoll中2小时，然后将其转移到填充有0.1x MBS的新的60mm培养皿中。
4. 提高
   1. 在23℃升高胚胎。虽然通过使用温度低于或高于23°C（范围:16-26°C）可以减缓或加速发展速度，但建议在23°C下升温。
5. （可选）用药理试剂处理
   1. 对于药物操作，通过浴应用向发育中的胚胎施用药物。

2.制备DiI-AcLDL注射液

1. 使用标准微型仪制成锥形玻璃移液器操作面板拉拔器将硼硅酸盐玻璃管放在微量吸管拔出器中，并使用以下设置:压力，200;热，30;拉，30;速度120时间，200。
2. 将DiI-AcLDL储备溶液储存在4°C。取上清液注射溶液，但不要在管底沉淀的颗粒。玻璃移液管中的任何碎屑会干扰溶液的正确喷射。
3. 使用微型加载器，用适量的DiI-AcLDL溶液（〜5μL）填充准备好的玻璃移液管。
4. 用精细的镊子（55号）一点一滴地夹住玻璃移液器的尖端。设置压力控制的注射系统，以便每次喷射约5 nL的溶液; 50-60 nL的DiI-AcLDL溶液足以染色一个胚胎的血管。
5. 不要将DiI-AcLDL装入的吸管长时间放置在空气中，以避免干燥。保持移液管的尖端浸没在0.04％MS222在0.1X MBS溶液中。在将其注入胚胎之前（步骤4.2.1），检查是否喷出相同量的染料。

3.注射设置

1. Sylgard模具
   1. 为了制备小型Sylgard模具，将Sylgard碱和固化剂与重量比为10:1混合，用该混合溶液填充约一半的小培养皿（35mm或60mm皿），然后将其固化约室温48小时。
2. 麻醉
   1. 使用1x MBS（pH 7.5-8.0）中的0.04％MS222进行麻醉。当需要长时间麻醉（ 例如，在实时成像期间），使用0.1％MBS中的0.04％MS222来减少渗透不平衡。要调节pH值，加入几滴NaOH（〜20μL），用pH值纸检查pH值。
   2. 等待转移的胚胎停止移动。触摸胚胎的背鳍，检查它们是否响应确认完成nesthesia。
3. 定位胚胎注射
   1. 用薄而锋利的刀片缩小硬化Sylgard模具的表面。做一个V形的凹陷，放置胚胎（ 见图2D ）。将麻醉的胚胎腹侧面向上倾斜（约30°）（ 图2D ）。
   2. 用MS222溶液填充模具，并将胚胎置于模具中。

DiI-AcLDL注射液

1. 皮肤覆盖心脏的切口
   1. 准备两个针（Minutiens，0.10 mm）以切割心脏覆盖的皮肤。将每个针紧紧地固定在一个针架上;心脏应易于识别，因为它会脉动（ 图2A-2C ，粉红色）。
   2. 用一个针刺穿胚胎的皮肤。将针插入心脏和皮肤之间的空间中的孔（ 图2C ，实线箭头）。不要穿刺心脏。将该引脚的插入部分置于切口的区域。
   3. 通过轻轻地将固定在皮肤外部的另一个针轻轻地摩擦插入的针，进行线性切口。用两个针轻轻加宽这个切口，暴露心脏（ 图2B'和2D' ，箭头）。装有DiI-AcLDL的移液管现在可以直接接近心脏（ 图2D' ）。
2. 注射
   1. 将装载的玻璃移液管的尖端插入心脏，并以约10次喷射脉冲注射50-60 nL的DiI-AcLDL溶液。不要注射过量的溶液，因为它会导致心脏破裂。检查注射后心脏是否继续拍打。每次注射后，检查是否喷出相同量的DiI-AcLDL;否则，移液管的尖端可能被堵塞（参见步骤2.5）。
4. 将注射的胚胎转移到装有0.1x MBS的新培养皿中以进行恢复。 5-10分钟后，ad oles应恢复意识，开始行动。此时，标记的血管可被成像。建议在荧光显微镜下直观筛选成功标记的胚胎（ 图3A和3B ）。如果将不足量的DiI-AcLDL注射到胚胎中，则可以再次注射（ 图3C ）。
5. 丢弃标有其他器官的ad oles（ 图3D ）。继续，直到获得所需数量的成功标记的胚胎。

（可选）胚胎的固定

1. 为了更全面的血管成像，使用共焦显微镜;固定标记的胚胎可能更容易共聚焦显微镜。首先用1×MB的0.04％MS222麻醉标记的胚胎S（pH 7.5-8.0），然后在1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中在4％多聚甲醛中固定1小时。固定的胚胎可以在4℃下储存几天;保护注射的样品免受光照，以避免DiI的漂白。

DiI-AcLDL成像

1. 立体成像
   1. 在荧光立体显微镜下拍照（ 图3 ）以评估脉管系统的整体形态。
   2. 在1x PBS中融合1％琼脂糖固定胚胎或1×MBS用于活体成像。将琼脂糖倒入培养皿中，等到固化。在琼脂糖凝胶表面上形成一个浅凹痕，使其适合在躺在其侧面时成像的胚胎。用缓冲液（MS222麻醉的胚胎溶液或1x PBS固定胚胎）填充盘子。
2. 荧光显微镜（Rhodamine filter seT）
   1. 由于DiI是绿色激发和红色发射的染料，使用用于罗丹明或光谱相关荧光团的标准滤光片的图像（在554nm处的最大激发和在571nm的发射）。将注射的胚胎置于琼脂糖模具上的凹槽中并拍摄照片（ 图3 ）。
3. 共焦显微镜
   注意:为了更紧密地分析血管结构，使用共焦显微镜。
   1. 如果使用倒置显微镜，将胚胎置于玻璃底盘上。加入几滴1x PBS，并通过在顶部放置盖子将其固定。清除多余的PBS。如果活胚成像，使用麻醉的胚胎，并使用0.015％的MS222在0.1x MBS而不是PBS。
   2. 对于低倍率成像，使用4X到10X的物镜来找到感兴趣的区域;后基底静脉（PCV）的分泌部位是调查发育性血管生成的有用区域（图4，虚线）框）。
      1. 使用红色发射荧光团（如罗丹明）的采集设置。
      2. 通过成像胚胎的外侧半部来制作z堆叠的图像。首先，将焦点放在靠近物镜的侧面的PCV上，然后将焦点的下限设置在最接近物镜的血管聚焦的位置处。将被摄体的PCV的中间部分的位置设定为上限。形成整个胚胎的外侧一半。使用在采集设置（如x，y和z标度）上存储元数据的软件，因为它们需要计算容器长度。
      3. 如果需要，使用瓦片扫描模式对胚胎的整个脉管系统进行成像。经验地确定水平和垂直瓦片的数量。
   3. 对于高放大倍率成像，按照上述步骤对PCV的长颈部分和4个最大的吻合脉管（ISV）进行成像（ 图4 ，虚线框）。适当调整堆栈数（z堆叠）和图块（平铺扫描）。

DiI标记船只的定量

注意:可以手动或使用软件追踪DiI标记的血管。我们使用"简单神经轴追踪器"，一个免费的ImageJ（NIH）插件，允许半自动跟踪管状结构，如血管和神经突¹² 。使用这个免费软件，可以计算以下参数。使用此软件的详细步骤在别处描述（https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer）12。以下，我们使用Tie2信号传导被抑制或增强的胚胎脉管系统的实例（ 图4A-4C ）。反义Tie2MO注射的胚胎表现出减少血管生成并缩短ISV（ 图4B ），而共注射组成型活性Tie2突变体mRNA（caTie2 mRNA）过度挽救了这种表型，导致了旺盛的ISV分支（ 图4C ）。

1. ISV长度
   1. 使用简单的神经轴示踪剂，计算每个追踪血管的长度。计算4个最常见的ISV的长度。
2. ISV分支机构
   注意:在野生型胚胎中，只有少数短枝在第42阶段从最常见的ISVs发芽。
   1. 在简单的神经突征示踪剂中，追踪这些小血管，使ISV从其起源于主要分支。计算源自ISV的这些分支的以下参数。
   2. 总支数
      1. 一旦所有ISV和相关联的分支被追踪，计算总分支数（ 图5B-5D ）。
   3. 分行订单
      1. 由于简单的神经轴跟踪记录每个分支的顺序（ 图5A ），计算e每个订单的分支数量。野生型胚胎中的大多数血管应为主要分支（ 即 ISV）。
   4. 静脉复杂指数（VCI）
      1. 由于VCI是容器复杂性的有用参数，其给予较高阶分支更多的权重，使用图5A中的公式计算每个胚胎的VCI。例如，与对照相比，Tie2MO注射的胚胎具有较低的VCI（ 图5B和5C ），并且caTie2mRNA注射的胚胎具有较高的VCI（ 图5D ）。

Results

实验时间表（图1和图2）

受精后不久，可以进行靶向显微注射以调节基因表达。例如，可以注射特异性结合内源性Tie2mRNA的起始密码子的反义MO，通过空间位阻抑制Tie2靶mRNA的翻译。 MO可以与荧光素缀合，以便成功注射胚胎的容易的目视筛选。或者，示踪剂mRNA（ 例如，编码EGFP的mRNA）可以与MO共注射。另外，药物可以通过孵化后的浴液治疗（早期尾巴阶段，NF阶段26周围）。将药物溶解于0.1x MBS，并将其加入胚胎。对于早期治疗，胚胎可以用一对镊子从膜中释放出来。 DiI-AcLDL可以注射到33/34级周围的心脏中，以调查血管形态的动态但通常我们在37/38或更高阶段注射（ 图2 ，彩色区域）。

成功和不成功注射的典型例子（步骤4.3）（图3）

Discussion

这里提出的方案首先由Ali H.Brivanlou及其同事开发，以调查非洲爪蟾 ^4的血管形成过程中的发育事件，但如本手稿所示，可用于其他小动物。将染料注入心脏很容易进行，整个血管网络可以在荧光解剖显微镜下以及共聚焦显微镜下成像。如果染料在血管发育过程中注入心脏，血管生长和分支的动力学可以实时成像⁴ 。使用明确定义的静脉网络，特别是PCV和最流行的ISV，可以定量评估遗传或环境扰动对血管生成的影响。

该协议中最关键的一步是注入DiI-AcLDL（步骤4）。我们提供成功和不成功注射的实例（ Fi3）。成功注射的胚胎应在荧光显微镜下进行筛选，如步骤4.3所述。如果PCV在注射后30分钟不可见，则不能注射足够的DiI-AcLDL（ 图3C ）。不成功注射的胚胎可能被麻醉并再次注射。在某些情况下，DiI-AcLDL可能被注入不正确的位置，在这种情况下，其他器官将被标记（ 图3D ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm 培养皿	SPL	10035	Sylgard 模具框架
60 mm 培养皿	SPL	10060	胚胎饲养盘
硼硅酸盐玻璃	萨特仪	B100-50-10	注射针
BSA	Sigma	A3059-10G	涂层试剂
CaCl2	D.S.P.GR 试剂		0.1x MBS组件
盖玻片	Superior	HSU-0111520	用于共聚焦成像
DiI-AcLDL	Thermo Fisher Scientific	L3484	容器染色溶液
FBS	Hyclone	SH.30919.02	用于储存睾丸
照明器	World Precision Instruments	Z-LITE-Z	Light
Ficoll	Sigma	F4375	注射缓冲液
火焰/棕色微量移液器 拉拔器	萨特仪器	P-97	注射针拔出器
镊子	精细科学工具	11255-20	用于胚胎孵化和 针尖切割
玻璃底培养皿	SPL	100350	用于共聚焦成像
hCG	MNS Korea		用于青蛙的启动器
HEPES	Sigma	H3375	缓冲剂
培养箱	实验室 伴侣	ILP-02	用于培养胚胎
KCl	DAEJUNG	6566-4400	MBS 组分
L15 培养基	Gibco	11415-114	用于储存睾丸
L-半胱氨酸	Sigma	168149-100G	去胶试剂
MgSO4	Sigma	M7506	MBS 组分
微管	Axygen	MCT-175-C-S	用于储存睾丸
MS222	Sigma	E10521	麻醉粉
NaCl	DAEJUNG	7647-14-5	MBS 成分
NaOH	Sigma	S-0899	pH 调节试剂
多聚甲醛	Sigma	P6148	固定剂
PBS	BIOSESANG	P2007	用于成像的缓冲液
pH 纸	Sigma	P4536-100EA	用于确认
pH PICO-LITER 注射器	Waner 仪器	PLI-100A	用于注射
Pinin	Pinservice	26002-10	用于切口
Pinholder	Scitech Korea	26016-12	用于切口
精密立体变焦双目显微镜	WorldPrecision Instruments	PZMIII	用于视觉筛选
标准手动控制显微作器	Waner instruments	W4 64-0056	用于显微注射
SYLGARD 184 套件	Dow Corning		用于 DiI 注射
移液管	韩国 Ace Scientific Co.	YM 的。B78-400	用于鸡蛋和 胚胎采集