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方法文章

脑膜组分分离：一种 离体 评估突触下蛋白定位的方法

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DOI：

10.3791/55661

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2017年5月12日

 ,  ,  ,  , 
1Unitat de Farmacologia, Departament Patologia i Terapèutica Experimental, Facultat de Medicina, IDIBELL, Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat, 2Institut de Neurociències, Universitat de Barcelona, 3Center for Neurosciences of Coimbra, Institute of Biochemistry, Faculty of Medicine, University of Coimbra

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍一种脑膜分级分离方案，该方案是一种可靠的分离方法，可用于提取属于不同突触区室的蛋白质。

摘要

评估突触蛋白的组成与功能是神经科学领域的重要挑战。然而，要评估突触内发生的神经传递过程并不容易，因为该过程受到动态的蛋白质-蛋白质相互作用和磷酸化事件的高度调控。因此，无论采用何种方法研究突触传递，一个主要目标都是保留这些短暂的生理修饰。本文介绍一种脑膜分级分离方案，该方案是一种有效分离来自不同突触区室蛋白的可靠方法。换句话说，该方案描述了一种生物化学方法，用于实现突触前、突触后及突触外区室蛋白的富集。首先，通过不连续蔗糖梯度离心法从包含所有突触区室的神经元中获取突触体（即突触末梢）。值得注意的是，初始突触膜制备的质量至关重要。随后，在不同pH条件下使用温和去垢剂进行轻度溶解，从而实现不同突触下区室的分离。此步骤可通过梯度离心和等密度离心实现分离。最后，实现不同突触下区室中的蛋白富集即， 通过使用已充分表征的突触蛋白标志物进行免疫印迹分析，验证了突触前、突触后及突触外膜组分即， SNAP-25、PSD-95 和突触素），从而实现对任何特定神经元蛋白突触分布的直接评估。

引言

突触传递依赖于突触的物理完整性，这一概念早在1897年就由Foster和Sherrington提出1因此，了解关键神经传递组分的分布（例如， 离子通道，受体， 等等。) 对于阐明正常及病理条件下突触功能至关重要。电子显微镜（EM）极大地推动了人们对中枢神经系统（CNS）典型突触超微结构的认识。通过该技术，EM 精确揭示了突触前致密区与突触后致密区之间的差异，二者被一个宽度相对均一的突触间隙分隔（约 25 nm）。2有趣的是，突触后结构在其质膜下方表现出一种相对连续的、电子致密的增厚区域，即所谓的突触后致密区（postsynaptic density，PSD）。2相反，在突触前结构中，质膜下方排列着明显的不连续细胞质基质网络，该网络对于突触小泡在质膜活性区的定位与锚定至关重要。3因此，电镜（EM）是研究蛋白质在结构完整中枢神经系统突触中分布情况的金标准实验方法。然而，电镜图像所提供的信息是静态的。事实上，越来越多的证据表明 体内 突触具有极强的动态性，因此在持续的突触传递过程中会经历显著的结构变化。此外，突触的形态和组成在中枢神经系统不同区域之间，以及在发育、成熟、衰老和神经病理状态形成过程中均可发生变化。总体而言，一种专注于在生理条件下分离不同突触区室蛋白质的实验方案，为更全面地研究突触功能提供了有力工具。

在此，我们介绍一种互补性的实验方法，该方法可实现对不同突触膜区室——即突触外、突触前和突触后膜区域——进行制备性生化富集。这种膜组分分离方法最初由 Philips 报道 等. (2001)4基于pH值变化，该方法可削弱突触前和突触后结构内部的黏附相互作用。首先，在pH 6.0条件下使用温和去垢剂，可区分出连接突触前和突触后结构的黏附连接，该连接与细胞外突触膜区域相维持，而后者被溶解，因而可从突触接触部位中提取。随后，在温和去垢剂存在下将pH值从6.0升至8.0，可削弱将突触前活性区与突触后致密区紧密连接的黏附连接强度。因此，突触前组分被溶解，可与大部分保留的突触后致密区分离开来，这是因为所用去垢剂浓度不足以促使其溶解。4有趣的是，通过不同的突触下标记物可以证实，分馏效率最终可高于90%： i突触小体相关蛋白25（SNAP-25），来源于突触前活性区； ii突触素，来自突触外组分（即， 活性区外（包括微粒体）； iii突触后密度蛋白95（PSD-95）从突触后密度中分离。值得注意的是，该脑膜分级分离方法已成功应用，从而能够精确定位不同受体在突触下的分布，例如α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸（AMPA）受体5，腺苷A1 受体（A1R)6，腺苷A2A 受体（A2AR)7，三磷酸腺苷（ATP）P2受体8烟碱型乙酰胆碱受体亚基9以及帕金森病相关受体GPR3710然而，一些局限性可能会妨碍对特定神经元蛋白突触分布的准确评估。因此，在本实验方案中，我们不仅完整描述了整个实验流程，还强调了一些需要考虑的关键点，例如所需组织量较大、蛋白得率较低，以及在进行最终实验前必须验证每次分离步骤效率的必要性。

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方案

所有动物实验程序均经巴塞罗那大学动物使用与护理委员会（CEEA）批准，符合《实验动物护理与使用指南》中所述的指导原则。11 并遵循欧洲共同体法律86/609/CCE、FELASA和ARRIVE指南。因此，小鼠饲养于标准笼具中， 随意摄取 可自由获取食物和水，并在受控的标准条件下饲养（光照/黑暗周期为12小时，从上午7:30开始，温度22 °C，湿度66%）。

1. 使用不连续蔗糖梯度分离小鼠脑突触体

注意：此方法先前已有报道10。

  1. 配制新鲜的分离缓冲液（IB），pH 7.4；2 M 蔗糖；1 M 蔗糖/0.1 mM CaCl2；以及 0.1 mM CaCl2 （参见 表1）。将溶液置于冰上冷却。
  2. 通过颈椎脱位法处死五只小鼠。断头并迅速取出每只动物的脑组织。解剖出目标脑区 即， 海马体，0.25–0.35 g新鲜组织），置于盛有1 mL IB缓冲液的5 mL Potter-Elvehjem玻璃匀浆管中，冰上放置。
  3. 使用匀浆搅拌器在冰浴中匀浆组织（700–900 转/分钟，10 次），优先在冰浴中进行以防止样品升温。
  4. 将匀浆组织（1 mL）放入含有6 mL 2 M蔗糖和2.5 mL 0.1 mM CaCl的15 mL离心管中2 4 °C下，通过轻轻翻转试管缓慢混匀。
    注意：钙离子的添加对于维持细胞器之间的黏附相互作用至关重要，因此对保持各细胞器结构的完整性具有重要作用 "密度。"
  5. 将溶液置于12 mL离心管中，缓慢加入2.5 mL的1 M蔗糖/0.1 mM CaCl2 在每根试管上方形成蔗糖梯度。
    注意：使用永久性记号笔在离心管上标记梯度界面的位置。
  6. 称重并用相应的IB溶液在钢制支架内及其盖子中平衡离心管。
  7. 将离心管在 100,000 x g 条件下离心 3 小时 g 使用摆桶式转子离心机在4 °C下离心。转子中的所有钢制支架必须完全填满（即使空置，如有需要也应放入）。
  8. 弃去含有髓鞘的上层。用巴斯德吸管收集1.25 M与1 M蔗糖界面之间对应于突触体组分的白色环状物。
  9. 在离心管中，用裂解缓冲液（IB）将突触体稀释至原体积的10倍。
  10. 称重并用相应的IB溶液在钢制支架内及其盖子中平衡离心管。
  11. 将离心管在15,000 x g条件下离心30分钟 g 使用摆桶转子离心机在4 °C下离心。
  12. 弃去上清液，用 1.1 mL IB 溶液重悬沉淀。取 100 µL 该突触体溶液，于 11,000 x g 离心 5 分钟 g 和 4 ºC。
  13. 将突触体沉淀重悬于5%十二烷基硫酸钠（SDS）中，并将该样品于-20 °C保存。
    注意：该样品将用于后续 Western 印迹分析的总突触体组分。剩余的突触体组分（约 1 mL）可保存在 -20 ºC 冰箱中冷冻备用，或用于进一步的亚突触分级分离。突触体或纯化的突触约占总海马体积的 1% 至 2%12.

2. 突触前、突触后及突触外分离

  1. 配制2倍浓度的新鲜溶解缓冲液，pH 6.0；1倍浓度的溶解缓冲液，pH 6.0；溶解缓冲液，pH 8.0；以及0.1 mM CaCl₂2 （参见 表1). 将溶液置于冰上冷却。
    注意：应准确调节这些溶液的 pH，以获得良好的突触下组分分离。
  2. 缓慢地将1 mL重悬的突触体组分（见步骤1.12）用5 mL 0.1 mM CaCl₂稀释2.
  3. 加入等体积（5 mL）预冷的2倍溶解缓冲液（pH 6.0），置于冰上，在烧杯中剧烈振荡孵育50分钟。
    注意：虽然在 pH 6.0 条件下，1% Triton X-100 可溶解所有质膜蛋白，但它能保留突触接触部位或连接结构中的蛋白质即， 突触前和突触后结构4.
  4. 将溶液放入离心管中。称重并用等体积的0.1 mM CaCl平衡各管2 以及对应钢制支撑架和闭合盖子中的2倍溶解缓冲液，pH 6.0。
  5. 将试管在 40,000 x g 条件下离心 30 分钟 g 以及在4 °C下使用摆桶转子离心机进行离心。所得上清液代表突触外部分，沉淀物对应于突触连接部位（即， 突触前和突触后组分
  6. 使用15 mL 10K滤管，在4,000 × g和4 ºC条件下离心，将含有突触外组分的上清液浓缩至终体积200 µL。
  7. 将所得的浓缩突触外组分（200 µL）与5倍体积（1 mL）预冷的（-20 °C）丙酮混合，于-20 °C过夜沉淀。
  8. 第二天，将突触外组分在 18,000 x g 条件下离心 30 分钟 g -15 °C。离心后，弃去丙酮上清液，并将沉淀干燥以去除任何残留的丙酮。
  9. 最后，用200 µL的5% SDS重悬含有突触外蛋白的沉淀。如有需要，对沉淀进行超声处理。
  10. 在不破坏沉淀的前提下，用 2 mL 1× 溶解缓冲液（pH 6.0）小心洗涤含有突触前和突触后组分的沉淀。弃去上清液。
  11. 用玻璃巴斯德吸管加入10 mL pH 8.0的1×溶解缓冲液重悬沉淀。
    注意：尽管在 pH 8.0 条件下 1% Triton X-100 可溶解突触前特化结构，但它能保留不溶性的突触后密度4.
  12. 将悬液置于冰上，在烧杯中剧烈振荡，冰浴孵育50分钟。
  13. 将溶液置于离心管中。用pH 8.0的1×溶解缓冲液，在相应的钢制支架中对离心管进行称重并平衡，并盖上管盖。
  14. 将试管在 40,000 x g 条件下离心 30 分钟 g 使用摆桶转子离心机在4 °C条件下离心；所得上清液为突触前组分，沉淀为突触后组分。
  15. 按照步骤 2.6-2.9 所述，处理含有突触前组分的上清液。
  16. 用200 µL的5% SDS重悬含有突触后组分的沉淀。如有需要，可对沉淀进行超声处理。

3. 通过免疫印迹分析样品以验证膜组分分离效果

  1. 测定各组分中的蛋白质量（即， 使用二辛可宁酸蛋白测定法检测总蛋白、胞外蛋白、突触前和突触后组分。
  2. 取各组分中的20 µg蛋白质，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品缓冲液稀释至终体积50 µL。在100 ºC下煮沸5分钟。
  3. 使用10% SDS-PAGE电泳分离蛋白质，浓缩胶浓度为4%，在还原条件下进行。以恒定电压80 V电泳，直至染料进入分离胶，随后将电压提高至120 V。
  4. 将蛋白质转移至PVDF膜，并在室温下用IB封闭液持续振荡封闭45分钟。
  5. 4 ºC 下用指定的一抗孵育膜过夜（即， 抗SNAP-25、抗PSD-95、抗突触素或抗GPR37）用IB封闭液稀释后，在持续振荡条件下孵育。
  6. 用IB洗涤液洗涤膜三次，每次10分钟，以去除未结合的一抗。
  7. 在室温下避光、持续振荡的条件下，与相应的二抗孵育90分钟。
  8. 用IB洗涤液洗涤膜三次，每次10分钟，以去除未结合的二抗。
  9. 在避光条件下，按照生产商提供的溶液A与溶液B 1:1的比例配制化学发光底物工作液，并将膜与该底物共同孵育。
  10. 在化学发光检测装置中分析膜。

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结果

所描述的方法学已广泛用于神经元蛋白的突触下分析，以及突触受体的分离与生物化学表征5,6,7,8,9 特别是。有趣的是，此处展示的代表性结果表明，该实验方法可用于分析孤儿G蛋白偶联受体——即与帕金森病相关的受体GPR37——在海马区突触下分布的情况。10GPR37 最初是通过搜索内皮素和铃蟾素受体的同源物而被发现的13，尽管发现其不与内皮素或相关肽结合。取而代之的是，GPR37被提议可由头激活肽激活14,15,

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讨论

本文所介绍的方案是一种用于研究任意脑区内特定蛋白质在突触下分布的强有力生化工具。然而，该技术本身存在一些固有缺陷，需在此予以强调。例如，主要局限之一是需要相对大量的组织，才能纯化出足够进行所有突触下组分免疫印迹分析的蛋白质。这一问题可能与突触（即， 突触体仅占海马体总体积的1-2%12确实，取1至1.5克新鲜组织（即， 需要足够的海马组织才能成功进行分级分离；否则，产量过低，无法评估所研究蛋白的身份及其定位。

相反，如果使用过多的脑组织，则分离过程将无法达到最佳效果。此外，必须仔细调节溶液的pH值，以确保获得最佳的突触下组分分离。因此，每次进行脑膜组分分离时，都必须在进一步研究之前验证各组分分离的效率。需要特别注意的是，由于抑制性突触在结构和分布上的差异，本方案不太适用于抑制性突触的突触下分离。然而，尽管存在这些局限性，该实验方法的巨大实用性仍不容忽视，毫无疑问，它将成为突触研究中的一种通用方法。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了经济与竞争力部/卡洛斯三世健康研究所（SAF2014-55700-P、PCIN-2013-019-C03-03 和 PIE14/00034）、加泰罗尼亚高级研究机构（ICREA Academia-2010）以及比利时佛兰德斯科技创新署（SBO-140028）对 F. C. 的资助。此外，X. M.、V. F.-D. 和 F. C. 隶属于加泰罗尼亚政府认证的研究团队“神经药理学与疼痛”（2014 SGR 1251）。本工作还得到了巴西科学与技术发展协调机构（CAPES）“特聘访问学者计划—科学无国界”项目对 F. C. 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蔗糖Pancreac Química SL, Barcelona, Spain1,316,211,211
CaCl2Pancreac Química SL, Barcelona, Spain2,112,211,210
MgCl2·6H2OPancreac Química SL, Barcelona, Spain1,313,961,210
蛋白酶抑制剂混合物 Set IIIMillipore, Darmstadt, Germany535140
Trizma BaseSigma, St. Louis, MO, USAT1503
Tris-HClPancreac Química SL, Barcelona, Spain1,236,541,209
Triton X-100Sigma, St. Louis, MO, USAX100
SDSSigma, St. Louis, MO, USAL3771
甘油Sigma, St. Louis, MO, USAG5516
溴酚蓝Pancreac Química SL, Barcelona, Spain1,311,651,604
二硫苏糖醇Sigma, St. Louis, MO, USAD0632
Tween 20Sigma, St. Louis, MO, USAP2287
脱脂奶粉
NaClPancreac Química SL, Barcelona, Spain1,216,591,211
KClPancreac Química SL, Barcelona, Spain1,314,941,210
KH2PO4Merck4873
Na2HPO4Pancreac Química SL, Barcelona, Spain1,316,781,211
Basic 20 pHCrison, Alella, Spain
Polytron VDI 12 可调式匀浆器VWR, Radnor, PA, USA.
超透明离心管（14×89 mm）Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona344059使用时应将离心管几乎完全装满，以防止因超速离心导致管体塌陷。
Amicon Ultra-15 离心过滤器 Ultracel-10KMerck Millipore, Darmstadt, GermanyUFC901008
Centrifuge 5430REppendorf, Hamburgo, Germany
Optima L-90K 超速离心机Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona
Sonifier 250Branson, Danbury, Connecticut
Amersham Imager 600GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain
一次性玻璃巴斯德吸管 230 mmVWR, Radnor, PA, USA612-1702
Compact Balance EK-610A&D, Tokyo, Japan
Pierce™ BCA 蛋白检测试剂盒Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA
SuperSignal west pico 化学发光底物Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA
GR 200 精密天平A&D, Tokyo, Japan
Anti-GPR37由 Francisco Ciruela 实验室自制并验证的抗 GPR37 抗体。一抗使用终浓度为 0.250 μg/mL
Anti-SNAP-25、anti-PSD-95、anti-synaptophysinAbcam, Cambridge, United Kingdom一抗稀释比例为 1:10,000
HRP 标记的山羊抗小鼠 IgGThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.二抗稀释比例为 1:10,000
HRP 标记的山羊抗兔 IgGThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.二抗稀释比例为 1:30,000

参考文献

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