本文介绍了一种高效的方法，用于水解从镍-席夫碱配合物中分离得到的氨基酸，并随后进行Fmoc保护。本文所述的水解条件适用于需要保留对酸敏感的侧链保护基团的情况。该技术可适用于多种非天然氨基酸底物。
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本文内容
摘要
摘要
非天然氨基酸是指侧链官能团在自然界中不常见的氨基酸，其在合成肽序列中的应用日益广泛。某些非天然氨基酸的合成通常涉及使用由镍阳离子稳定的席夫碱作为前体。非天然侧链可被引入该席夫碱配合物中的氨基酸骨架上。随后可通过席夫碱的水解（通常在强酸性溶液中回流）将所得的非天然氨基酸从该配合物中分离出来。然而，这种强酸性条件可能会脱除对非天然氨基酸在微波辅助固相肽合成中所必需的酸敏感侧链保护基团。本文介绍了一种从镍-席夫碱配合物中分离氨基酸后高效进行水解及后续Fmoc保护的方法。本文所提出的水解条件适用于保留酸敏感的侧链保护基团，并可适用于多种非天然氨基酸底物。
引言
含有与自然界存在的20种天然氨基酸侧链不同的侧链的非天然氨基酸（UAA）已在多种应用中展现出用途。然而，这些UAA的合成可能较为困难，具体取决于侧链的结构和氨基酸骨架的立体化学。在镍-席夫碱配合物体系中，通过对甘氨酸进行C-H键活化，已成功制备出多种氨基酸衍生物，包括α,β-二氨基氨基酸1以及带有氟代2或杂环侧链3的非天然氨基酸。
加入非天然侧链后，通常通过在盐酸中回流将功能化的非天然氨基酸（UAA）从席夫碱复合物中去除4，随后使用离子交换色谱法进行分离。尽管该方法通常效率较高，但所得到的氨基酸可能不适用于固相肽合成（SPPS）。SPPS 的特性要求侧链保护基团具有酸不稳定性，而典型的镍-席夫碱复合物分解条件酸性过强，导致无法完整保留带有此类保护基团的 UAA。据我们所知，仅有一种替代的分解方法被报道：在升高温度下使用乙二胺四乙酸（EDTA）和肼5，但该条件本身可能不适用于某些侧链保护基团，例如邻苯二甲酰亚胺。
图 1：由 Ni2+、PBP 和甘氨酸（Gly）合成 Ni-PBP-Gly。 请点击此处查看该图的放大版本。
本文报道了一种水解Ni-Schiff碱配合物Ni-PBP-Gly的方法（图1）。该配合物由Ni2+、甘氨酸和吡啶-2-甲酸(2-苯甲酰基苯基)酰胺（PBP）衍生而来6，已被证明是合成多种非天然氨基酸（UAA）的有效平台，并可通过两步合成路线便捷获得7。该配合物的合成在文献中已有报道，产率较高6。下文所述结果表明，在弱酸性至中性pH条件下使用EDTA进行水解，适用于带有酸敏感侧链保护基的UAA。水解完成后，可直接分离所得水溶液，并立即进行标准的Fmoc保护反应，从而得到Fmoc保护的氨基酸（图2）。
图2：从Ni-PBP-Gly中分离的氨基酸的水解及Fmoc保护反应。反应条件：i. EDTA（12当量），pH 4.5；ii. 乙酸乙酯洗涤并调节pH至7；iii. Fmoc-OSu（1当量），NaHCO3（2当量）。请点击此处查看该图的放大版本。
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方案
1. 镍-席夫碱配合物的水解
- 在250 mL圆底烧瓶中，于室温下搅拌，将1 mmol的Ni-PBP-席夫碱配合物溶于40 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中。
- 加入60 mL 0.2 M的水相EDTA溶液，pH调至4.5。
- 使用磁力搅拌子和搅拌台，将混合溶液搅拌过夜。随着席夫碱配合物的水解，溶液颜色将由深红色逐渐变为白色。
- 当反应完成（以无红色残留为标志）后，将反应液转移至250 mL分液漏斗中。
- 加入50 mL二氯甲烷，盖紧分液漏斗并充分混合。将有机相排入废液杯中。重复此步骤三次，以除去PBP及任何残留的Ni-PBP-席夫碱配合物。收集剩余的水相层于250 mL圆底烧瓶中。
2. 水解氨基酸的Fmoc保护
- 使用固体碳酸氢钠将上述步骤 1.5 中分离得到的水相调节至 pH 7。使用 pH 试纸定期检测 pH 值。
- 向溶液中加入 168 mg 碳酸氢钠（2.00 mmol，2 当量），并使用磁力搅拌子和搅拌板进行搅拌。
- 在 10 mL 小瓶中，将 337 mg Fmoc N-羟基琥珀酰亚胺酯（1.00 mmol，1 当量）溶于最小量的二氧六环（约 4 或 5 mL）中。将该溶液转移至水溶液中，并搅拌过夜。
- 待反应液搅拌过夜后，用 1 M 盐酸将反应液酸化至 pH 2。使用 pH 试纸定期检测 pH 值。
- 将反应液转移至 250 mL 分液漏斗中，加入 50 mL 乙酸乙酯。盖紧分液漏斗，充分混合后，将有机相收集至 250 mL 锥形瓶中。重复此操作两次，合并所有有机相。用约 3 g 无水硫酸镁干燥合并后的有机相。
- 使用旋转蒸发仪浓缩合并后的有机相，得到粗制的 Fmoc 保护氨基酸。
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结果
我们假设去除 Ni2+ 从Ni-PBP-Gly复合物中可能实现希夫碱在无需剧烈pH条件下高效水解。由于EDTA是一种廉价且研究充分的螯合剂，10 我们假设，在 Ni-PBP-Gly 溶液中加入 EDTA 将有助于 Ni 的螯合2+ 离子，从而促进该复合物的水解。
为了验证我们提出的理论，即仅使用EDTA即可有效促进该配合物的水解，我们将DMF中的Ni-PBP-Gly溶液在室温下与不断增加当量的EDTA水溶液（pH 4.5）混合，该pH值为EDTA二钠盐水溶液未经调节的天然pH。水解反应的进程可通过观察溶液颜色变化进行监测：未反应的Ni-PBP-Gly溶液呈深红色，而从该配合物中释放出的PBP为白色。我们通过监测溶液颜色由红变白的过程来追踪水解反应的进展（表1）。当EDTA用量少于8当量时，溶液颜色均出现一定程度的由红向白转变，但...
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讨论
上述方案的优势在于能够在温和的pH条件下实现从Ni-席夫碱配合物中分离出氨基酸骨架，并通过两个关键步骤对分离得到的氨基酸进行Fmoc保护。第一步是将含有EDTA的DMF/水溶液搅拌，以促进氨基酸从配合物中释放。残留的配合物或有机副产物可通过萃取轻松去除。该方案的第二步是对第一步萃取分离后存在于水相中的氨基酸进行Fmoc保护。我们已证实该方法可在pH 4.5–7.5范围内进行调整，具有较大的灵活性，这对于某些对pH敏感的侧链保护基可能是必要的。
该技术的一个潜在局限性在于，游离氨基酸的Fmoc保护反应浓度较低。由于要实现高效的水解，需要相对于底物使用数当量的EDTA，因此反应条件要求使用大量水相EDTA溶液（对于1 mmol规模的反应为60 mL）。在Fmoc保护反应中使用如此大体积的溶剂，会导致试剂浓度相对较低（约0.015 M）。尽管在如此稀释的反应条件下，概念验证实验仍以令人满意的55%产率获得了产物，但在使用因空间位阻增大而导致亲核性低于甘氨酸的氨基酸时，可能需要提高该反应浓度。
综上所述，我们证明了EDTA在促进通常用...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
由斯莱普里罗克大学提供资助。我们感谢斯莱普里罗克大学的T. Boron III和宾夕法尼亚大学的C. Haney提出的宝贵见解。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ni-PBP-Gly | 根据已发表的实验方案合成 | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| 二氯甲烷 | Acros | AC610050040 | |
| 碳酸氢钠 | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| 二氧六环 | Fisher | D111-500 | |
| 盐酸 | Fisher | A144-500 | |
| 乙酸乙酯 | Acros | AC610060040 | |
| 硫酸镁 | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO 硅胶 | ZEOChem | ||
| 己烷 | Fisher | 3200250.650.443 | |
| 层析柱 | |||
| pH 试纸 | |||
| 旋转蒸发仪 | |||
| 250 mL 分液漏斗 | |||
| 250 mL 圆底烧瓶 | |||
| 搅拌子 | |||
| 搅拌板 |
参考文献
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重印与许可
