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方法文章

从附睾分离的原代上皮细胞的全细胞膜片钳记录

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DOI：

10.3791/55700

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2017年8月3日

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University, 2Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences, 4Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University

本文内容

摘要

我们介绍一种结合细胞分离与全细胞膜片钳记录的技术方案，用于测定大鼠附睾尾部原代分离的上皮细胞的电生理特性。该方案可用于研究原代附睾上皮细胞的功能特性，从而进一步阐明附睾的生理作用。

摘要

附睾是精子成熟和生殖健康的重要器官。附睾上皮由多种复杂连接的细胞类型组成，这些细胞不仅在分子和形态特征上各不相同，其生理特性也存在差异。这些差异反映了它们各自多样的功能，共同在附睾管腔内为睾丸后精子发育建立必要的微环境。了解附睾上皮细胞的生物物理特性，对于揭示其在生理及病理生理条件下对精子和生殖健康的作用至关重要。尽管这些细胞的功能特性尚未完全阐明，但可通过膜片钳技术对其进行研究，该技术可用于测量单个细胞的细胞事件及膜特性。本文中，我们描述了细胞分离及全细胞膜片钳记录的方法，用于测定大鼠附睾尾部原代分离上皮细胞的电学特性。

引言

男性生殖道中的附睾是一个由镶嵌状上皮细胞层构成的器官。与其他上皮组织类似，附睾上皮中的多种细胞类型（包括主细胞、亮细胞、基底细胞以及免疫系统和淋巴系统的细胞）协同作用，共同发挥管腔前沿屏障功能，并为精子成熟和生理活动提供支持作用1,2,3。因此，这些上皮细胞在生殖健康中发挥着至关重要的作用。

上皮细胞通常被认为是非兴奋性细胞，由于缺乏电压门控的Na+或Ca2+通道，无法对去极化刺激产生“全或无”式的动作电位4,5。然而，上皮细胞表达一组独特的离子通道和转运蛋白，调控其特化的生理功能，例如分泌和营养物质的转运6。因此，不同类型的上皮细胞具有特征性的电生理特性。例如，主细胞表达CFTR以介导液体和氯离子的转运，并表达TRPV6以参与钙的重吸收，而亮细胞则表达质子泵V-ATPase以实现管腔酸化1,7,8,9。已有研究报道了一些调控附睾上皮细胞生理特性的转运蛋白和离子通道，但附睾上皮细胞的功能特性在很大程度上仍不清楚10,11,12,13。

全细胞膜片钳记录是一种成熟的技术，用于研究可兴奋细胞和非兴奋细胞的内在特性，尤其有助于分析异质性细胞样本中主要分离细胞的功能；电压钳技术用于测量单个细胞的被动膜特性和离子电流14,15。被动膜特性包括输入电阻和电容。前者反映膜的内在电导，后者则反映细胞膜的表面积（即作为分隔细胞外和细胞内环境的薄绝缘层的磷脂双分子层，离子通道和转运蛋白位于其上）。膜电容与细胞膜的表面积成正比。结合由输入电阻反映的膜电阻，可确定膜时间常数，该参数表示细胞膜电位对离子通道电流流动的响应速度。因此，通过整合施加于细胞的一系列电压阶跃所引发的电流响应特征，即可确定细胞的生物物理动力学特性和其他性质15,16,17,18。

本文中，我们描述了从大鼠附睾尾部分离上皮细胞的操作步骤，以及利用全细胞膜片钳技术测定离散细胞混合物中不同类型细胞膜特性的方法。我们证明，附睾主细胞具有独特的膜电生理特性，且其电导可轻易与其他细胞类型相区分。

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方案

所有动物实验均按照上海科技大学动物实验伦理委员会的指南进行，该委员会的规范符合当地及国际要求。

1. 实验动物

  1. 使用8至12周龄的成年雄性Sprague-Dawley大鼠（约300-450 g）。在此年龄段，精子已到达附睾尾。

2. 从大鼠尾部附睾中分离上皮细胞

注意：除非另有说明，以下步骤均在非无菌条件下进行。

  1. 解剖器械与试剂的准备
    1. 将解剖工具浸入70%乙醇中进行消毒，并使其自然晾干。
    2. 开启恒温水浴（32 °C）；在洁净空气流控制的工作站中，准备并预热500 mL含1%（v/v）抗生素（终浓度为100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）的1×Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI），标记为“RPMI (+P/S 1:100)”。
    3. 准备并预热500 mL含非必需氨基酸（0.1 mM）和丙酮酸钠（1 mM）的1×Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM），并添加5-α-二氢睾酮（1 nM）、10%胎牛血清和1%（v/v）抗生素（终浓度为100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素），标记为“Full-IMDM”。分装成50 mL等份，用封口膜密封，在4 °C保存。操作过程需保持无菌条件。
    4. 通过将I型胶原酶和II型胶原酶溶解于RPMI (+P/S 1:100)中，配制胶原酶消化液，使每种胶原酶终浓度为1 mg/mL。经0.22 µm滤膜过滤后标记为“胶原酶溶液”。室温（RT）保存备用。根据酶的质量调整酶液体积；单只大鼠双侧附睾尾所需的最小酶液体积为2 mL。
    5. 在35 mm培养皿中加入RPMI (+P/S 1:100)。
  2. 大鼠附睾尾的解剖
    1. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（85 mg/kg）或使用异氟烷麻醉舱使动物失去意识，直至尾部夹捏刺激无反应，随后实施颈椎脱位处死。
    2. 用70%乙醇擦拭下腹部进行消毒，轻柔地将两侧睾丸推至下腹部，并在阴囊附近切开下腹部。
    3. 夹取附睾脂肪组织，完整分离出整个生殖器官（睾丸、附睾和输精管），并将其浸入盛有RPMI (+P/S 1:100)的培养皿中。
    4. 将含有RPMI (+P/S 1:100)的生殖器官转移至无菌操作台。
    5. 从结缔组织、脂肪组织及附睾囊中分离出附睾尾。将一侧附睾放入含约0.2 mL胶原酶溶液的1.5 mL离心管中。此步骤应在洁净空气流控制的工作站中进行。
  3. 从大鼠附睾尾中解离单个细胞
    1. 用精细剪刀在胶原酶溶液中剪碎附睾组织，直至形成糊状液体。用剩余的（约0.8 mL）酶液轻轻冲洗剪刀。
    2. 将离心管置于金属恒温混匀仪中，在37 °C下以1,000 rpm振荡30分钟。
    3. 在室温下以30 × g离心3分钟，弃去含有大量精子的黏稠上清液。
    4. 用1 mL Full-IMDM重悬沉淀，以终止所有酶活性。将细胞悬液转移至含有49 mL RPMI (+P/S 1:100)的50 mL离心管中。
      注：可选步骤，可通过100 µm孔径滤膜反复吹打过滤细胞悬液，以避免形成较大的细胞团块。但如果需要将细胞悬液用于单层细胞培养，则不应使用滤膜过滤。
    5. 在室温下以30 × g离心10分钟，弃去上清液。
    6. 用1 mL Full-IMDM轻柔吹打重悬沉淀，持续至少5分钟，以从经酶处理的附睾组织混合物中充分解离出单个细胞。
  4. 在无菌条件下分离上皮细胞与其他细胞
    1. 将细胞悬液接种于含Full-IMDM的10 cm培养皿中，在32 °C、5% CO2的培养箱中培养至少8小时或过夜。
    2. 提前将盖玻片浸入100%乙醇中进行灭菌，空气干燥后蘸取少量培养基，放入6 cm培养皿或24孔板的单个孔中。
    3. 次日早晨，轻柔收集培养皿中的细胞悬液（主要含上皮细胞），即获得解离的上皮细胞。在室温下以30 × g离心5分钟，弃去上清液。
    4. 用约2 mL Full-IMDM重悬细胞沉淀。
    5. 将0.2 mL收获的细胞悬液接种至每张无菌盖玻片的中央。
    6. 让细胞悬液在液滴中静置至少10分钟，使细胞松散地贴附于玻璃盖玻片。小心地在10 cm培养皿边缘加入1 mL Full-IMDM，或向24孔板每孔加入0.3 mL Full-IMDM，避免扰动细胞。
    7. 将附着于盖玻片上的分离单细胞置于32 °C、5% CO2的培养箱中，直至进行膜片钳实验。

3. 记录液与微电极

注意：进行膜片钳实验时，请使用最高纯度的化学试剂和溶液。

  1. 储备溶液的配制
    1. 对所有用于储存母液的瓶子进行高压灭菌，并对所有母液（除腐蚀性溶液外）使用0.22 μm滤膜过滤。µm 使用前将膜处理。
    2. 提前在室温下配制所有储备液，并于4℃保存 oC：5 M NaCl；1 M KCl；100 mM MgCl₂2；100 mM CaCl2；200 mM NaH2PO4；100 mM EGTA（用KOH调至pH 7.0）。5 M NaOH、1 M HCl 和 1 M KOH 储存液应作为腐蚀性溶液处理。
  2. 标准外部记录用生理盐溶液（PSS）的配制
    1. 在进行膜片钳记录当天早晨，将储备液升温至室温。
    2. 根据所需的终体积，用移液器从每种储备液中吸取相应成分，CaCl₂ 除外2, 例如 配制500 mL PSS溶液：140 mM NaCl = 5 M溶液14 mL；5 mM KCl = 1 M溶液2.5 mL；1.2 mM MgCl₂ = 1 M溶液0.6 mL2 = 6 mL 的 100 mM；1.2 mM NaH2PO4 = 3 mL 的 200 mM。
    3. 加入双蒸水（ddH₂O）2O) 定容至 400 mL 并平衡。
    4. 称取0.9 g葡萄糖和1.19 g HEPES，加入溶液混合物中并完全溶解。
    5. 加入 CaCl2 储备液（2.5 mM = 12.5 mL 的 100 mM 溶液），边搅拌。
    6. 加水至终体积的99%。
    7. 使用 NaOH 或 HCl 将 pH 值调节至 7.4。
    8. 检测渗透压，必要时使用 5 M NaCl 或葡萄糖进行调节。
    9. 加入ddH₂O2O 至圆柱形容器中的最终体积为 500 mL。
  3. 低EGTA钾溶液的制备（微移液管内液）+ 基于溶液的方法）
    1. 根据所需的最终体积和浓度，称量或用移液器吸取每种储备液的相应体积， 例如 用于配制 50 mL 低 EGTA K 溶液+基于细胞内液配制至约 30 mL ddH₂O2O: 100 mM K-葡萄糖酸盐 = 1.17 g；35 mM KCl = 1 M 溶液 1.75 mL；2 mM MgCl₂2 = 1 mL 的 100 mM；0.1 mM EGTA = 0.05 mL 的 100 mM；10 mM HEPES = 0.072 g。
    2. 加入足够的水至终体积的约95%，并在室温下使溶液平衡。确保溶液澄清。
    3. 在持续搅拌溶液的同时，使用 KOH 将 pH 值调节至 7.2。
    4. 称取0.078 g Mg-ATP并加入溶液中，直至完全溶解。
    5. 将溶液置于冰上，并取少量用于渗透压测定；通常溶液的渗透压约为290 mOsmol，无需调整。如果渗透压显著偏离280–295 mOsmol范围，则需重新配制溶液。
    6. 加入ddH₂O2O 至终体积。
    7. 将溶液分成 500 µL 分装，用滤器过滤 0.2 µm 注射器滤器，严密密封后立即于 ≤ -20 °C.
    8. 在进行膜片钳实验当天，将一份细胞内液在冰上解冻，并在实验过程中保持低温，以防止降解。
  4. 使用玻璃毛细管（按照移液管拉制仪的用户手册操作）拉制膜片钳移液管，使其充满细胞内液后电阻为5-10 MΩ。

4. 建立膜片钳实验并实现细胞全细胞记录构型

  1. 建立膜片钳实验
    1. 打开膜片钳设备（计算机、计算机控制的放大器、数字转换器） 等等。)
    2. 打开膜片钳软件（例如 使用 AXON pCLAMP10 或 HEKA PatchMaster 软件设置电生理记录的实验方案。将信号滤波器设置为低通滤波，截止频率为 1–3 kHz，采样频率设置为 10–20 kHz。
    3. 打开相机、显微操作仪和光源。
    4. 当计算机控制的放大器开启时，操作者在接触探头前，应先用手触碰已接地的膜片钳装置机身，使自身接地，以防止电击损坏设备。
    5. 将培养在玻璃盖玻片上的上皮细胞转移至含有约1 mL标准PSS溶液的记录室中，室温下放置。在进行任何膜片钳实验前，使用移液器小心更换灌流液PSS至少两次。
      注意：可根据计划的实验选择用标准PSS或其他外部溶液填充灌流系统。在开始膜片钳实验前，以约2 mL/min的速度用PSS对显微镜载物台上的记录室（RC-26G或RC-26GLP）灌流数次。确保灌流系统中无残留气泡。
    6. 在倒置显微镜下使用配备微分干涉差（DIC）光学系统的10倍和40倍物镜观察并选择细胞。寻找用于记录的大型单个孤立细胞。通过细胞呈球形、膜的一端具有粗糙的微绒毛以及胞内物质呈极性分布的特征，鉴定孤立的附睾上皮细胞。图1).
    7. 使用1 mL注射器（自制非金属微量注射针头），将内部溶液（低EGTA K+基于溶液的操作，请参见步骤 3.3。确保微量移液管中无气泡，因为气泡会增加微量移液管的电阻。加入足量溶液，使微量移液管 holder 内的氯化银涂层银丝电极完全浸没在内液中。
    8. 将微量移液管安装到电极夹持器中，并施加较低的正压（约0.2 mL注射器体积）。在后续步骤中接触细胞膜之前，持续保持该低正压。
  2. 建立全细胞记录配置以进行细胞记录
    1. 将移液管浸入灌流液中，使用显微操作器的最高速度。在连接数码相机的屏幕上找到移液管尖端后，将显微操作器速度调至中高速模式。
    2. 快速使用数据采集接口命令检查微移液管电阻（5-10 MΩ）例如 在AXON系统中通过施加电压阶跃进行“膜测试”（Membrane Test）例如 5 mV，持续100 ms）由计算机控制的放大器生成。如果电阻显著超出此范围，则更换新的微电极。
    3. 开始降低显微镜上安装的物镜；逐渐将微移液管导向选定的细胞。始终先降低物镜，再将微移液管降至焦平面，直至微移液管位于选定细胞中心表面的上方。
    4. 使用软件指挥界面中的“pipette offset”命令，将移液管溶液与浴液之间的液接电位校正为零。
    5. 将计算机控制的放大器控制器设置为电压钳模式，膜测试设置为“浴液”模式。
    6. 精细调焦以获得更清晰的细胞图像，然后使用显微操作器以低至中等速度逐渐降低微移液管。
    7. 当微移液管接近细胞时（通过膜测试命令触发时电流减小来判断），立即撤除微弱正压，并施加轻微负压（0.1 mL注射器体积），以形成吉欧封接（gigaseal）>1 GΩ
    8. 使用膜片钳测试监测电阻。如果电阻为 >500 MΩ 但 <1 GΩ，施加负电位（通常作为钳制电位设定为-60 mV），有助于形成吉欧封接。补偿微电极的瞬时电容电流。
    9. 如果密封是 >1 GΩ 并稳定（如软件界面所示）后，施加短暂而强烈的负压以破裂细胞膜。不要对串联电阻和细胞电容进行补偿。
    10. 在获得成功的全细胞记录构型后，立即从 -60 mV 的钳制电位施加一个 10 mV 的超极化脉冲（5 次扫描，最小时间间隔，持续时间 20 ms，采样频率 20 kHz）。
    11. 将电压模式切换至零电流模式，记录软件界面上的读数，或进行无间隙记录（10–60 秒），以获取细胞膜电位的读数。
    12. 迅速切换回电压模式并保持在此模式，根据预设的实验方案施加电压程序，并记录电流反应。在记录过程中，未对固有的漏电流进行减除处理。
    13. 在记录过程中监测反应的稳定性或细胞的不同参数。例如，使用“Membrane Test”命令界面检查输入电阻（Ri），串联电阻（Rs）以及细胞膜电容（Cm在更换实验方案期间，于“Cell”模式下的膜片钳测试中。
      注意：输入电阻的突然下降通常提示封接松动，而串联电阻的显著升高可能提示微电极尖端被细胞内细胞器或膜碎片堵塞。记录过程中应定期监测微电极位置，检查是否发生漂移，以免导致封接丢失。若出现漂移问题，可小心将微电极与封接细胞一同从记录 chamber 底部提起。此操作有时可能导致封接丢失，此时需重复全细胞膜片钳操作步骤。

5. 细胞被动电生理特性的分析

  1. 完成膜片钳实验并获取数据后，在Clampfit软件中打开无间隙记录数据，测量每个细胞静息膜电位的平均值。或者，可采用电流模式下记录的零电流电压值。使用液结电位值对该数据进行校正（本研究中为12.4 mV）。
  2. 打开来自单个细胞的10 mV超极化阶跃（ΔV）数据，测量阶跃前与阶跃期间的电流差值（ΔIstep），并利用以下公式计算输入电阻（Ri）：
    欧姆定律公式 R=ΔV/ΔI，用于说明电学中电阻的计算。
  3. 计算细胞电容（Cm，单位为pF）：使用同一10 mV超极化阶跃的电流数据，对电压阶跃触发后膜电容电流初始瞬态衰减期间的曲线下总面积进行积分，以获得细胞的总累积电荷量（Q，单位为pA•ms）。使用以下公式：
    电容公式 \( C_m = \frac{Q}{\Delta V} \)；公式；静电学概念。
  4. 通过将10 mV负向阶跃产生的初始瞬态电流用标准指数算法拟合，获得电流衰减的时间常数（T，单位为ms），并利用以下公式计算每个细胞的串联电阻（Rs）：
    静态平衡公式 Rs=τ/Cm，用于科学分析的公式，物理学概念。

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结果

所述从大鼠附睾尾分离上皮细胞的酶消化方法，是在我们先前研究基础上改进的方案9,12。该方法获得的单细胞混合物活力超过90%，且无表面泡状结构或细胞肿胀现象。这种异质性细胞混合物主要包含主细胞、亮细胞和基底细胞，如我们此前所述1。在本方案中，通过将原代解离的细胞在培养皿中过夜培养，使非上皮细胞（如成纤维细胞和平滑肌细胞）贴壁，从而获得相对纯净的附睾上皮细胞样本，如图1A（收获前）所示。随后可在显微镜下根据细胞表型初步区分细胞类型，并依据其特有的被动膜特性进行分类。在解离后的细胞混合物中，有一类细胞在其表面膜的一端具有微绒毛或粗糙膜结构，并呈现细胞内容物的极性分布；这类细胞被称为主细胞或类亮细胞（图1B，箭头所示）。这些极性上皮细胞在形态学特征上难以区分，但可通过全细胞膜片钳记录所获得的被动膜特...

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讨论

在本实验方案中，通过酶解法分离大鼠附睾尾 consistently 获得健康的上皮细胞。附睾上皮细胞在膜片钳实验中的质量依赖于该方案中的几个关键步骤。例如，将细胞混合物以较低离心力（30 × g）进行离心，对于去除精子和附睾管腔内容物至关重要；若细胞培养体系中存在精子，附睾上皮细胞的健康状态会受到影响。此外，将解离后的细胞混合物在培养皿中孵育数小时是去除成纤维细胞和平滑肌细胞的重要步骤；非上皮细胞在培养皿表面贴附速度较快，从而使得上皮细胞保留在悬浮液中，可通过轻柔抽吸重新收集。同时，胶原酶消化以及使用细口玻璃移液器进行吹打，是细胞解离过程中获得单个细胞的两个关键步骤。最后，附睾细胞的酶消化程度对膜片钳实验极为关键，因为酶活性不足导致消化不充分，或孵育时间过长导致消化过度，均会破坏移液器与细胞膜之间吉欧姆密封（giga-ohm seal）的形成。

在细胞混合物中，体积较大、呈柱状、细胞膜表面粗糙且一端带有静纤毛、胞内物质呈极性分布的细胞，很可能是主细胞或亮细胞。其他缺乏明显微绒毛和极性分布胞内物质的细胞，可能包括基底细胞以及部分免疫系统来源的细胞。本实验方案除了描述附睾上皮细胞的基本...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Christopher Antos博士对本文提出的宝贵意见。本工作获得了上海科技大学授予Shum Winnie的启动资金以及国家自然科学基金（编号：31471370）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AXON 系统仪器
计算机控制放大器Molecular Devices - AxonMulticlamp 700B 膜片钳放大器
数字采集系统Molecular Devices - AxonDigidata 1550 转换器
显微镜OlympusBX-61WI
显微操作器Sutter InstrumentsMPC-325
记录室及在线加热器Warner InstrumentsTC-324C
HEKA 系统仪器
膜片钳放大器Harvard Bioscience - HEKAEPC-10 USB 双通道
显微镜OlympusIX73
显微操作器Sutter InstrumentsMPC-325
记录室及在线加热器Warner InstrumentsTC-324C
其他仪器
微电极拉制仪Sutter Instrument P-1000
记录室Warner InstrumentsRC-26G 或自制记录室
含丝硼硅酸盐毛细管玻璃Sutter Instrument / Harvard ApparatusBF150-86-10
防振台TMC 63544
数字相机HAMAMATSUORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
用于细胞分离的试剂
RPMI 1640 培养基Gibco22400089
青霉素/链霉素Gibco15140112
IMDMATCC 30-2005 
IMDMGibcoC12440500BT
胶原酶 ISigmaC0130
胶原酶 IISigmaC6885
5-α-二氢睾酮MedchemexpressHY-A0120
胎牛血清capricornFBS-12A
微电极内液（K⁺ 基溶液）（pH 7.2，280–295 mOsm）
KCl，35 mMSigma/各种V900068
MgCl2 · 6H2O，2 mMSigma/各种M2393
EGTA，0.1 mMSigma/各种E4378
HEPES，10 mMSigma/各种V900477
K-葡萄糖酸盐，100 mMSigma/各种P-1847
Mg-ATP，3 mMSigma/各种A9187
标准细胞外记录生理盐溶液（PSS）（pH 7.4，300–310 mOsm）
NaCl，140 mMSigma/各种V900058
KCl，4.7 mMSigma/各种V900068
CaCl2，2.5 mMSigma/各种V900266
MgCl2 · 6H2O，1.2 mMSigma/各种M2393
NaH2PO4，1.2 mMSigma/各种V900060
HEPES，10 mMSigma/各种V900477
葡萄糖，10 mMSigma/各种V900392
用于 pH 调节
NaOHSigma/各种V900797纯度 >=97%
KOHSigma/各种60371纯度 >=99.99%

参考文献

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