微孔阵列平台中微生物群落发展的组装与跟踪

Summary

微生物群落的发展取决于环境结构，成员丰度，特征和相互作用等因素的结合。该协议描述了一种合成的微制造环境，用于同时跟踪包含在femtoliter井中的数千个社区，其中可以近似关键因素，如利基尺寸和约束。

Abstract

微生物群落的发展取决于复杂的确定性和随机因素的组合，可以显着改变社区成员的空间分布和活动。我们开发了一个微孔阵列平台，可用于并行快速组装和跟踪数千个细菌群落。该协议强调了该平台的实用性，并描述了其用于光学监控平台内阵列集合内简单的两人社区的发展。该示范使用铜绿假单胞菌的两个突变体，一系列突变体的一部分用于研究VI型分泌致病性。 mCherry或GFP基因的染色体插入片促进具有不同发射波长的荧光蛋白的组成型表达，可用于监测每个微孔内的群落成员丰度和位置。该协议描述了详细的方法d用于将细菌混合物组装到阵列的孔中，并使用延时荧光成像和定量图像分析来测量每个成员群体随时间的相对增长。微孔平台的种植和组装，阵列内微生物群落定量分析所需的成像过程以及可用于揭示微生物物种区域之间相互作用的方法。

Introduction

微生物群落由细胞死亡，分裂，蛋白质浓度，细胞器数目和突变^1相关的环境结构和随机过程两个决定因素构成。在自然环境中，几乎不可能分析这些影响对社区组成和活动的个人影响。被自然结构遮蔽，埋在化学和生物环境中，识别社区成员并进一步解决其在自然环境中的时空分布是极具挑战性的。尽管如此，最近的努力已经强调了空间组织对社区功能的重要性，并指出在正在进行的研究2,3,4中需要考虑成员丰富和组织。

它很清楚，当地的化学环境（ 即营养物质和次生代谢物的可获得性），物理结构（ 如土壤结构，植物根系，海洋颗粒或肠道微绒毛），氧气的存在或不存在以及引入致病物种都影响微生物群落5,6,7,8,9,10,11的组成，结构和功能。然而，忽视捕捉这些因素的传统文化技术依然存在。社区组成（ 例如，共同依赖物种的存在），物理附着，信号分子浓度和直接的细胞 - 细胞接触都是形成微生物群落的重要因素，并且可能在c传统文化条件。这些性质难以在大量液体培养物或琼脂平板上复制。然而，允许复制自然环境的关键物理和化学特征的微流体，微图形化和纳米制造技术的可用性使得许多研究人员能够建立细菌群落来研究它们的相互作用^{12,13,14 ，}并开发合成环境模拟自然条件4，15，16，17，18，19，20。

该协....

Protocol

硅微孔阵列制造

1. 聚对二甲苯涂层
   1. 根据制造商的规格和说明书（设置:蒸发器设定点= 160℃;炉设定点= 650℃），使用市售的聚对二甲苯涂层系统在硅晶片上沉积1-1.5μm的聚对二甲苯N.
      注意:装入室内的聚对二甲苯约6克产生1-1.5微米厚的涂层。
2. 光刻
   1. 以3,000rpm转速涂覆具有粘合促进剂，20％六甲基二硅氮烷（HMDS）和80％丙二醇单甲醚乙酸酯（PGMEA）（ 参见表材料 ）的聚对二甲苯N-包覆的晶片45秒。用粘合促进剂填充2 mL转移移液管，并将其洒在整个晶片上。让晶片静置约10秒，然后将其干燥。
   2. 填充2毫升转移移液器与正（参见"材料表" ），并将光致抗蚀剂分配在晶片的中心。以3,000rpm旋转45秒以产生约1.5μm厚的抗蚀剂涂层。
   3. 将样品在115℃的电热板上软烘烤1分钟。
   4. 使用具有所需孔图案的接触对准器和光掩模将样品暴露于紫外线。通过图案化的光掩模将旋涂的晶片暴露6秒，给出在365nm处测量的约60-80mJ / cm ²的近似剂量。
   5. 通过将样品浸在显影剂（<3％四甲基氢氧化铵在水中;参见材料表 ）2分钟来显影图案 。用去....

Results

这里提出的实验平台是为细菌群落的高通量和高含量研究而设计的。该设计使得能够同时分析成千上万个种植在各种尺寸的井中的社区。通过这种微孔阵列设计，可以确定最终社区组成对初始播种密度，孔尺寸和化学环境的依赖性。这项工作展示了微型阵列中两个成员社区的发展，并提出了分析社区组成和组织的方法。

这里使用的模型系统是在Mougous实验室设计的，以研究铜绿假单胞菌中的 VI型分泌物 。该系统由几种含有GFP或mCherry荧光报告基因的突变菌株组成。在这项工作中使用2种不同的菌株。第一个是GFP标记的ΔretS突变体y表达与VI型分泌相关的毒性效应蛋白，导致敏感细胞中细胞死亡的水平更高。第二个是RFP标记的ΔretSΔtse/ i1-6菌株，其是缺失所有六种已知效应子蛋白的缺失突变体，并且已经显示更易于VI型发病机制^22,23,24 。每个物种的增长轨迹单独跟踪两个成员社区（

Discussion

本文介绍了微孔阵列设备和实验方案，旨在实现基于细胞群发展的高通量和高含量的基于活细胞成像的分析。虽然这里的示范重点是研究接触介导的VI型分泌对社区发育的影响，但阵列被设计为灵活的，适应于广泛的微生物群落和微生物 - 微生物相互作用的研究。这里的工作仅在于使用组成性表达荧光标记物的细菌，以便容易地跟踪成员丰度和位置。然而，通过改变化学环境，通过生长或扰动后来自各个井的生物材料的机会，可以用于确定社区组成和基因表达。

每个硅器件由数十个包含具有各种孔的微孔的阵列组成直径，以2x，3x或4x直径间距组织，并蚀刻到3和3.5μm之间的深度。由于营养物质和次生代谢产物可以自由扩散通过琼脂糖盖，包括不同的沥青子阵列，以便检查微孔或局部营养物质消耗之间的信号传导如何影响社区发展。在这个示范中，增长和社区发展似乎并没有受到阵列内微孔间距或位置的影响。选择浅层深度以简化图像分析，将所有微生物生长和发育限制在单个图像平面上。然而，以前已经使用更深的阱（20μm深），并且可以通过改变硅蚀刻工艺的持续时间来容易地深度地调制。井的长宽比的增加基本上改变了孔内部细胞经历的限制程度，有效地改变了井的总体积到营养.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
聚对二甲苯 N	特种涂层系统	CAS NO.：1633-22-3
聚对二甲苯涂层机	涂层系统	Labcoter 2 聚对二甲苯沉积装置 PDS2010
硅片	WRS 材料	直径 100mm，500-550μm 厚度，Prime，10-20 电阻率，N/Phos<100>，
附着力促进剂	Shin-Etsu Microsci	MicroPrime P20 附着力促进剂
正性光刻胶	Rohm and Haas Electronics Materials LLC （由陶氏拥有）	Microposit S1818 正性光刻胶 （代码 10018357）
Quintel 接触对准器	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 掩模对准器
反应离子蚀刻工具	牛津仪器	Plasmalab 系统 100 反应离子刻蚀仪
R2A 肉汤	TEKnova	R0005
牛血清白蛋白	Sigma	A9647
多功能读板机	Perkin Elmer	Enspire，2300-0000
荧光显微镜	Nikon	Eclipse Ti-U
自动载物台	Prior	ProScan III
CCD 相机	尼康	DS-QiMc
载物台顶部环境控制室	体内	STEV ECU-hoc
磷酸盐缓冲盐水	ThermoFisher Scientific	14190144
Ultra纯琼脂糖	ThermoFisher Scientific	16500500
25 x 75 mm No. 1.5 盖玻片	Nexterion	高性能#1.5H 盖玻片
荧光参考载玻片	Ted Pella	2273
物理测针轮廓仪	KLA Tencor	P-6
实验室擦拭布	Kimberly Clark	Kimipe KIMTECH SCIENCE 品牌，34155
商业软件	尼康	NIS Elements
蔡司 710 共聚焦显微镜	蔡司
滤光片立方体	Nikon	Nikon FITC （96311）， Nikon Texas Red （96313）