检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物悬浮细胞培养使用邻近连接测定

Summary

在这里，证明了原位邻近连接测定（PLA）如何可以用于检测和可视化暴露于基因毒性应激的悬浮细胞培养物中ATM和p53之间的直接蛋白质 - 蛋白质相互作用。

Abstract

DNA损伤反应协调自发发生的DNA损伤的修复，由遗传毒性应激引起，或出现在淋巴细胞中程序性DNA断裂的上下文中。共济失调 - Telangiectasia突变激酶（ATM），ATM-和Rad3相关激酶（ATR）和DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PKcs）的催化亚基是首先在DNA损伤诱导时被激活，并且是控制DNA修复，凋亡和细胞存活的网络的中央调节剂。作为肿瘤抑制途径的一部分，ATM和ATR通过磷酸化激活p53，从而调节p53的转录活性。 DNA损伤也导致所谓的电离辐射诱导灶（IRIF）的形成，其代表DNA损伤传感器和在DNA损伤部位积聚的修复蛋白质的复合物，其通过荧光显微镜显现。然而，蛋白质在IRIF中的共定位并不一定意味着d直接的蛋白质 - 蛋白质相互作用，因为荧光显微镜的分辨率是有限的。

原位接近连接测定（PLA）是一种新颖的技术，可以以前所未有的特异性和灵敏度直接显示细胞和组织中的蛋白质 - 蛋白质相互作用。该技术基于与感兴趣的蛋白质结合的特异性抗体的空间接近。当询问的蛋白质在〜40nm内时，扩增反应由与抗体缀合的寡核苷酸引发，扩增产物通过荧光标记显现，产生对应于相互作用蛋白质的亚细胞位置的信号。使用ATM和p53之间建立的功能相互作用作为示例，在此证明PLA如何可用于悬浮细胞培养物中以研究作为DNA损伤反应的组成部分的蛋白质之间的直接相互作用。

Introduction

DNA损伤触发高度受限制的一系列事件，涉及蛋白质 - 蛋白质相互作用和翻译后修饰，可确保DNA的有效快速修复，从而保护基因组完整性¹ 。通常，通过（共聚焦）荧光显微镜监测所谓的电离辐射诱导病灶（IRIF）的形成，研究暴露于电离辐射的细胞中的DNA修复。许多DNA修复和DNA损伤感应蛋白形成IRIF，其代表在染色质位点成核的蛋白质复合物，其维持DNA损伤^2,3 。随着时间的推移，IRIF的位置和分辨率为DNA修复的时空组织提供了重要的见解，并且可能表明不同DNA修复途径的参与。损伤的DNA损伤和细胞周期阶段的性质决定了哪个DNA修复途径被激活。佛 r实例，在积极参与DNA复制（S期）的细胞中，同源重组（HR）是显性DNA修复途径，而在细胞周期的G1-或G2 / M期细胞中，同源末端连接（NHEJ）修复途径占优势。 DNA损伤后的最早事件之一是激活DNA损伤感应激酶共济失调血管扩张 - 突变蛋白（ATM），其主要在细胞周期的G1-和G2 / M期活跃并调节NHEJ，和共济失调血管扩张症和Rad3相关蛋白（ATR），其通过激活HR作用于S期。 ATM和ATR都是非常多效的激酶，磷酸化参与DNA修复，细胞死亡和存活的许多蛋白质⁴ 。已经显示两种激酶在暴露于基因毒性应激后磷酸化并激活肿瘤抑制蛋白p53，表明这些激酶是关键肿瘤抑制信号轴的上游介质"xref">

Protocol

1.细胞治疗和DNA损伤诱导

1. 在补充有20％FCS，50μMβ-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，100U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素的IMDM中培养人BCR-ABL + B细胞急性成淋巴细胞细胞系BV173或SUP-B15在5％CO ₂的气氛中37℃。在6孔板中以5mL /孔计数细胞并以2×10 ⁶细胞/ mL平板。
   注意:任选地，可以使用各种来源的悬浮细胞系。
2. 为了阻止细胞周期G1期的BCR-ABL + B-ALL细胞，加入5μM的伊马替尼甲磺酸盐（STI571），并孵育过夜。
   1. 任选地，当研究整个细胞周期或BCR-ABL阴性细胞类型中的蛋白质 - 蛋白质相互作用时，省略此步骤。
3. 通过向培养物中加入50ng / mL新卡那霉素（NCS）诱导DNA损伤，并孵育2小时。
   1. 或者，通过使用放射源[ ¹³⁷ Cs]以0.5Gy / min以5Gy的剂量照射细胞来诱导DNA损伤。照射后，让细胞在37℃，5％CO ₂气氛中恢复2小时。
4. 任选地，为了评估ATM激酶活性对DNA损伤的反应，在加入NCS或照射治疗之前加入5μM的ATM激酶抑制剂KU55933。
5. 通过在烧杯或锥形烧瓶中的50mL 1x PBS....

Results

残留Ser15上p53的磷酸化显示依赖于ATM激酶活性¹⁶ 。为了证明和证实PLA技术对悬浮细胞培养物细胞分裂素制剂的特异性，表明通过在细胞周期G1期停滞的BCR-ABL + B-ALL细胞2小时NCS处理诱导DNA损伤导致ATM和磷酸化Ser15-p53之间的特异性相互作用，如预期的那样。在用NCS处理的大多数细胞的细胞核中观察到点状PLA信号（ 图1B ），每个细胞平均具有7个PLA信号¹⁵ ，而在未用NCS处理的细胞中未检测到这些信号（ 图1A ） 。在诱导DNA损伤前用特异性ATM激酶抑制剂KU55933预处理细胞明显减少了PLA信号的平均数2 PLA信号/单元（ 图1C ）。正如预期的那样，在细胞核中唯一检测出ATM-phospho-Ser15-p53 PLA信号。省略了山羊抗ATM或兔抗磷.......

Discussion

在本报告中，证明PLA可用于确定和可视化悬浮细胞培养物中蛋白质之间的特异性相互作用。值得注意的是，这里描述的方案不限于DNA修复复合物的研究，而且还适用于可视化和定量悬浮细胞培养物中的其他蛋白质 - 蛋白质相互作用。显示当暴露于DNA损伤诱导剂时，ATM激酶与G1-阻滞的BCR-ABL + B-ALL细胞中的磷酸化p53相互作用。以前，我们使用PLA技术来表明ATM和FOXO1转录因子在BCR-ABL + B-ALL细胞中相互作用，然而，这种相互作用最有可能不会导致FOXO1的ATM依赖性磷酸化。支持PLA数据，通过内源性ATM / ATR-磷酸化蛋白质的免疫沉淀证实，与已建立的ATM底物p53和NBS1相反，FOXO1在诱导D时不被ATM磷酸化NA伤害¹⁵ 。此外，PLA方法成功应用于研究各种人B细胞淋巴瘤细胞系中错配修复复合物（ 例如 MSH2和MSH6之间的相互作用）相互作用的形成（数据未显示）。在这些特殊情况下，解放军技术提供了一种替代方法来支持我们的发现。已经证明，PLA允许对实验条件之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用的半定量评估，并且提供对这些.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV173 细胞系	DSMZ	AC-20	BCR-ABL+ B-ALL 细胞系
SUP-B15 细胞系	DSMZ	ACC-389	BCR-ABL+ B-ALL 细胞系
Iscove 改良的 Dulbecco 培养基 （IMDM）	Gibco （Life Technologies）	21980-032
胎牛血清	Sigma Aldrich	F7524	批次 #：064M3396
L-谷氨酰胺	Gibco（Life技术）	25030-024
青霉素/链霉素	Gibco （Life Technologies）	15140-122
甲磺酸伊马替尼	LC 实验室	I-5508	溶于 DMSO，制备 10 mM 新
卡他汀	Sigma Aldrich	N9162	致突变/致畸，小心处理
KU55933	Selleckchem	S1092	溶于 DMSO 中，制备 5 mM 储备溶液
Starfrost 显微镜载玻片	Waldemar Knittel	VA11200 003FKB
PAP 笔液体阻滞剂	Sigma Aldrich	Z377821-1EA
Cytospin 漏斗	Q 路径 Labonord SAS	003411324
Duolink 原位红色入门套件 山羊/兔	Sigma Aldrich	DUO92105	适用于不同的物种/组合，也可用于 FarRED、橙色和绿色
山羊抗 ATM	Bethyl Laboratories	A300-136A	PLA 级;我们在研究中成功使用了批次 #A300-136A-1
子抗磷酸化 Ser15-p53	细胞信号传输技术	9284	我们在研究中成功使用了批次 #9284-4
与 DAPI Vector Labs 的 Vectashield 抗褪色封片剂		H-1200
Vectashield 抗褪色封片剂	Vector Labs	H-1000
4% 多聚甲醛的 PBS	溶液 Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	也可从其他各种供应商处获得