本实验方案旨在演示新生小鼠耳蜗组织块的制备、培养、处理及免疫染色。该技术可作为 体外 听力研究中的筛查工具
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本文内容
摘要
摘要
尽管在过去几十年中听觉研究取得了显著进展，但感音神经性听力损失（SNHL）至今仍无治愈方法。该疾病通常涉及内耳精细的机械感受结构的损伤或丧失。复杂的 体外 和 离体 近年来，各种检测方法不断涌现，能够在最大限度减少资源消耗的同时，筛选出越来越多具有潜在治疗作用的化合物，从而加快针对感音神经性听力损失（SNHL）的治疗方法的开发进程。尽管特定细胞类型的均质培养在当前研究中仍发挥着重要作用，但许多科学家现已转向依赖更为复杂的鼠类内耳器官型培养，也称为耳蜗组织块培养。内耳中有序细胞结构的保留有助于 原位 对耳蜗结构的各个组成部分进行评估，包括内毛细胞和外毛细胞、螺旋神经节神经元、神经突以及支持细胞。本文介绍了新生小鼠耳蜗组织块的制备、培养、处理及免疫染色方法。这些组织块的精细制备有助于识别导致感音神经性听力损失（SNHL）的机制，为听力研究领域提供了一种重要的研究工具。
引言
感音神经性听力损失（SNHL）反映了内耳或上行听觉通路的损伤。尽管听力损失是人类最常见的感觉功能障碍1，但目前尚无治愈性疗法2。虽然人工耳蜗或听觉脑干植入装置能够为中重度至极重度SNHL患者恢复一定程度的听力，但这些设备所提供的听力体验仍与"自然"听力存在显著差异，尤其在噪声环境中理解言语或聆听音乐时更为明显。
虽然毛细胞变性长期以来一直被认为是创伤性听觉事件（例如暴露于强噪声）的主要后果，但越来越多的证据表明，将信息从毛细胞传递到听觉神经的突触对声创伤的易损性至少与毛细胞相当3,4,5,6。由于目前评估听力功能的金标准——人类听阈测定结果——无法预测内耳中特定的细胞损伤，因此需要更精细的工具以尽早发现细胞变性，并及时启动适当的治疗7。
有前景的听力损失药物治疗通常在同质细胞培养物上进行测试 体外，但此类系统无法准确模拟耳蜗的微环境。已知耳蜗细胞会分泌影响耳蜗内其他细胞类型的神经营养因子8,9，一个至关重要的 体内 耳蜗柯蒂氏器功能丧失时消失的过程10,11 或螺旋神经节神经元（SGNs）12 在单独培养或分析分子标志物时13然而， 体内 可能需要用于验证的研究 体外 数据以建立新的个性化听力损失治疗方法，致力于 "精准医学" 需要耗费大量资源和时间。这一点在考虑完成中耳或圆窗膜注射、听力测试以及随后的耳蜗铺片解剖所需付出的巨大努力时尤为突出。在耳蜗类器官培养中对有前景的化合物进行高效筛选 离体 被称为耳蜗外植体的培养方法提供了一种经济且可靠的替代方案14,15,16,17.
本文详细介绍了一种用于制备、维持和评估经处理的耳蜗组织外植体的实验方案。重点强调了该模型的具体应用，包括用于筛选潜在治疗化合物以及比较评价基因治疗中病毒载体的效果。 离体 外植体方法可使研究人员观察特定处理对不同细胞群体的影响 原位，有助于识别细胞类型特异性的机制，并进一步优化靶向治疗策略。
总体而言，该技术为研究耳蜗提供了一个模型 离体 同时保持耳蜗内共存的多种不同类型细胞之间至关重要的相互作用。
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方案
本研究方案经马萨诸塞州眼耳医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。实验按照世界医学协会《赫尔辛基宣言》的伦理准则进行。
1. 解剖前准备
- 准备手术台
- 使用70%乙醇对手术台进行消毒。
- 在显微镜旁放置两块非无菌的准备垫。
- 准备器械托盘，包括热灭菌的手术剪、刀柄、微型刀片以及镊子（#4 镊子各两把） & #55)。将器械托盘和一个50 mm透明壁玻璃底培养皿放置在一块非无菌垫上。
- 获取无菌的#15手术刀片；一个可密封的塑料袋或容器（用于按照机构指南处理尸体）；装有冰块的桶；以及冰冷的无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）。将这些物品放置于另一块非无菌垫上。
- 将HBSS转移至一个50 mL塑料实验管中，并置于冰上。
- 准备培养物
- 在超净工作台中准备所有材料。每处理四个样本，将四个经高压灭菌的10 mm圆形玻璃盖玻片放入35 mm四孔培养皿的四个凹槽中。
- 每处理 4 个样本，在微量离心管中混合总体积为 300 µL 的下列成分：10 µL 组织粘合剂，285 µL NaHCO₃3，以及 5 µL NaOH。
- 将45 µL上述溶液滴加至每张盖玻片上，室温下静置至少20分钟；该溶液可在盖玻片上放置数小时，但不可过夜。
- 将一个或两个35 mm 4孔培养皿放入10 cm培养皿中，以形成两层防污染屏障。
- 配制含有98% DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）、1% N-2和1%氨苄青霉素的培养基（每孔65 µL，置于（微）离心管中）。使用前将溶液预热至25 °C。
2. 小鼠耳蜗外植体解剖
- 新生小鼠断头术
- 取一个60 mm的塑料培养皿，将70%乙醇喷洒在其皿盖内表面，使其充分润湿。
- 将冰冷的HBSS从塑料实验管中倒入60 mm塑料培养皿的底部以及50 mm透明壁玻璃底培养皿的底部。当组织未进行解剖时，将塑料实验管和两个培养皿均置于冰上，以保持组织低温。
- 放置一个 P3 - 将出生5天的小鼠置于乳胶手套剪下的指套中并放在冰上，等待低温诱导其失去意识（约1-3分钟）。
- 用手术剪迅速将小鼠断头，并将尸体放入可密封的塑料袋中处理。将分离的新生小鼠头部置于60 mm塑料培养皿盖内的70%乙醇中。
- 颞骨的大体解剖
- 使用手术刀片从颅骨前端至后端（正对矢状缝上方）做一表层切口，以去除颅骨表面的皮肤。
- 用手术刀片切断双侧外耳道，将皮肤向前折叠，以暴露整个颅骨。
注意：尽管此步骤通常不需要解剖显微镜，但可使用以获得更好的观察效果。 - 使用#15手术刀刀片沿矢状缝切开颅骨。确保从前向后轻轻上下移动刀片以切割颅骨，避免压迫耳蜗。
注意：此年龄段的颅骨应尚未骨化，应易于切割。 - 使用#15手术刀片在眼眶后方垂直切割，移除并丢弃吻部。
注意：颅骨后部应仍保留脑组织和耳蜗。 - 使用#4镊子通过钝性解剖去除前脑、小脑和脑干。
- 耳蜗的显微提取
- 调节显微镜（6.5X） 放大倍数）并调整光源：将镊子置于显微镜下，优化照明和焦距。
- 将颅骨的两个半部分放入盛有冷HBSS的60 mm塑料培养皿中。
- 完全暴露耳蜗，其位置可识别为邻近镫骨动脉（位于颞骨内的弯曲动脉），使用#4镊子将该器官与颞骨进行钝性分离。
- 将耳蜗转移至50 mm透明壁玻璃底培养皿中，并将培养皿置于显微镜下。
- 将装有颅骨另一半的60 mm塑料培养皿置于冰上。
- 从前庭系统中取出耳蜗，并使用#4镊子仔细解剖耳蜗的骨迷路（此年龄段通常为软骨状）。后续所有步骤均使用#55镊子。
- 组织处理的最后步骤
- 使用微型刀片或两把镊子，小心地将与耳蜗柯蒂氏器粘连的螺旋韧带从耳蜗其余部分及蜗轴中分离出来，继续进行内耳组织的处理。
- 在螺旋韧带与毛细胞区域之间的缝隙处，切入颜色较深的半透明区域，然后从最基部抓住螺旋韧带，一边向顶部移动，一边轻轻将其旋开，进而将其完整移除。
- 将标本放置以获得耳蜗的纵断矢状面视图，使用微型刀将耳蜗切成两至三段，将其分为顶回、（中回、） 以及基底回。去除毛细胞和神经突实际层上下方的组织，以获得能够水平放置于培养皿中的耳蜗外植体组织块。
注意：耳蜗组织在培养皿中稳定贴壁的合适尺寸约为半个耳蜗回转。 - 用镊子轻轻剥离位于柯蒂氏器正上方的一层极薄且半透明的前庭膜。
- 用镊子从两侧接触位于螺旋神经节神经元（SGNs）正上方的Reissner膜，轻轻剥离并移除。
注意： 用微型刀切除侧方受损的毛细胞区域。
- 使用微型刀片或两把镊子，小心地将与耳蜗柯蒂氏器粘连的螺旋韧带从耳蜗其余部分及蜗轴中分离出来，继续进行内耳组织的处理。
3. 将标本转移至培养皿
- 从四个盖玻片上移除 45 µL 组织粘合剂溶液。用 50 µL 无菌 H2O 清洗每个盖玻片，然后吸去水分。
- 取 1 mL 移液器，用约 120 µL DMEM 润洗移液器吸头，以防止样本黏附在吸头内壁。
- 使用 1 mL 移液器逐个转移样本。从盛有 HBSS 的小尺寸透明壁玻璃底培养皿中吸取最多 70 µL 液体，并将样本连同液体一起转移至 4 孔培养皿中的一个嵌入片（已放置盖玻片）上。
- 在显微镜下（50 倍放大）检查样本是否处于正确方向。确保去除前庭膜后暴露的毛细胞区域朝上，基底膜连同修剪后的耳蜗轴底部朝下，并紧贴盖玻片。
- 若检查发现样本方向颠倒，请将移液器吸头中残留的 HBSS 滴入嵌入片中，并重新调整样本位置直至方向正确。
注意：此举可防止毛细胞在培养基中漂浮而缺乏盖玻片的结构支撑，从而避免发生退变。
- 若检查发现样本方向颠倒，请将移液器吸头中残留的 HBSS 滴入嵌入片中，并重新调整样本位置直至方向正确。
- 用 1 mL 移液器吸除多余的 HBSS，静置 15 秒。
- 将 60 µL 预热的培养基（98% DMEM、1% N-2 和 1% 氨苄青霉素）直接滴加到样本上。注意勿使移液器接触样本。盖好内、外培养皿盖，于 37 °C 孵育过夜。
- 将所有储备溶液归位，妥善处理动物残体和剩余废弃物，根据机构规定对手术台进行去污染处理（例如，使用乙醇或次氯酸盐），清洁并高压灭菌器械，并将锐器丢弃至专用容器中。
4. 添加终末培养基和目标物质
注意：耳蜗外植体将在 10–16 小时后准备就绪，可供使用。
- 配制混合液：97% DMEM、1% 胎牛血清（FBS）、1% N-2 和 1% 氨苄青霉素（每孔 65 µL，加入微量离心管中；使用前将溶液预热至 25 °C）。
- 为各处理组的溶液添加其他感兴趣的物质。如果添加荧光物质（例如， 绿色荧光蛋白（GFP）表达病毒；在最近的一项研究中，使用了10的浓度10 腺相关病毒（AAVs）的GC在50 µL体系中使用了48小时18，避光保存。
- 将含有耳蜗外植体的培养皿从培养箱中取出，置于超净工作台内。
- 用移液器从嵌板中吸除旧的培养基（不含FBS）。
- 每孔加入 60 µL 预热的培养（处理）液（97% DMEM、1% FBS、1% N-2、1% 氨苄青霉素及目标物质）。
- 将培养皿放回培养箱（37 °C）。
- 在显微镜下定期观察，以识别污染、细胞迁移或耳蜗外植体脱落的迹象，并在培养不超过7天后进行染色。
5. 免疫荧光——第1天
- 配制封闭液（94% 磷酸盐缓冲液 (PBS)、5% 正常山羊或马血清 (NGS/NHS，根据二抗选择) 和 1% 非离子型表面活性剂（见材料表））以及储备抗体溶液（98.6% PBS、1% NHS、0.4% 非离子型表面活性剂，并加入相应的抗体）。
注意：抗体包括 Myo7A 兔抗（浓度为 1:400+，肌球蛋白 7A，用于标记内毛细胞和外毛细胞）、TuJ1 小鼠抗（浓度为 1:200+，β-微管蛋白，用于标记螺旋神经节神经元 SGNs），或 CtBP2 小鼠(IgG1) 抗体（浓度为 1:200+，C末端结合蛋白，用于标记突触前）、PSD95 小鼠(IgG2a) 抗体（浓度为 1:50+，突触后密度蛋白，用于标记突触后）以及 NF-H 鸡抗（浓度为 1:1000+，神经丝蛋白，用于标记 SGNs 和神经纤维）。"+" 表示 "或更高稀释倍数。" - 使用移液器吸除培养基。操作时注意不要触碰样本。
- 在超净工作台内，用无菌 PBS 漂洗耳蜗外植体两次，每次漂洗后将样本置于摇床上振荡 5 分钟。
- 在摇床上（于通风罩内）用 4% 多聚甲醛 (PFA - 注意：有危险性) 固定组织 20 分钟，随后吸除 PFA 溶液。
- 向耳蜗外植体中加入 60 µL PBS，将培养皿置于摇床上振荡 5 分钟，然后吸除 PBS。重复此步骤 3 次。
- 将耳蜗外植体放入预先配制的封闭液（94% PBS、5% NHS 和 1% 非离子型表面活性剂）中，在摇床上封闭 30 分钟。
- 将耳蜗外植体放入含有相应一抗（使用前涡旋混匀）的预配储备抗体溶液（98.6% PBS、1% NHS 和 0.4% 非离子型表面活性剂）中，在室温下静置过夜（O/N）。
注意： 将培养皿用湿润的纸巾包裹后再包上塑料膜（若所加溶液含有荧光物质，如表达 GFP 的病毒，则使用铝箔包裹），以保持湿度并防止抗体溶液在过夜过程中蒸发。
6. 免疫荧光 - 第2天
- 配制4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（300 nM），并使用抗体原液配制与第5.1步中一抗相匹配的合适二抗混合液。例如山羊抗兔488 1:200+ 和山羊抗小鼠568 1:200+，或山羊抗小鼠（IgG1）568 1:1000+、山羊抗小鼠（IgG2a）488 1:500+ 和山羊抗鸡647 1:200+，或鬼笔环肽568 1:200+（用于内毛细胞和外毛细胞）。
- 吸出一抗溶液。
- 向耳蜗外植体中加入60 µL PBS，将培养皿置于摇床上振荡5分钟。吸除PBS。重复此步骤3次。
- 将耳蜗外植体置于预先配制的抗体储存液（98.6% PBS、1% NHS 和 0.4% 非离子型表面活性剂）中，加入相应的二抗（使用前涡旋混匀），室温孵育 1.5 小时，避光。
- 吸弃二抗溶液，用DAPI染色液冲洗耳蜗外植体（置于摇床上1分钟，然后吸弃）。
- 向耳蜗外植体中加入60 µL PBS，将培养皿置于摇床上振荡5分钟。吸除PBS。重复操作3次。
- 使用镊子从4孔板中取出带有样本的盖玻片，将其浸入盛有蒸馏水的容器中2O，并将盖玻片垂直接触纸巾以晾干。
- 在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂，将盖玻片反转，使朝下的组织浸入封片剂中。
- 用透明指甲油沿盖玻片边缘环形封固（注意避免压碎盖玻片下的样本）。将载玻片平放在避光处静置15–20分钟，待其完全干燥后，放入盒中保存或直接在共聚焦显微镜下观察。
注意：荧光染色的最佳保存条件是将载玻片置于 4 或 -20 °C 保存。
7. 共聚焦成像
- 获取耳蜗柯蒂氏器区域的概览图像及放大图像，包括神经突和螺旋神经节神经元（SGNs）。
注意：成像过程的标准设置如下：图像分辨率为1,024 × 1,024像素，扫描速度为400 Hz，帧平均数为3，激光总强度为20%，通常使用20X和63X 油浸物镜（可结合2倍数字放大）。DAPI、Myo7A和TuJ1染色方案的通道设置如上所述：405 nm通道，5% DAPI，"Smart Gain" 766.8 V，"Smart Offset" 0.0%；488 nm通道，15%异硫氰酸荧光素（FITC），"Smart Gain" 622.2 V，"Smart Offset" 0.0%；561 nm通道，13%四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC），"Smart Gain" 562.4 V，"Smart Offset" 0.0%。 - 使用软件将z轴层扫图像合并，生成z轴投影图像。
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结果
尽管许多实验方案聚焦于耳蜗柯蒂氏器的外植培养，本技术旨在保留整个耳蜗回旋的解剖结构，包括螺旋神经节神经元（SGNs）。这使得研究人员能够分析特定处理对SGNs的神经突起和胞体所产生的影响，而不仅限于柯蒂氏器。如本文所述，保留部分蜗轴的显微解剖操作相较于单独分离柯蒂氏器更具技术挑战性。然而，神经突及SGN区域至关重要，因为在最近两项采用相同方法的研究中发现，施加前庭神经鞘瘤分泌物（图1）和细胞外囊泡后，该区域出现了显著的病理改变19,20。此类变化若仅使用分离的柯蒂氏器外植体则无法被揭示。
可通过手动计数或自动方法（例如 ImageJ 插件 NeuronJ 中内置的方法）对内毛细胞和外毛细胞、支持细胞以及螺旋神经节神经元（SGN）中受损或表达 GFP 的细胞进行定量分析。在确认其与总细胞数具有相关性后，可...
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讨论
在进行涉及耳蜗组织外植体的实验之前，研究人员必须熟练掌握解剖技术。在学习曲线的初期阶段进行解剖时，毛细胞常常会受到损伤，其中对细胞完整性尤为不利的一个环节是撕除前庭膜，该步骤需要稳定的手法、合适的工具以及丰富的经验。为了节约时间和资源，应在解剖显微镜下进行视觉检查，并记录可能受损的区域。在初步实验中，相较于昂贵的一抗和二抗，使用鬼笔环肽等成本较低的试剂更为合适。轻微受损的外植体在某些实验中仍可作为对照使用（例如分析未受影响的切片区域），或用于测试新的抗体组合。
标本的转移也尤为重要，因为必须确保标本不会被上下颠倒放置"漂浮" 无包被盖玻片引导时，毛细胞常发生退化。将细胞置于盖玻片中央位置有利于后续所有移液操作。
在涉及新型化合物的阴性对照实验中（这些化合物显然必须可溶于培养基），重要的是应对外植体使用适当的溶剂对照，而不仅仅关注未经处理的外植体。例如，如果一种市售药物除活性成分外还含有柠檬酸钠，则应将柠檬酸钠添加到阴性对照组的耳蜗外植体中，因为柠檬酸钠本身可能产生影响。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了耳聋与其他沟通障碍国家研究所基金R01DC015824（K.M.S.）和T32DC00038（资助S.D.）、美国国防部基金W81XWH-15-1-0472（K.M.S.）、Bertarelli基金会（K.M.S.）、Nancy Sayles Day基金会（K.M.S.）以及Lauer耳鸣研究中心（K.M.S.）的支持。我们感谢Jessica E. Sagers，文学士对稿件提出的深刻意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氨苄青霉素钠盐 | Invitrogen | 11593-027 | |
| 抗CtBP2抗体，小鼠（IgG1） | BD 转导实验室 | 612044 | |
| 兔抗 Myo7A 抗体 | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| 抗NF-H抗体，鸡源 | EMD Millipore | AB5539 | |
| 抗PSD95抗体，小鼠（IgG2a） | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| 抗TuJ1抗体，小鼠 | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak 细胞和组织粘附剂，5 mg | 康宁 | 354241 | |
| CELLSTAR 15 mL 离心管，锥形底，带刻度，无菌 | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 细胞培养皿，100 × 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR 细胞培养皿，35 × 10 mm，带4个内环 | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR 细胞培养皿，60 × 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL 离心管，锥形底，带刻度，无菌 | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 透明指甲油 | 电子显微镜科学公司 | 72180 | |
| 透明壁玻璃底培养皿（玻璃直径 40 mm），PELCO®，套管/20，50 x 7 毫米 | Ted Pella 公司 | 14027-20 | |
| 盖玻片，圆形，玻璃，直径10 mm，厚度#1，0.13 - 0.16 mm | Ted Pella 公司 | 260368 | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐） | 赛默飞世尔科技 | D1306 | |
| 蒸馏水，500 mL | 赛默飞世尔科技 | 15230-162 | |
| 高糖型 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），含丙酮酸钠，不含谷氨酰胺，500 mL | 赛默飞世尔科技 | 10313-039 | |
| Dumont #4 镊子 | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 镊子（Dumostar） | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| 乙醇（EtOH），纯品，200 proof，无水 ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| 胎牛血清（FBS），经鉴定，符合美国农业部批准地区标准，500 mL | 赛默飞世尔科技 | 10437-028 | 分装至50 mL离心管中，于-20℃保存°C 冷冻室 |
| 山羊抗鸡-647 二抗 | 赛默飞世尔科技 | A-21469 | |
| 山羊抗小鼠(IgG)-568 二抗 | 赛默飞世尔科技 | A-11004 | |
| 山羊抗小鼠（IgG1）-568 二抗 | 赛默飞世尔科技 | A-21124 | |
| 山羊抗小鼠（IgG2a）-488 二抗 | 赛默飞世尔科技 | A-21131 | |
| 山羊抗兔-488 二抗 | 赛默飞世尔科技 | R37116 | |
| H2O，无菌，EmbryoMax 超纯水，500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank's 平衡盐溶液（HBSS），含钙、含镁，无酚红，500 mL | 赛默飞世尔科技 | 14025-092 | |
| 带盖不锈钢器械托盘 | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| 显微（解剖）刀 – 30度角° | 精细科学工具 | 10056-12 | |
| 显微镜载玻片，VistaVision，彩色编码，75 x 25 mm（3 x 1）"），1 毫米厚，白色，72 片装 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 补充剂（100 倍浓缩液），5 mL | 赛默飞世尔科技 | 17502-048 | |
| NaHCO₃37.5% 碳酸氢钠溶液，100 mL | 赛默飞世尔科技 | 25080-094 | |
| NaOH，氢氧化钠溶液，1 L | 赛默飞世尔科技 | SS266-1 | |
| 正常马血清（NHS） | Invitrogen | 16050130 | |
| 手术剪的使用 | Roboz外科器械公司 | RS-6806 | |
| 多聚甲醛（PFA），试剂级，结晶状 | Sigma-Aldrich | P6148 | 使用前：根据在线可获取的方案建立标准操作规程 |
| PBS，pH 7.4，500 mL | 赛默飞世尔科技 | 10010-023 | 使用前需高压灭菌 |
| 鬼笔环肽，Alexa Fluor 568 | 赛默飞世尔科技 | A12380 | |
| 非无菌制备垫 | Medline | 05136CS | |
| 安全锁微型离心管，聚丙烯材质，0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | 使用前高压灭菌 |
| 安全锁微型离心管，聚丙烯材质，1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | 使用前高压灭菌 |
| 手术刀片 - #15 | 精细科学工具 | 10015-00 | |
| 手术刀柄 - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C 体视显微镜 | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 共聚焦显微镜 | Leica | N/A | |
| Triton-X（非离子型表面活性剂） | Integra | T756.30.30 | |
| 荧光防淬灭封片剂 VectaShield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| 拉链袋，可重复封口，4 x 6英寸 - 厚度2 mm | Zipline | 0609132541599 |
参考文献
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