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斑马鱼中Myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病侧群细胞的分离

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DOI：

10.3791/55711

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2017年5月4日

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1Department of Pediatrics, Section of Hematology-Oncology, The University of Chicago, 2Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

本文内容

摘要

本文介绍一种从myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）斑马鱼模型中分离侧群细胞的技术。该侧群细胞检测方法具有高灵敏度，虽针对斑马鱼T-ALL描述，但也可适用于其他良性和恶性斑马鱼细胞类型。

摘要

异质性细胞群体（来自正常或恶性组织）可能包含一类具有差异性外排DNA结合染料Hoechst 33342能力的细胞亚群。这类“侧群细胞”在Hoechst 33342染料经紫外（UV）激光激发后，可通过流式细胞术方法进行鉴定。多种细胞类型的侧群中富含具有干细胞或祖细胞特性的细胞。然而，并非所有细胞类型均存在可识别的侧群细胞。 Danio rerio斑马鱼具有强大的 体内 T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的斑马鱼模型已被建立，但目前尚不清楚这些斑马鱼T-ALL是否具有侧群细胞。本文所述方法详细介绍了如何从斑马鱼T-ALL中分离侧群细胞。首先，通过将tol2质粒显微注射至单细胞期胚胎中，诱导斑马鱼产生T-ALL。当肿瘤生长至扩展超过动物体长一半的阶段时，即可收获T-ALL细胞。随后，使用Hoechst 33342对细胞进行染色，并通过流式细胞术检测侧群细胞。该方法在斑马鱼T-ALL研究中具有广泛的应用价值。尽管目前尚未发现可用于确认这些侧群细胞是否具有类似癌症干细胞特性的斑马鱼细胞表面标志物， 体内 功能移植实验是可行的。此外，可应用单细胞转录组学来鉴定这些侧群细胞的遗传特征。

引言

侧群细胞检测利用了某些组织细胞因细胞膜上高表达ATP结合盒（ABC）转运蛋白，从而增强外排DNA结合染料Hoechst 33342的能力。当该染料被紫外激光激发后，可通过双波长流式细胞术分析鉴定出能够外排Hoechst 33342染料的细胞。该检测方法最初用于鉴定小鼠造血干细胞（HSCs）1，此后已被用于鉴定多种组织和肿瘤中的干细胞/前体细胞群体（参见文献2综述）。然而，并非所有细胞群体都存在侧群细胞，且并非所有侧群细胞群体均富集了干细胞/前体细胞。

斑马鱼是研究人类癌症的一种强大脊椎动物遗传学模型系统3,4，相较于传统的小鼠癌症模型具有多项优势。斑马鱼胚胎为体外受精且具有光学透明性，便于转基因操作及 体内 观察病理过程，包括癌症的起始与进展。迄今为止，用于检测潜在干细胞或前体细胞的侧群分析法仅在斑马鱼的肾髓中应用以鉴定造血干细胞（HSCs），尚未应用于任何斑马鱼癌症模型5,6.

斑马鱼T细胞急性淋巴母细胞白血病（T-ALL）模型在形态学和遗传学上与人类T-ALL相似7,8,11。T-ALL是一种侵袭性恶性肿瘤，在人类中占儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）病例的10-15%，以及成人ALL病例的25%9。尽管T-ALL的治疗已有所改善，但复发仍较常见，并且与不良预后相关。T-ALL肿瘤具有异质性，包含多种不同的肿瘤细胞亚群，其中包括白血病起始细胞（LICs）。LICs的特征在于其单个细胞即可重新生成整个肿瘤的能力，而肿瘤细胞群体中LICs的频率可通过极限稀释移植实验（LDA），将不同剂量的细胞移植至受体中进行计算8,10,11。虽然已在斑马鱼中开展LDA实验以计算LICs的频率，但该方法属于回顾性分析，无法实现对LICs的前瞻性分离。因此，目前尚缺乏一种可前瞻性分离富含癌症干细胞活性细胞群体的方法。从斑马鱼T-ALL中识别并分离侧群细胞（side population cells）是解决这一缺陷的第一步。

本文所述方案介绍了如何利用tol2介导的转基因技术在斑马鱼中高效诱导T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）肿瘤，获取T-ALL肿瘤细胞，并使用Hoechst 33342染色以鉴定其中的侧群细胞。未来针对斑马鱼T-ALL的体内实验可进一步探究侧群细胞是否富集白血病起始细胞（LICs），或是否具有其他类似干细胞或前体细胞的特性。

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方案

所有涉及斑马鱼的操作程序均已获得芝加哥大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。芝加哥大学已通过实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）的认证。

1. 在斑马鱼中生成和分离荧光标记的T细胞急性淋巴细胞白血病细胞

  1. 向同源型斑马鱼胚胎中进行显微注射
    1. 使用市售试剂盒分离含有可被tol2转座酶识别的反向末端重复序列的环状rag2:c-myc和rag2:绿色荧光蛋白（rag2:GFP）质粒DNA（质粒DNA来源见材料表）12，并将DNA洗脱于无菌水中。
      注：本研究使用GFP，但任何荧光蛋白均可适用。
    2. 制备pCS2-转座酶（tol2）RNA
      1. 使用市售试剂盒分离tol2质粒DNA（质粒DNA来源见材料表）12，并将DNA洗脱于无菌水中。
      2. 在适当的缓冲液中，将1 µg tol2 DNA与5单位NotI限制性内切酶在37 °C孵育1小时，以线性化质粒。随后在65 °C加热20分钟以灭活NotI酶。
      3. 使用市售RNA转录试剂盒13，以SP6 RNA聚合酶对线性化DNA进行tol2 RNA的体外转录。将RNA分装为单次使用量，于-80 °C保存。
    3. 在冰上配制注射混合液：加入250 ng rag2:c-myc质粒DNA、250 ng rag2:GFP质粒DNA、150 ng tol2 RNA以及0.5 µL酚红，用无核酸酶水定容至10 µL。
    4. 使用显微注射仪及由玻璃毛细管拉制而成的注射针，向单细胞期同源型斑马鱼胚胎的细胞中注射约1 nL注射混合液，操作参照已建立的方法8,14。
      注：此处使用的同源型斑马鱼通过孤雌生殖产生15，以消除遗传异质性及移植后的免疫排斥。然而，野生型斑马鱼或任何所需品系亦可使用。
    5. 在注射后24小时和48小时，移除死亡、发育不良或畸形的胚胎16。
    6. 在注射后第6天将注射后的鱼转移至养殖系统中，并按照标准方案进行饲养6。
  2. 筛选注射后的斑马鱼并监测肿瘤生长
    1. 在注射后21天，将单个注射后的幼鱼置于培养皿中的一滴胚胎培养基液滴内，使用落射荧光显微镜（激发滤光片：470/40，发射滤光片：525/50）检测GFP荧光8。
      注：成功整合rag2:c-myc和rag2:GFP质粒的斑马鱼幼体将表现出绿色荧光的胸腺（阳性鱼），并可能已出现恶性绿色荧光细胞向胸腺外扩散的现象。所有具有GFP阳性胸腺的鱼均会发展为GFP阳性的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）。未整合质粒的幼鱼则无任何绿色荧光细胞（阴性鱼）。
    2. 将阴性鱼（基于无荧光表现）分选至不同鱼缸中，并在注射后28天和35天再次进行监测。在注射后28天和35天，使用含0.02%缓冲三卡因（MS-222）的鱼系统水对鱼进行麻醉后再进行筛选。
    3. 将胸腺或肿瘤呈现荧光标记阳性的每条斑马鱼幼体分别置于独立鱼缸中，每周监测三次肿瘤生长情况。
  3. 从原发肿瘤鱼中收集荧光标记的T-ALL细胞
    1. 配制至少20 mL含10%热灭活胎牛血清的0.9x磷酸盐缓冲液（FBS/PBS）。
    2. 向一管肝素钠盐（300单位）中加入1 mL FBS/PBS。
    3. 选择肿瘤占据体长超过50%的鱼，或摄食或游动困难的鱼。通过过量三卡因麻醉或冰水浸泡处死鱼，并通过鳃部运动和心跳停止确认死亡。
    4. 使用剃须刀片切除鱼头。
    5. 用肝素溶液冲洗鱼体腔以去除多余的红细胞。
      1. 使用移液器将100 µL肝素溶液（按步骤1.3.2配制）注入鱼体腔内。吸出所有溢出液体（含血细胞），并转移至1.5 mL微量离心管中。
      2. 使用新的移液器吸头再次冲洗体腔。至少重复冲洗三次，或直至溢出液体中无可见血液。
      3. 弃去步骤1.3.5.1和1.3.5.2中所有冲洗液，因其不用于后续分析。
    6. 收集白血病细胞。
      1. 向鱼体腔内注入100 µL FBS/PBS。
      2. 用移液器吸头轻轻按压鱼体外部，挤出肿瘤细胞。
        注：若在解剖显微镜下操作，可清晰观察到肿瘤细胞从体腔中流出。
      3. 将每次冲洗所得液体和细胞收集至1.5 mL微量离心管中。
      4. 重复步骤1.3.6.1–1.3.6.3，直至大部分肿瘤细胞被收集（通常5–10次）。将所有肿瘤细胞收集至同一支1.5 mL微量离心管中。细胞置于室温保存。
    7. 通过轻柔吹打将步骤1.3.6收集的肿瘤细胞悬液混匀，以分散细胞团块。将细胞悬液经40 µm孔径滤膜过滤。用100 µL FBS/PBS洗涤滤膜1–2次。细胞置于室温保存。
    8. 在新管中将2 µL细胞悬液与18 µL台盼蓝（0.4%，稀释1:10并过滤）混合。取10 µL加入血细胞计数板，计数活细胞（非蓝色）中的荧光细胞数量，以计算分离得到的肿瘤细胞总数。
      注：非蓝色的GFP阴性细胞可能为正常的非恶性T细胞，不应计入。至少需要2 × 106个细胞用于Hoechst 33342染色。

2. 使用Hoechst 33342染色荧光标记的T-ALL细胞以鉴定侧群细胞

  1. 用无核酸酶水将 Hoechst 33342 按 1:10 比例稀释2O，以配制1 mg/mL的工作浓度。将染料于4 °C避光保存。
  2. 通过将49.1 mg维拉帕米溶解于1 mL二甲基亚砜（DMSO）中，配制100 mM的维拉帕米溶液。
    注意：维拉帕米（verapamil）是一种ABC转运蛋白抑制剂，在侧群细胞实验中具有重要的对照作用。将维拉帕米加入样本后，可抑制ABC转运蛋白外排Hoechst 33342染料的能力。因此，真正的侧群细胞在添加维拉帕米后会消失。
  3. 将水浴锅温度设置为 28 °C。
  4. 在避光条件下制备样品和对照，将细胞和溶液加入荧光激活细胞分选（FACS）管中。
    1. 通过加入10制备样品6 细胞，15 µL 1 mg/mL Hoechst 33342，以及 2.5 µL DMSO 加入流式管中，用 FBS/PBS 定容至 1 mL。
    2. 通过加入10制备对照组6 细胞，15 µL 1 mg/mL Hoechst 33342，以及 2.5 µL 100 mM 维拉帕米加入 FACS 管中，用 FBS/PBS 调整体积至 1 mL。
      注意：至少需要 10 个6 建议每个样本使用适量细胞，但更推荐染色更多细胞，尤其是当侧群细胞需要分选用于后续分析时。细胞数量不应超过10^76 细胞/mL，并维持Hoechst 33342浓度为15 µg/mL。若为10 x 106 细胞染色，总体积为10 mL。
  5. 在28 °C水浴中避光孵育120分钟。
  6. 孵育结束后立即将细胞置于冰上，并在避光条件下保存。
  7. 在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 6 分钟，使细胞沉淀。弃去上清液。用 1 mL FBS/PBS 洗涤。
  8. 在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 6 分钟，使细胞沉淀。弃去上清液。用 1 mL FBS/PBS 重悬细胞。
  9. 4 °C 保存直至细胞分选。
  10. 细胞分选前15分钟，向每1 mL FBS/PBS中加入2 µL碘化丙啶（PI）储备液（1 mg/mL），终浓度为2 µg/mL，充分混匀。

3. 使用流式细胞分选技术鉴定荧光标记的T细胞急性淋巴细胞白血病细胞群体中的侧群细胞

  1. 使用配备紫外激光（用于Hoechst 33342染料激发）和488 nm激光（用于PI激发及GFP+ T-ALL细胞检测）的流式细胞分选仪，分析经染色的斑马鱼T-ALL细胞悬液。
  2. 确定活的、GFP+ T-ALL细胞的门控范围。
    1. 使用前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）面积圈选以排除碎片。
      注意：FSC 用于区分细胞大小，SSC 用于区分细胞的颗粒度。
    2. 使用FSC和SSC宽度来区分双联体。
      注意：流式细胞仪检测器识别三个组分：面积、高度和宽度。面积通常用于测量细胞的荧光强度。宽度用于测量飞行时间，当两个细胞聚集在一起时，其宽度会加倍。
    3. 对于活体肿瘤细胞，使用适当的检测器，圈选GFP阳性且PI阴性的细胞设门例如，FITC 用于 GFP，PerCP Cy5-5 用于 PI。
  3. 在活细胞门控中，通过Hoechst Blue和Hoechst Red带通滤光片（分别为450/50和670/30）检测Hoechst 33342荧光。
    注意：若存在侧群细胞，在设置完成后将清晰可见。重要的是，侧群细胞必须在维拉帕米对照组中消失，方可被认定为真正的侧群细胞。
  4. 若需分选侧群细胞用于后续实验，应使用大口径喷嘴（100 µm），并将细胞收集至含有3 mL 100% FBS的FACS管中。为提高分选后细胞的存活率，应选用大口径喷嘴（100 µm）而非小口径喷嘴（70 µm）。

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结果

为了在斑马鱼中高效产生荧光标记的Myc诱导型T细胞急性淋巴母细胞白血病（T-ALL）肿瘤，可将两侧带有tol2转座酶识别位点的环状DNA构建体与tol2 RNA共同注射。既往将线性化DNA注射入斑马鱼胚胎的研究报道其转基因率为5%8。通过调整实验方案，采用tol2介导的转基因技术后，可观察到10%至44%的转基因率（表1）。

在代表性示例中，对一条携带 GFP+ T-ALL 的鱼用 Hoechst 33342 进行染色，以确定侧群细胞所占的比例。图1展示了用于确定侧群细胞百分比的设门策略。首先，利用 FSC 和 SSC 排除碎片，从而分离出 T-ALL 细胞（图1A），随后排除双联体（图1B）。接着，通过选择 GFP+ 且对死细胞鉴别染料 PI 呈阴性的细胞，分离出全部活...

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讨论

侧群细胞检测法具有高度敏感性，因此实验方案的微小变动可能导致难以检测到侧群细胞。首先，染色步骤中的温度因不同动物或细胞体系而异。对于哺乳动物体系，侧群细胞检测通常在 37 °C 下进行2。当将斑马鱼 T-ALL 细胞在 37 °C 下孵育时，大量细胞死亡，因此该孵育温度不可接受（数据未显示）。Kobayashi 及其同事（2008 年）在分离斑马鱼肾脏髓质进行侧群细胞检测时，孵育温度设定为 25 °C5。然而，该温度对斑马鱼 T-ALL 细胞并不足够，会导致 Hoechst 33342 染色信号较弱（数据未显示）。在本方案中，28 °C 的孵育温度在维持细胞活力和获得强 Hoechst 33342 信号方面均达到最佳效果。

进行侧群细胞检测时，另一个需要考虑并预先测试的条件是 Hoechst 33342 的浓度。如果 Hoechst 33342 浓度过低，则侧群可能无法显现，或侧群表型（染料外排能力）可能被错误地增强，导致识别出的侧群细胞数量多于实际存在的情况

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由芝加哥大学女性董事会、Wendy Will Case 基金以及芝加哥大学综合癌症中心支持基金（P30 CA014599）资助。我们感谢芝加哥大学流式细胞术核心实验室在本实验建立过程中提供的帮助，同时也感谢 de Jong 实验室的其他成员，特别是 Leslie Pedraza 和 Sean McConnell。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
同系型斑马鱼（CG2）参见 Mizgireuv et al., 2006
rag2:c-myc 质粒Langenau 实验室
de Jong 实验室构建的 rag2:GFP 质粒来自 Langenau 实验室的 rag2 启动子
pCS2-转座酶质粒Chien 实验室
NotI -HF 限制性内切酶新英格兰生物实验室公司R3189S25 µL 中含 500 单位
mMessage Machine SP6 转录试剂盒AmbionThermo Fisher Scientific - AM134025 次反应
QIAGEN 质粒中量提取试剂盒Qiagen 公司12643
SteREO Discovery V8 显微镜卡尔·蔡司显微系统公司495015-0008-000
数字微量注射仪Tritech ResearchMINJ-D
黄铜直臂持针器Tritech ResearchMINJ-4
磁性底座和支架Tritech ResearchMINJ-HBMB
显微操作器Narishige 国际公司MN153
玻璃毛细管Sutter Instrument Co.B100-50-1010 cm，无丝
Flaming/Brown 微量移液管拉制仪Sutter Instrument Co.P-97
Microloader 移液器吸头Eppendorf North America Inc.930001007
酚红溶液Sigma 生命科学公司P02900.5% 浓度，100 mL
塑料移液管Fisherbrand137119D带刻度，7.5 mL 球形
三卡因甲磺酸盐（MS-222）Western Chemical, Inc.Fisher Scientific - NC0342409100 g
胎牛血清（FBS）HyClone 实验室公司Fisher Scientific - SH3007103500 mL
磷酸盐缓冲液（PBS）Life Technologies 公司旗下 Gibco 品牌1001-023pH 7.4 (1x) - 500 mL
肝素钠盐Sigma-Aldrich210615 - 300 单位小瓶
40 µm 网格滤器Falcon Corning 品牌352340每箱 50 个
台盼蓝Sigma 生命科学公司T815420 mL - 溶液 (0.4%)
Hoechst 33342Life TechnologiesH357010 mL
维拉帕米Sigma 生命科学公司V46291 g
二甲基亚砜（DMSO）Sigma 生命科学公司D8418100 mL
碘化丙啶Life TechnologiesP356610 mL
FACSAria Fusion 细胞分选仪BD 生物科学公司
BD FACSDiva 8.0.1BD 生物科学公司
FlowJo v10.2FlowJo, LLC

参考文献

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