斑马鱼中Myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病侧群细胞的分离

摘要

本文介绍一种从myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）斑马鱼模型中分离侧群细胞的技术。该侧群细胞检测方法具有高灵敏度，虽针对斑马鱼T-ALL描述，但也可适用于其他良性和恶性斑马鱼细胞类型。

摘要

异质性细胞群体（来自正常或恶性组织）可能包含一类具有差异性外排DNA结合染料Hoechst 33342能力的细胞亚群。这类“侧群细胞”在Hoechst 33342染料经紫外（UV）激光激发后，可通过流式细胞术方法进行鉴定。多种细胞类型的侧群中富含具有干细胞或祖细胞特性的细胞。然而，并非所有细胞类型均存在可识别的侧群细胞。 Danio rerio斑马鱼具有强大的 体内 T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的斑马鱼模型已被建立，但目前尚不清楚这些斑马鱼T-ALL是否具有侧群细胞。本文所述方法详细介绍了如何从斑马鱼T-ALL中分离侧群细胞。首先，通过将tol2质粒显微注射至单细胞期胚胎中，诱导斑马鱼产生T-ALL。当肿瘤生长至扩展超过动物体长一半的阶段时，即可收获T-ALL细胞。随后，使用Hoechst 33342对细胞进行染色，并通过流式细胞术检测侧群细胞。该方法在斑马鱼T-ALL研究中具有广泛的应用价值。尽管目前尚未发现可用于确认这些侧群细胞是否具有类似癌症干细胞特性的斑马鱼细胞表面标志物， 体内 功能移植实验是可行的。此外，可应用单细胞转录组学来鉴定这些侧群细胞的遗传特征。

引言

侧群细胞检测利用了某些组织细胞因细胞膜上高表达ATP结合盒（ABC）转运蛋白，从而增强外排DNA结合染料Hoechst 33342的能力。当该染料被紫外激光激发后，可通过双波长流式细胞术分析鉴定出能够外排Hoechst 33342染料的细胞。该检测方法最初用于鉴定小鼠造血干细胞（HSCs）¹，此后已被用于鉴定多种组织和肿瘤中的干细胞/前体细胞群体（参见文献2综述）。然而，并非所有细胞群体都存在侧群细胞，且并非所有侧群细胞群体均富集了干细胞/前体细胞。

斑马鱼是研究人类癌症的一种强大脊椎动物遗传学模型系统^3,4，相较于传统的小鼠癌症模型具有多项优势。斑马鱼胚胎为体外受精且具有光学透明性，便于转基因操作及 体内 观察病理过程，包括癌症的起始与进展。迄今为止，用于检测潜在干细胞或前体细胞的侧群分析法仅在斑马鱼的肾髓中应用以鉴定造血干细胞（HSCs），尚未应用于任何斑马鱼癌症模型^5,6.

斑马鱼T细胞急性淋巴母细胞白血病（T-ALL）模型在形态学和遗传学上与人类T-ALL相似⁷

方案

所有涉及斑马鱼的操作程序均已获得芝加哥大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。芝加哥大学已通过实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）的认证。

1. 在斑马鱼中生成和分离荧光标记的T细胞急性淋巴细胞白血病细胞

1. 向同源型斑马鱼胚胎中进行显微注射
   1. 使用市售试剂盒分离含有可被tol2转座酶识别的反向末端重复序列的环状rag2:c-myc和rag2:绿色荧光蛋白（rag2:GFP）质粒DNA（质粒DNA来源见材料表）¹²，并将DNA洗脱于无菌水中。
      注：本研究使用GFP，但任何荧光蛋白均可适用。
   2. 制备pCS2-转座酶（tol2）RNA
      1. 使用市售试剂盒分离tol2质粒DNA（质粒DNA来源见材料表）¹²，并将DNA洗脱于无菌水中。
      2. 在适当的缓冲液中，将1 µg tol2 DNA与5单位NotI限制性内切酶在37 °C孵育1小时，以线性化质粒。随后在65 °C加热20分钟以灭活NotI酶。
      3. 使用市售RNA转录试剂盒¹³，以SP6 RNA聚合酶对线性化DNA进行tol2 RNA的体外转录。将RNA分装为单次使用量，于-80 °C保存....

结果

为了在斑马鱼中高效产生荧光标记的Myc诱导型T细胞急性淋巴母细胞白血病（T-ALL）肿瘤，可将两侧带有tol2转座酶识别位点的环状DNA构建体与tol2 RNA共同注射。既往将线性化DNA注射入斑马鱼胚胎的研究报道其转基因率为5%⁸。通过调整实验方案，采用tol2介导的转基因技术后，可观察到10%至44%的转基因率（表1）。

在代表性示例中，对一条携带 GFP+ T-ALL 的鱼用 Hoechst 33342 进行染色，以确定侧群细胞所占的比例。图1展示了用于确定侧群细胞百分比的设门策略。首先，利用 FSC 和 SSC 排除碎片，从而分离出 T-ALL 细胞（图1A），随后排除双联体（图1B）。接着，通过选择 GFP+ 且对死细胞鉴别染料 PI 呈阴性的细胞，分离出全部活.......

讨论

侧群细胞检测法具有高度敏感性，因此实验方案的微小变动可能导致难以检测到侧群细胞。首先，染色步骤中的温度因不同动物或细胞体系而异。对于哺乳动物体系，侧群细胞检测通常在 37 °C 下进行²。当将斑马鱼 T-ALL 细胞在 37 °C 下孵育时，大量细胞死亡，因此该孵育温度不可接受（数据未显示）。Kobayashi 及其同事（2008 年）在分离斑马鱼肾脏髓质进行侧群细胞检测时，孵育温度设定为 25 °C⁵。然而，该温度对斑马鱼 T-ALL 细胞并不足够，会导致 Hoechst 33342 染色信号较弱（数据未显示）。在本方案中，28 °C 的孵育温度在维持细胞活力和获得强 Hoechst 33342 信号方面均达到最佳效果。

进行侧群细胞检测时，另一个需要考虑并预先测试的条件是 Hoechst 33342 的浓度。如果 Hoechst 33342 浓度过低，则侧群可能无法显现，或侧群表型（染料外排能力）可能被错误地增强，导致识别出的侧群细胞数量多于实际存在的情况

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
同系型斑马鱼（CG2）			参见 Mizgireuv et al., 2006
rag2:c-myc 质粒			Langenau 实验室
de Jong 实验室构建的 rag2:GFP 质粒			来自 Langenau 实验室的 rag2 启动子
pCS2-转座酶质粒			Chien 实验室
NotI -HF 限制性内切酶	新英格兰生物实验室公司	R3189S	25 µL 中含 500 单位
mMessage Machine SP6 转录试剂盒	Ambion	Thermo Fisher Scientific - AM1340	25 次反应
QIAGEN 质粒中量提取试剂盒	Qiagen 公司	12643
SteREO Discovery V8 显微镜	卡尔·蔡司显微系统公司	495015-0008-000
数字微量注射仪	Tritech Research	MINJ-D
黄铜直臂持针器	Tritech Research	MINJ-4
磁性底座和支架	Tritech Research	MINJ-HBMB
显微操作器	Narishige 国际公司	MN153
玻璃毛细管	Sutter Instrument Co.	B100-50-10	10 cm，无丝
Flaming/Brown 微量移液管拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
Microloader 移液器吸头	Eppendorf North America Inc.	930001007
酚红溶液	Sigma 生命科学公司	P0290	0.5% 浓度，100 mL
塑料移液管	Fisherbrand	137119D	带刻度，7.5 mL 球形
三卡因甲磺酸盐（MS-222）	Western Chemical, Inc.	Fisher Scientific - NC0342409	100 g
胎牛血清（FBS）	HyClone 实验室公司	Fisher Scientific - SH3007103	500 mL
磷酸盐缓冲液（PBS）	Life Technologies 公司旗下 Gibco 品牌	1001-023	pH 7.4 (1x) - 500 mL
肝素钠盐	Sigma-Aldrich	2106	15 - 300 单位小瓶
40 µm 网格滤器	Falcon Corning 品牌	352340	每箱 50 个
台盼蓝	Sigma 生命科学公司	T8154	20 mL - 溶液 (0.4%)
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	10 mL
维拉帕米	Sigma 生命科学公司	V4629	1 g
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma 生命科学公司	D8418	100 mL
碘化丙啶	Life Technologies	P3566	10 mL
FACSAria Fusion 细胞分选仪	BD 生物科学公司
BD FACSDiva 8.0.1	BD 生物科学公司
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC